徐世濤，朱秋勁，胡穎，周國君，朱建榮

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽，550025)2(貴州大學，貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品加工與貯藏重點實驗室，貴州 貴陽，550025)3(遵義醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院，貴州 遵義，563000) 4(貴陽三聯(lián)乳業(yè)有限公司，貴州 貴陽，550025)

酪蛋白(casein, Cas)在牛乳中占牛乳蛋白含量的80%，是一種全價蛋白質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)特性，含人體必需的8種氨基酸，是生物體氨基酸的優(yōu)質(zhì)供給源。同時，酪蛋白具備起泡性、乳化性及凝膠性等多種功能特性。隨著食品工業(yè)的發(fā)展及人們?nèi)找嬖鲩L的需求，酪蛋白在食品工業(yè)的應(yīng)用越發(fā)廣泛。然而，諸如溶解性差等缺點，卻成為影響酪蛋白推廣應(yīng)用的短板[1]，因此，對酪蛋白進行改性的呼聲不斷。蛋白改性方法較多，如利用改變或修飾蛋白結(jié)構(gòu)以改善或加強蛋白功能特性的蛋白質(zhì)改性法[2-3]，應(yīng)用廣泛且效果明顯的化學改性法[4]。而未添加任何化學物質(zhì)的美拉德反應(yīng)糖基化接枝改性蛋白質(zhì)的方法，反應(yīng)條件溫和安全，是一種綠色有效的蛋白質(zhì)改性方法[5-6]，該方法基于Maillard反應(yīng)機理，利用蛋白質(zhì)分子的ε-氨基與糖的還原性末端羰基共價結(jié)合的羰氨縮合反應(yīng)完成對蛋白質(zhì)的改性[1]。

目前關(guān)于蛋白質(zhì)糖基化改性的研究主要集中在植物性蛋白，如大豆蛋白[7]、小麥蛋白[8]、玉米蛋白[9-10]、花生蛋白[3]、大米蛋白[11]等蛋白與葡萄糖，麥芽糊精，葡聚糖等糖的糖基化改性研究。而利用糖基化改性動物蛋白的研究較少，少數(shù)對雞蛋蛋白、乳清蛋白和酪蛋白糖基化改性的研究，則集中在干法糖基化改性，并且都只針對某一種糖與蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)的改性研究，而關(guān)于不同聚合度及結(jié)構(gòu)差異糖類對酪蛋白發(fā)生糖基化接枝改性影響的研究則未見報道。

研究表明，糖作為改性反應(yīng)物，其聚合度及其結(jié)構(gòu)差異會使糖基化反應(yīng)活性存在差異[12]。因此，本實驗根據(jù)聚合度及結(jié)構(gòu)差異選取8種代表性糖，通過分析其接枝及性能差異，探究不同種類糖對酪蛋白發(fā)生糖基化接枝改性的影響。從而為糖基化改性蛋白質(zhì)方法中改性物的選擇提供一定的數(shù)據(jù)支撐，以便酪蛋白糖基化接枝改性工作能夠更好的開展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白、β-環(huán)糊精、鄰苯二甲醛/OPA(CP)、卵磷脂、β-巰基乙醇(≥99.0%)，美國Sigma公司；葡萄糖(分析純)，成都金山化學試劑有限公司；麥芽糖(95%)、D-果糖(99%)，源葉生物公司；葡聚糖20 000/右旋糖酐(生物試劑)、葡聚糖40 000/右旋糖酐40(生物試劑)、十二烷基硫酸鈉、2-硫代巴比妥酸(生物試劑)，國藥集團化學試劑有限公司；乳糖，上海博微生物科技有限公司；麥芽糊精(食品級)，山東西王食品有限公司；大豆油(食品級)，合力超市；甲醇、HCl、FeCl2等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CP214電子分析天平，奧豪斯儀器有限公司；Seven2GoTMpH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇科析儀器有限公司；HJ-6A多頭磁力攪拌器，金壇市文華儀器有限公司；TG16-WS臺式高速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；XHF-DY高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；L5S紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；SB25-12DT超聲清洗器，上海冠特超聲儀器有限公司；CTFD-12S冷凍干燥機，青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司；酶標儀(SpectraMAX190)，美國Molecular Devices公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酪蛋白糖基化處理

準確稱取一定量酪蛋白于pH為7.4的緩沖溶液中攪拌2 h充分溶解，制備質(zhì)量濃度為60 g/L的均一蛋白溶液，按照質(zhì)量比為3∶2加入糖溶解混合后超聲20 min[13-14]。將體系置于90℃恒溫水浴鍋中加熱并攪拌反應(yīng)180 min，結(jié)束后迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)，冷凍干燥得到酪蛋白糖基化改性產(chǎn)物待用。

