陳自泓， 黃可兒

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州白云山星珠藥業(yè)有限公司，廣東廣州510931；3.東莞廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院，廣東東莞 523808）

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge．的干燥根。其性甘，微溫，歸脾、肺經(jīng)，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌的功效[1]。傳統(tǒng)水提法對(duì)黃芪有效成分的獲得率存在一定的局限性。而半仿生提?。⊿BE）法的提取過(guò)程模仿藥物口服給藥后在胃腸道中的運(yùn)動(dòng)、分解、吸收的過(guò)程，采用選定pH的模擬胃腸液，依次連續(xù)提取，得到中藥材中目標(biāo)成分含量高的活性混合物，既重視單體成分，又注重中藥混合物成分的整體作用，能盡量多地保留有效成分，更符合中藥在體內(nèi)代謝和發(fā)揮藥效作用的過(guò)程[2，3]。本研究以黃芪總多糖提取率、總皂苷提取率、提取收率作為綜合評(píng)判指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選半仿生提取法模擬胃腸液的工藝條件，并與傳統(tǒng)水提法進(jìn)行比較，以期為黃芪多糖工業(yè)化生產(chǎn)提供理論數(shù)據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑黃芪經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定研究室張丹雁教授鑒定為蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge var.mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根。將黃芪切小段，60℃低溫干燥，粉碎過(guò)80目篩，備用。D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：201707）、黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)：201717），均為中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；氯化鈉（批號(hào)：20190105）、磷酸二氫鉀（批號(hào)：20130901-1）、濃硫酸（批號(hào)：20190303）、氫氧化鈉（批號(hào)：20190228）、濃鹽酸（批號(hào)：20120106-1）、苯酚（批號(hào)：20100902-1）、95%乙醇（批號(hào)：20190301）、正丁醇（批號(hào)：20190202）、三氯甲烷（批號(hào)：20190301）均為廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。

1.2儀器TC-15恒溫電熱表（海寧市華星儀器廠）；SHA-B恒溫震蕩器（常州澳華儀器有限公司）；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；LXJ-IIB低速離心機(jī)（上海安寧科學(xué)儀器廠）；XHDLSB-1D/2D低溫冷卻循環(huán)泵（上海霄漢實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；METTLER TOLEDO XP26電子天平、BS 224S（萬(wàn)分之一）電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；Varian CARY-1E紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

1.3模擬胃液、模擬腸液的配制[4]模擬胃液配制：蒸餾水中加入2.0 g氯化鈉和7 mL鹽酸，再加入適量蒸餾水定容至1 L。模擬腸液配制：6.8 g磷酸二氫鉀溶于250 mL蒸餾水中，再加入0.2 mol/L氫氧化鈉溶液77 mL和500 mL蒸餾水，用0.2 mol/L氫氧化鈉溶液或0.2 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH為（6.8±0.1），加蒸餾水定容至1 L。

1.4方法

1.4.1 正交設(shè)計(jì)L9（34）試驗(yàn)設(shè)計(jì) 為保障試驗(yàn)的重復(fù)性與可比性，在黃芪藥材前處理的工藝、模擬胃液、模擬腸液、過(guò)濾等條件相同的前提下，使用L9（34）正交設(shè)計(jì)表，確定了考察的主要因素及水平，見(jiàn)表1。

表1 模擬胃液和腸液正交設(shè)計(jì)的水平設(shè)置表Table 1 The orthogonaldesign table for the stimulated gastric and intestinal juice

1.4.2 供試液的制備 精密稱取蒙古黃芪粉末4.0 g，溶解于模擬胃液和腸液中，按照表1的參數(shù)提取，分別得到模擬腸液及模擬腸液提取液。過(guò)濾，取續(xù)濾液30 mL，備用。

1.4.3 水提取法的樣品溶液制備[5]取黃芪粉末2.0 g，精密稱定，加水16 mL，100℃水浴1.5 h，提取3次。過(guò)濾，合并濾液，取續(xù)濾液30 mL，備用。

