張玲， 林素財(cái)， 鄭永平

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山市中醫(yī)院皮膚科，廣東中山 528400）

慢性濕疹是一種炎癥性皮膚病，由多種因素引起，可以持續(xù)數(shù)月、數(shù)年甚至數(shù)十年，主要表現(xiàn)為明顯的瘙癢、滲出、水腫，高復(fù)發(fā)[1]。目前仍缺乏有效的治療方法[2]。傳統(tǒng)治療方法如口服抗組胺藥、免疫抑制劑、外用皮質(zhì)類固醇等都易使病情反復(fù)發(fā)作。物理治療如液氮冷凍、二氧化碳激光、使用同位素和釋放淺層X線等的有效性和安全性都難以令人滿意，其應(yīng)用也因此受到限制。膚悅康洗劑作為中藥制劑，臨床上在治療急性和亞急性濕疹方面具有較好效果[3]，然而膚悅康洗劑在治療濕疹方面的作用機(jī)制尚未明確。

自1951年開始將豚鼠模型作為一種可靠的醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型在皮膚病學(xué)中使用[4]。2，4-二硝基氯苯（DNCB）誘導(dǎo)的皮膚刺激模型與濕疹在病因、臨床表現(xiàn)和病理變化等方面有許多相似之處[5]。故本研究選用DNCB誘發(fā)制備豚鼠濕疹模型。本課題組既往實(shí)驗(yàn)表明，DNCB誘導(dǎo)的豚鼠濕疹皮膚組織病理檢查見不同程度的表皮細(xì)胞變性，真皮有不同程度的血管擴(kuò)張、充血和水腫以及大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，濃度不小于1.2 g/mL的膚悅康洗劑可有效改善該皮損病理改變[6]。為進(jìn)一步探討膚悅康洗劑對(duì)豚鼠濕疹的抗炎作用，本研究以DNCB豚鼠濕疹模型為研究對(duì)象，觀察其對(duì)豚鼠濕疹皮膚組織細(xì)胞因子的影響，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雌性Hartley豚鼠36只，體質(zhì)量200～240 g，4～5周齡，由廣東實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2016-0041]。實(shí)驗(yàn)于中山市中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室[使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2015-0109]（屏障環(huán)境）完成。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中執(zhí)行3R原則，IACUC編號(hào)：20160513024654。

1.2藥物膚悅康洗劑（主要組成：苦參20 g、土槿皮20 g、廣東紫荊皮10 g、蘆薈5 g、石菖蒲5 g、麻黃5 g等）由中山市中醫(yī)院制劑室提供；哈西奈德溶液（天津市天驕制藥有限公司，CAS號(hào)：H12020342）。

1.3試劑與儀器DNCB（美國(guó)Sigma公司，CAS號(hào)：528-76-7）；丙酮（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，CAS：67-64-1）；硫化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，CAS號(hào)：1313-84-4）；抗干擾素γ（IFN-γ）抗體（美國(guó)CST公司）；抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）抗體（美國(guó)Abcam公司）；TRIzol Reagent（美國(guó)Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；中強(qiáng)度RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光液（杭州弗德生物科技有限公司）；5×蛋白上樣緩沖液（武漢博士德有限公司）；脫脂奶粉（BD）、吐溫-20（上海阿拉丁生化科技有限公司）。ST16高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司）；DG5031多功能酶標(biāo)儀（華東電子有限公司）；XMTD204水浴鍋（常州智博儀器制造有限公司）；MF113W掃描儀（日本Canon公司）。