1.3.2 接枝度測定

接枝度(degree of graft, DG)的測定采用OPA法[15]，精確稱取鄰苯二甲醛(O-Phthalaldehyde)40 mg于1 mL甲醇溶液中，充分溶解后加入2.5 mL 20%(質(zhì)量分數(shù))十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sylfate)，25 mL 0.1 mol/L-1的硼砂溶液和100 μL的β-巰基乙醇混勻后用蒸餾水定容至50 mL的容量瓶中。測定時，取200 μL/mL質(zhì)量濃度為3 g/L的樣品溶液于試管中加入4 mL OPA試劑，同時以蒸餾水代替樣品溶液作空白對照；充分混勻后放置35℃的恒溫水浴鍋中避光反應(yīng)2 min后在340 nm下測定吸光值A(chǔ)340。分別測定酪蛋白與糖糖基化接枝前后的吸光度值分別為A0和At。測定時，以蒸餾水調(diào)零。按照公式(1)計算酪蛋白與糖的接枝度DG：

(1)

式中：DG，接枝度，%；A0，接枝前的吸光度值；At，接枝后的吸光度值。

1.3.3 褐變指數(shù)的測定

參照GU和PIRESTANI等的方法[16-17]略作調(diào)整，取反應(yīng)后的樣品溶液1 mL，加入5 mL 1 g/L SDS稀釋液，混合均勻，在420 nm下測定吸光值A(chǔ)420，以稀釋液作為空白。通過測定美拉德糖基化反應(yīng)產(chǎn)物在420 nm處的吸光度。測定時，以蒸餾水調(diào)零。以吸光度的大小反映美拉德糖基化反應(yīng)的褐變程度。

1.3.4 抗脂質(zhì)氧化能力測定

參照ZHANG等[18]的方法，精確稱取卵磷脂溶解于0.01 mol/L、pH 7.4的磷酸緩沖溶液中配制質(zhì)量濃度為10 g/L的卵磷脂溶液，標記為LLS溶液。精確稱量三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)15 g、2-硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)0.37 g，溶解后加入濃HCl 2 mL，以蒸餾水定容至100 mL，標記為TCA/TBA/HCl。

測定時向試管中依次加入1 mL樣品溶液、1 mL LLS和1 mL 400 μmol/L的FeCl3，同時以蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照，混勻后將體系置于37℃恒溫水浴中水浴60 min后加入2 mL TCA/TBA/HCl溶液混勻，煮沸15 min后取出迅速冷卻，將冷卻后的溶液于8 400 r/min離心10 min，取上清液于532 nm測定其吸光度，樣品組的吸光度記為AS,空白管的吸光度記為AC。測定時，以蒸餾水調(diào)零?？怪|(zhì)氧化能力I按公式(2)計算：

(2)

式中：I，抗脂質(zhì)氧化能力，%；AS，樣品組的吸光度值；AC，空白組的吸光度值。

1.3.5 乳化活性及乳化穩(wěn)定性測定

參照PEARCE的方法[19]，略有改動。將樣品0.6 g溶于15 mL濃度為0.1 mol/L、pH 7.4的磷酸緩沖溶液中,取6 mL于在試管中加入2 mL大豆油，使最終油相體積分數(shù)為25%，以10 000 r/min的高速剪切均質(zhì)分散1 min，因蛋白質(zhì)產(chǎn)生大量泡沫影響精準度，故分別于靜置1、3、6、10、15 min后從乳濁液底部吸取100 μL加入5 mL 0.1%的SDS溶液中，混勻后在500 nm處測定樣品吸光度值，以0.1%的SDS溶液作為空白組。測得吸光度分別記為A1、A3、A6、A10、A15。乳化活性用EAI來表示；乳化穩(wěn)定性用乳化穩(wěn)定指數(shù)ESI表示，分別如公式(3)、(4)計算：

(3)

式中：EAI，每克蛋白質(zhì)的乳化面積，m2/g；T，2.303；A0，起始的吸光值；N，稀釋倍數(shù)，50；φ，體系中油相所占的體積分數(shù)，25%；C，蛋白質(zhì)的濃度，g/mL；L，比色光徑，1 cm。

(4)

式中：ESI，乳化穩(wěn)定性；A0，起始的吸光值；At，t時刻的吸光值；Δt，時間差。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗均同時設(shè)置3組平行，結(jié)果以均值±標準差表示。采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析并進行Duncan多重比較，以顯著性水平為0.05進行差異顯著性分析，以O(shè)rigin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類糖與酪蛋白糖基化接枝度的測定