1.4.4 總多糖含量測(cè)定 以D-葡萄糖為對(duì)照品，采用苯酚—硫酸法顯色，在檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度[4]。以吸光度Y為縱坐標(biāo)、以D-葡萄糖濃度X[ρ/（mg·mL-1）]為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y=14.469 0X-0.020 8，r=0.999 4。結(jié)果表明在0.01～0.075 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密量取模擬胃液及模擬腸液供試液2.0 mL，置25 mL量瓶中，按上述方法顯色，并于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總多糖含量。

1.4.5 總皂苷的含量測(cè)定[6]以黃芪甲苷為對(duì)照品，采用香草醛—硫酸法顯示，在檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度Y為縱坐標(biāo)、以總皂苷濃度X[ρ/（mg·mL-1）]為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y=13.163 0X+0.086 5，r=0.997 7。結(jié)果表明在0.005～0.045 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密量取模擬胃液和模擬腸液供試品1 mL，以甲醇稀釋至適合的濃度后，按上述方法顯色，于450 nm處測(cè)定吸收度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定總皂苷含量。

1.4.6 提取收率的測(cè)定 精密量取模擬胃液及模擬腸液樣品溶液各10 mL，置已烘干恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃烘3 h，置干燥器內(nèi)冷卻40 min，迅速精密稱質(zhì)量并計(jì)算，以干固物百分比（%）計(jì)算提取收率。提取收率=（M2-M1）/[M樣×（1-水分%）]×稀釋位數(shù)×100%。M2指有樣品的蒸發(fā)皿干燥恒質(zhì)量后的質(zhì)量（g）；M1指蒸發(fā)皿恒質(zhì)量后質(zhì)量（g）；M樣指藥材粉末樣品的質(zhì)量（g）。

1.4.7 數(shù)據(jù)分析 采用Microsoft office Excel 2000軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀分析、方差分析和加權(quán)分析，根據(jù)自由度v1=1，v2=4，查F界值表，F(xiàn)＞7.71，P＜0.05。設(shè)計(jì)總多糖提取率（w/%）、總皂苷提取率（w/%）、提取收率（w/%）按照30%、30%、40%進(jìn)行加權(quán)分析。

2 結(jié)果

2.1在模擬胃液條件下應(yīng)用L9（34）正交設(shè)計(jì)考察黃芪總多糖提取率、總皂苷提取率和提取收率

2.1.1 直觀分析和方差分析 綜合模擬胃液條件下黃芪總多糖提取率的直觀分析和方差分析結(jié)果見(jiàn)表2、表3。直觀分析結(jié)果顯示，總多糖提取率的最佳工藝為A3B3C3，其中提取溫度起主要作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。方差分析結(jié)果顯示，對(duì)優(yōu)化提取工藝的貢獻(xiàn)度（F值）由大到小依次是提取溫度（22.6）＞料液比（3.85）＞提取時(shí)間（0.10）。

綜合模擬胃液條件下黃芪總皂苷提取率的直觀分析和方差分析結(jié)果見(jiàn)表2、表4。直觀分析結(jié)果顯示，總皂苷提取率的最佳工藝為A3B3C3，其中料液比和提取溫度起主要作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。方差分析結(jié)果顯示，對(duì)優(yōu)化提取工藝的貢獻(xiàn)度（F值）由大到小依次是提取溫度（17.5）＞料液比（16.0）＞提取時(shí)間（0.3）。

綜合模擬胃液條件下黃芪提取收率的直觀分析和方差分析結(jié)果見(jiàn)表2、表5。直觀分析結(jié)果顯示，提取收率的最佳工藝為A3B3C3，其中料液比和提取溫度起主要作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。方差分析結(jié)果顯示，對(duì)優(yōu)化提取工藝的貢獻(xiàn)度（F值）由大到小依次是提取溫度（42.1）＞料液比（17.0）＞提取時(shí)間（3.46）。

2.1.2 貢獻(xiàn)度加權(quán)分析 貢獻(xiàn)度加權(quán)分析結(jié)果顯示，加權(quán)后貢獻(xiàn)度由大到小依次是提取溫度（28.9）＞料液比（12.8）＞提取時(shí)間（1.5）。其中：料液比和提取溫度起主要作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；提取時(shí)間作用次之，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表6。