根據(jù)檢測結(jié)果，經(jīng)分析后對酪蛋白-葡萄糖共價接枝產(chǎn)物(Cas-Glc)、酪蛋白-D-果糖共價接枝產(chǎn)物(Cas-Fru)、酪蛋白-麥芽糊精共價接枝產(chǎn)物(Cas-Md)、酪蛋白-麥芽糖共價接枝產(chǎn)物(Cas-Mal)、酪蛋白-葡聚糖20 000共價接枝產(chǎn)物(Cas-Dex20 000)、酪蛋白-葡聚糖40 000共價接枝產(chǎn)物(Cas-Dex40 000)、酪蛋白-β-環(huán)糊精共價接枝產(chǎn)物(Cas-β-Cd)、酪蛋白-乳糖共價接枝產(chǎn)物(Cas-Lac)的接枝度進行表征，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同種類糖的酪蛋白糖基化產(chǎn)物接枝度Fig.1 Grafting degree of products glycosylation modifiedby casein with different kinds of sugar注：圖中標注不同小寫字母表示樣品間差異顯著(P<0.05)。下同。

相同糖基化接枝條件下，Cas-Glc的接枝度最高，達到(25.03±1.01)%，顯著高于其他7種糖(P<0.05)，其次是Cas-Mal、Cas-Dex20 000、Cas-Dex40 000，接枝度分別為(18.06±1.01)%、(15.27±1.06)%和(13.23±0.65)%；其中，Cas-Dex20 000的接枝度顯著高于Cas-Dex40 000 (P<0.05)。

在醛糖Mal和Glc中，Glc分子量最小，Cas-Dex20 000分子量小于Cas-Dex40 000，可見糖基化接枝度可能與糖的分子量大小密切相關(guān)，有研究報道物質(zhì)的分子量較小，在溶液中的遷移速率更快[7, 20]。糖分子尺寸增大，還原性末端的親電性降低會減小蛋白糖基化速率和程度，因此，相同接枝條件和時間下，糖分子量越小，糖基化程度也就越完全，陳穎佳[12]等人的研究結(jié)果也很好的說明了這一點。然而，同屬于單糖的D-果糖卻未得到如上效果，推測出現(xiàn)這樣的原因很可能與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān)系，因葡萄糖有醛基(-CHO)屬醛糖，而D-果糖含有羰基(-CO-)屬酮糖，不同結(jié)構(gòu)糖糖基化位點選擇不同則糖基化程度也會出現(xiàn)差異，這與施振華[21]等人的研究結(jié)果一致，醛糖的糖基化反應(yīng)高于酮糖。

2.2 不同種類糖與酪蛋白糖基化接枝改性褐變指數(shù)測定

隨著美拉德糖基化接枝反應(yīng)的進行，體系會發(fā)生一定的褐變。反應(yīng)程度越大，褐變也將會隨之加重，褐變程度過高，會影響產(chǎn)物色澤，不利于產(chǎn)品的進一步應(yīng)用。因此接枝進程的控制尤為重要，既要獲得盡可能高的接枝度，同時應(yīng)最大限度地保證產(chǎn)品色澤。實驗酪蛋白加熱前后及與不同種類糖進行糖基化接枝改性后的指數(shù)變化結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同種類糖的酪蛋白糖基化接枝改性產(chǎn)物褐變指數(shù)Fig.2 The browning of products glycosylation modifiedby casein with different kinds of sugar

結(jié)果顯示，酪蛋白加熱后(H-Cas)褐變指數(shù)顯著高于加熱前(NH-Cas)，可見在酪蛋白溶解-加熱這個過程其自身會發(fā)生一定程度的褐變。與H-Cas褐變指數(shù)相比，具有一定接枝度的Cas-Mal、Cas-Dex20 000、Cas-Dex40 000褐變指數(shù)相對較小且差異不顯著(P>0.05)。而具有最好接枝度的Cas-Glc與接枝度較低的Cas-β-Cd之間的褐變指數(shù)差異不顯著(P>0.05)，且顯著高于其他種類糖(P<0.05)，這可能與糖的種類有關(guān)。不同糖的分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)也各有差異，如β-環(huán)糊精由7個D-吡喃葡萄糖基單位，以α-1，4-鍵組合的非還原性環(huán)狀多糖，微溶于冷水和乙醇，不具有還原性末端,而具有一定抗氧化性。由此可得Cas-Mal、Cas-Dex20 000和Cas-Dex40 000在一定程度上能夠滿足有一定接枝度且褐變指數(shù)較低的糖基化產(chǎn)物需求，加之其營養(yǎng)和功能特性，在食品中應(yīng)用前景廣闊。

2.3 不同種類糖與酪蛋白糖基化接枝改性產(chǎn)物抗脂質(zhì)氧化能力測定

卵磷脂常被用作細胞模型來研究體外脂質(zhì)過氧化，是因為卵磷脂中的C-2位上的低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)和極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)的不飽和脂肪酸在鐵離子的催化下發(fā)生過氧化，因此建立以鐵離子誘發(fā)卵磷脂C-2位上的LDL和VLDL、過不飽和脂肪酸的氧化模型，用來評價糖基化產(chǎn)物的抗脂質(zhì)氧化能力[22]。由圖3可知，酪蛋白與不同種類糖進行糖基化接枝所得產(chǎn)物，除Cas-Fru具有促進脂質(zhì)氧化能力外，其他皆具有一定抗脂質(zhì)氧化能力。

圖3 不同種類糖與酪蛋白糖基化改性產(chǎn)物的抗脂質(zhì)氧化能力Fig.3 The anti-lipid oxidation ability of products glycosylation modified by casein with different kinds of sugar

這是由于果糖在體外比葡萄糖更具活性，能產(chǎn)生更高水平的自動氧化。這與SEMCHYSHYN等[23]的研究結(jié)果一致。Cas-Glc抗脂質(zhì)氧化能力顯著低于其他糖類(P<0.05)，這可能與其分子質(zhì)量較小、難以形成穩(wěn)定的抗脂質(zhì)氧化物質(zhì)有關(guān)[20]。而分子質(zhì)量較大的Cas-Dex20 000、Cas-Dex40 000、Cas-β-Cd、Cas-Md等的抗脂質(zhì)氧化能力不存在顯著性差異(P>0.05)，且具有較強的抗脂質(zhì)氧化能力。而接枝度較低的Cas-β-Cd因β-環(huán)糊精本身具有一定的抗氧化特性，而表現(xiàn)出較高抗脂質(zhì)氧化能力。可見，糖基化產(chǎn)物能夠一定程度上抑制Fe2+引發(fā)的卵磷脂分散體系過氧化。

2.4 不同種類與酪蛋白糖基化接枝改性產(chǎn)物乳化活性及乳化穩(wěn)定性測定

乳化活性指的是蛋白參與乳濁液形成的能力。乳化穩(wěn)定性指的是乳濁液保持分散，保持在一定時間內(nèi)沒有發(fā)生油脂上浮、聚沉或者絮凝的能力。在蛋白質(zhì)糖基化接枝改性中，糖的種類，不但會影響糖基化反應(yīng)的程度，還會影響糖基化產(chǎn)物的性能[11, 24]。酪蛋白與不同糖發(fā)生美拉德糖基化接枝的產(chǎn)物乳化活性及乳化穩(wěn)定性情況及顯著性差異分析如表1和表2所示。

表1 酪蛋白與糖糖基化接枝改性產(chǎn)物靜置1～15min的乳化活性(EAI)的差異性分析Table 1 The difference analysis of emulsified active EAI between casein and glycosylation graft modified products for 1-15 min

注：結(jié)果表示為均值±標準差；同一列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

由表1可知，與H-Cas相比，酪蛋白糖基化接枝改性產(chǎn)物的乳化活性均得到不同程度的改善或提高。其中Cas-Dex40 000、Cas-Dex20 000和Cas-Mal，分別顯著(P<0.05)提高了52.05%、42.47%和30.14%。酪蛋白糖基化接枝處理能夠在一定程度上改善或提高其乳化活性，這可能是蛋白糖基化共價接枝后，引入多糖使其原有緊密的蛋白結(jié)構(gòu)被不同程度破壞，同時引入了糖鏈上的親水基團，使蛋白溶解性增加[25]，蛋白能夠充分舒展開，暴露更多疏水基團，二級結(jié)構(gòu)更加有序，在離子液體中具有更大的流體動力學半徑，能有效吸附到油—水界面，降低了界面張力,利于乳化活性提高[26-27]。而接枝度較高的Cas-Glc卻未見較好的乳化活性。這可能與糖自身性質(zhì)和較大接枝度引入了更多親水基團，影響對油-水界面的平衡，從而使其乳化活性降低[28]等因素有關(guān)。