2.2在模擬腸液條件下應(yīng)用L9（34）正交設(shè)計(jì)考察黃芪總多糖提取率、總皂苷提取率和提取收率

2.2.1 直觀分析和方差分析 綜合模擬腸液條件下黃芪總多糖提取率的直觀分析和方差分析結(jié)果見(jiàn)表7、表8。直觀分析結(jié)果顯示，總多糖提取率的最佳工藝為A3B3C2，其中料液比和提取溫度起主要作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。方差分析結(jié)果顯示，對(duì)優(yōu)化提取工藝的貢獻(xiàn)度（F值）由大到小依次是料液比（72.0）＞提取溫度（16.5）＞提取時(shí)間（6.0）。

綜合模擬腸液條件下黃芪總皂苷提取率的直觀分析和方差分析結(jié)果見(jiàn)表7、表9。直觀分析結(jié)果顯示，總皂苷提取率的最佳工藝為A2B3C1，其中提取溫度起主要作用，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。方差分析結(jié)果顯示，對(duì)優(yōu)化提取工藝貢獻(xiàn)度（F值）由大到小依次是提取溫度（5.28）＞提取時(shí)間（4.0）＞料液比（1.0）。

綜合模擬腸液條件下黃芪提取收率的直觀分析和方差分析結(jié)果見(jiàn)表7、表10。直觀分析結(jié)果顯示，提取收率的最佳工藝為A3B3C3，其中料液比和提取溫度起主要作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。方差分析結(jié)果顯示，對(duì)優(yōu)化提取工藝貢獻(xiàn)度（F值）由大到小依次是料液比（69.3）＞提取溫度（15.6）＞提取時(shí)間（2.4）。

表2 在模擬胃液條件下L9（34）正交設(shè)計(jì)直觀分析表Table 2 The intuitive analysis results of L9（34）orthogonaldesign under the simulated gastric juice conditions

表3 在模擬胃液條件下黃芪總多糖提取率（w/%）的方差分析表Table 3 The variance analysis results of extraction rate of totalpolysaccharide from Radix Astragali（w/%）under the simulated gastric juice conditions

表4 在模擬胃液條件下黃芪總皂苷提取率（w/%）的方差分析表Table 4 The variance analysis results of extraction rate of totalsaponins from Radix Astragali（w/%）under the simulated gastric juice conditions

2.2.2 貢獻(xiàn)度加權(quán)分析 貢獻(xiàn)度加權(quán)分析結(jié)果顯示，加權(quán)后貢獻(xiàn)度由大到小依次是料液比（49.6）＞提取溫度（12.8）＞提取時(shí)間（4.0）。其中：料液比、提取溫度起主要作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；提取時(shí)間作用次之，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表11。

2.3半仿生提取法與傳統(tǒng)水提法的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，半仿生提取法總多糖含量、提取收率較水提法顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表5 在模擬胃液條件下黃芪提取收率（w/%）的方差分析表Table 5 The variance analysis results of extraction yield of Radix Astragali（w/%）under the simulated gastric juice conditions

表6 在模擬胃液條件下三因素貢獻(xiàn)度的加權(quán)分析Table 6 The weighted analysis results of three factor contribution under the simulated gastric juice conditions

表7 在模擬腸液條件下黃芪提取工藝L9（34）正交設(shè)計(jì)的直觀分析表Table 7 The intuitive analysis results of L9（34）orthogonal design under the simulated intestinaljuice conditions

3 討論

半仿生提取法以一種或幾種有效成分、總提取物等作為指標(biāo)，用選定pH的酸性水、中性水和堿性水依次連續(xù)提取，可充分發(fā)揮混合物成分的綜合作用特點(diǎn)，又有利于單體成分控制制劑質(zhì)量。料液比、提取溫度、提取時(shí)間等都對(duì)半仿生提取法的提取效果具有一定影響。正交設(shè)計(jì)法是利用正交表的“均勻分布、整齊可比”的特點(diǎn)使每次實(shí)驗(yàn)的因素和水平得到合理的安排，從而通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析獲得較全面的信息，找出各因素的主次地位[7]。本研究采用L9（34）正交設(shè)計(jì)表對(duì)半仿生提取法的影響因素（料液比、提取溫度、提取時(shí)間）進(jìn)行工藝優(yōu)化研究，對(duì)總多糖提取率、總皂苷提取率、提取收率等多指標(biāo)進(jìn)行綜合分析以優(yōu)化半仿生的提取工藝。