同時，隨靜置時間的延長，乳濁液乳化活性都出現(xiàn)不同程度的下降。在靜置15 min內(nèi)H-Cas、Cas-β-Cd、Cas-Fru、Cas-Glc呈線性下降，擬合方程為：EAI=-0.023 4t+0.740 2(R2=0.934 6)，而其他糖類與酪蛋白糖基化產(chǎn)物呈現(xiàn)階段性、間歇式下降；直到靜置15min時，H-Cas、Cas-Glc、Cas-β-Cd、Cas-Md及Cas-Lac的乳化活性不存在顯著性差異(P>0.05)，相對其他較低。

表2 酪蛋白糖基化接枝改性產(chǎn)物在不同時間段的乳化穩(wěn)定性情況Table 2 The emulsification stability of casein glycosylation graft modified products at different time periods

由表2知，酪蛋白糖基化產(chǎn)物乳濁液靜置15 min后，接枝產(chǎn)物乳化穩(wěn)定性由高到低依次為Cas-Dex40 000、Cas-Dex20 000、Cas-Mal、Cas-Fru和Cas-Glc。其中Cas-Lac雖然有效提高了其乳化活性，但乳化穩(wěn)定性卻有所下降，這與張亞婷[29]的研究結(jié)果一致。而分子質(zhì)量較大的Cas-Dex40 000表現(xiàn)出良好的乳化活性及乳化穩(wěn)定性。其乳化穩(wěn)定性較H-Cas顯著提高了85.91%(P<0.05)，且顯著高于其他接枝產(chǎn)物(P<0.05)。蛋白糖基化接枝反應(yīng)后能夠顯著提高乳化穩(wěn)定性，主要是因為兩方面原因，一是因為糖類物質(zhì)在油-水乳化體系中一定程度能夠增加水相的黏度[30]。另一個就是，蛋白表面共價接枝的糖分子的空間位阻作用會使乳化劑形成的保護膜厚度增加，從而有利于乳化體系的穩(wěn)定性[31]。與酪蛋白糖基化接枝的葡聚糖分子量越大，越有利于提高空間位阻效應(yīng)，故Cas-Dex40 000表現(xiàn)出良好的乳化活性及乳化穩(wěn)定性。而分子質(zhì)量較小的糖類較分子質(zhì)量大的糖類乳化穩(wěn)定性較低，這可能是因為其與酪蛋白糖基化不能夠提供足夠的穩(wěn)定作用[32]。

3 結(jié)論

利用濕法糖基化的改性方法，將酪蛋白分別與不同聚合度和結(jié)構(gòu)差異的葡萄糖、D-果糖、麥芽糖、葡聚糖20 000、葡聚糖40 000、乳糖、麥芽糊精、β-環(huán)糊精8種糖進行糖基化共價接枝改性，探究酪蛋白與糖共價接枝改性后各特征指標的變化情況。接枝度測定結(jié)果表明醛糖中分子量較小的葡萄糖與酪蛋白共價接枝度最高。酪蛋白糖基化接枝改性產(chǎn)物的抗脂質(zhì)氧化能力檢測發(fā)現(xiàn)，接枝物Cas-Mal、Cas-Dex20 000和Cas-Dex40 000抗脂質(zhì)氧化能力較好；乳化性及乳化穩(wěn)定性考察發(fā)現(xiàn)，酪蛋白糖基化接枝改性后乳化活性得到不同程度提高，其中Cas-Dex40 000的乳化性較H-Cas顯著提高了85.91%(P<0.05)，顯著高于其他糖類接枝化產(chǎn)物。在靜置15 min內(nèi)，H-Cas、Cas-β-Cd、Cas-Fru、Cas-Glc的乳化活性呈線性下降，擬合方程為：EAI=-0.023 4t+0.740 2(R2=0.934 6)。

綜上所述，在不同聚合度和結(jié)構(gòu)差異糖中，分子質(zhì)量較大的酪蛋白與葡聚糖20 000、葡聚糖40 000和麥芽糖美拉德糖基化共價接枝改性后具有一定的接枝度，且有良好的抗脂質(zhì)氧化能力和乳化能力及乳化穩(wěn)定性；在單糖中，屬醛糖的葡萄糖與酪蛋白接枝情況明顯優(yōu)于屬酮糖的果糖。酪蛋白糖基化共價接枝改性條件要求不高，可操作性強。酪蛋白及麥芽糖的原料來源非常廣泛，并且具有特殊營養(yǎng)價值。實驗結(jié)果為糖基化改性蛋白質(zhì)方法中原料糖的選擇和復(fù)配提供一定的數(shù)據(jù)支撐，以便酪蛋白糖基化接枝改性工作能夠更好的開展。同時對酪蛋白與糖的營養(yǎng)價值提升及在食品領(lǐng)域中的開發(fā)應(yīng)用有積極的影響。