表8 在模擬腸液條件下黃芪總多糖提取率（w/%）的方差分析表Table 8 The variance analysis results of extraction rate of totalpolysaccharide from Radix Astragali（w/%）under the simulated intestinaljuice conditions

表9 在模擬腸液條件下黃芪總皂苷提取率（w/%）的方差分析表Table 9 The variance analysis results of extraction rate of totalsaponins from Radix Astragali（w/%）under the simulated intestinaljuice conditions

表10 在模擬腸液條件下黃芪提取收率（w/%）的方差分析表Table 10 The variance analysis results of extraction yield of Radix Astragali（w/%）under the simulated intestinaljuice conditions

表11 在模擬腸液條件下三因素貢獻(xiàn)度的加權(quán)分析Table 11 The weighted analysis results of three factor contribution under the simulated intestinal juice conditions

表12 半仿生提取法與傳統(tǒng)水提法總多糖含量、總皂苷含量以及提取收率比較Table 12 Comparison of total polysaccharide content，totalsaponin content and extraction yield between semi-bionic extraction method and water extraction method （s）

表12 半仿生提取法與傳統(tǒng)水提法總多糖含量、總皂苷含量以及提取收率比較Table 12 Comparison of total polysaccharide content，totalsaponin content and extraction yield between semi-bionic extraction method and water extraction method （s）

①P＜0.01，與水提法比較

方法水提法半仿生提取法提取收率（w/%）50.04±2.10 75.10±1.93①n 6 6總多糖含量（w/%）30.51±1.13 44.20±1.73①總皂苷含量（w/%）0.052±0.007 0.045±0.010

本研究結(jié)果顯示：以黃芪總多糖提取率（w/%）、總皂苷提取率（w/%）、提取收率（w/%）作為指標(biāo)，在模擬胃液提取條件下，加權(quán)后貢獻(xiàn)度由大到小依次是提取溫度（28.9）＞料液比（12.8）＞提取時(shí)間（1.5）。其中：料液比和提取溫度起主要作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；提取時(shí)間作用次之，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在模擬腸液提取條件下，加權(quán)后貢獻(xiàn)度由大到小依次是料液比（49.6）＞提取溫度（12.8）＞提取時(shí)間（4.0）。其中：料液比和提取溫度起主要作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；提取時(shí)間作用次之，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

綜合以上研究結(jié)果得出，提取時(shí)間對(duì)黃芪總多糖提取率、總皂苷提取率、提取收率等3個(gè)指標(biāo)的影響均不大，從經(jīng)濟(jì)效益的角度出發(fā)，可以考慮料液比為1∶30，提取溫度為100℃，提取時(shí)間為1 h。半仿生提取法優(yōu)選工藝黃芪總多糖提取率、提取收率等2個(gè)指標(biāo)明顯優(yōu)于傳統(tǒng)水提法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

半仿生提取法與傳統(tǒng)水提法的區(qū)別主要在于提取溶劑。半仿生提取法使用酸性溶劑或堿性溶劑進(jìn)行提取，目前工業(yè)產(chǎn)業(yè)化已有使用耐酸耐堿的提取設(shè)備如搪瓷提取罐對(duì)中藥有效成分進(jìn)行酸提或堿提，因此半仿生提取法產(chǎn)業(yè)化已具備技術(shù)可行性。另外，從經(jīng)濟(jì)效益角度分析，半仿生提取法的黃芪總多糖總提取率及得率均優(yōu)于傳統(tǒng)水提法，采用半仿生提取法提取黃芪總多糖可在一定程度上降低原材料成本。