1.4分組、造模與給藥將36只豚鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，哈西奈德組，膚悅康洗劑低、中、高劑量組，每組6只。按照文獻(xiàn)[7]復(fù)制豚鼠濕疹模型。給予豚鼠20 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，應(yīng)用80 g/L硫化鈉溶液在豚鼠背部面積為4 cm×3 cm的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行脫毛，使皮膚暴露。將50μL生理鹽水涂抹于對(duì)照組已脫毛的區(qū)域。將丙酮與橄欖油以1∶4比例加入DNCB中混合制成50 g/L和5.0 g/L的DNCB丙酮溶液，將50μL 50 g/L DNCB丙酮溶液涂抹于模型組，哈西奈德組，膚悅康洗劑低、中、高劑量組的脫毛區(qū)。1周后進(jìn)行治療。正常組：100μL生理鹽水涂抹于脫毛區(qū)，每周1次，連續(xù)3周。模型組：100μL 5.0 g/L DNCB丙酮溶液涂抹于脫毛區(qū)，每周1次，共3次；每天2次用生理鹽水浸濕的布敷于豚鼠的脫毛區(qū)，15 min后將布拿掉。哈西奈德組：100μL 5.0 g/L DNCB丙酮溶液涂抹于脫毛區(qū)，每周1次，共3次；每天2次用浸泡過0.1%哈西奈德溶液的布外敷，15 min后拿掉濕布。膚悅康洗劑低、中、高劑量組：100μL 5.0 g/L DNCB丙酮溶液涂抹于脫毛區(qū)，每周1次，共3次；每天2次將浸泡過含有1.2、2.4、3.6 g/mL的膚悅康洗劑的布敷于豚鼠脫毛區(qū)，15 min后拿掉濕布。治療21 d后，對(duì)傷口的紅斑、水腫和抓痕進(jìn)行評(píng)分，并收集背部皮膚組織用于分析。

1.5觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 觀察皮損情況及計(jì)算療效指數(shù) 觀察豚鼠紅斑、水腫、抓痕等皮損情況，并計(jì)分。紅斑：無，計(jì)0分；輕微，計(jì)1分；輕度紅斑無結(jié)痂，計(jì)2分；中度紅斑伴輕度至中度結(jié)痂，計(jì)3分；重度結(jié)痂伴明顯的紅斑，計(jì)4分。水腫：無，計(jì)0分；輕微，計(jì)1分；中等和嚴(yán)重，計(jì)2分。抓痕：無，計(jì)0分；有，計(jì)1分。療效指數(shù)=（治療前積分-治療后積分）/治療前積分×100%[6，7]。

1.5.2 定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）法檢測(cè)白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-4、IL-17、IL-31、IFN-γ、TGF-β1 mRNA表達(dá)水平 抽提總RNA，定量，逆轉(zhuǎn)錄。各取2μL PCR上游引物和下游引物（具體信息見表1）、2μL模板DNA、0.4μL的50×熒光定量PCR參比染料和3.6μL雙蒸水配成10μL的PCR反應(yīng)體系，按照如下反應(yīng)程序進(jìn)行：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸35 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后進(jìn)行檢測(cè)。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.5.3 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)豚鼠皮膚組織中IFN-γ和TGF-β1的蛋白水平 將豚鼠皮膚組織完全剪切后放入超聲波細(xì)胞破碎儀中進(jìn)行破碎，加入RIPA和PMSF裂解緩沖液。于4℃18 000 r/min離心60 min后棄去上清。將定量蛋白質(zhì)與樣品緩沖液以1∶1的比例混合，（100±4）℃煮10 min。通過10%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，其中，濃縮凝膠的電壓為75 V，分離凝膠為120 V。之后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜用5%BSA封閉1 h，加入一抗（抗IFN-γ抗體/抗TGF-β1抗體，兔/小鼠，1∶1 000）4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10 min，然后在室溫下加入二抗孵育1 h。用TBST再次洗滌后，將膜放入暗箱中進(jìn)行曝光，通過FluorChem M測(cè)定目的蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平（p），內(nèi)參為β-actin。

1.6統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，多組比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1治療21 d后各組豚鼠濕疹的皮損情況治療21 d后，模型組表現(xiàn)出明顯的濕疹反應(yīng)，其特征為彌漫性紅斑，邊界不清，水腫，血痂及抓痕，背部出現(xiàn)粟粒狀丘疹，類似于人類濕疹的臨床表現(xiàn)；哈西奈德組背部有輕微紅斑，水腫，少量抓痕和結(jié)痂的現(xiàn)象；膚悅康洗劑高劑量組與哈西奈德組顯示出相似的治療作用；膚悅康洗劑低、中劑量組治療效果不明顯。見圖1。

2.2各組療效指標(biāo)比較圖2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組療效指數(shù)降低（P＜0.05）。與模型組比較，膚悅康洗劑中、高劑量組和哈西奈德組療效指數(shù)升高（P＜0.01或P＜0.001），且膚悅康洗劑的作用效果呈劑量依賴性。

2.3各組豚鼠皮膚組織IL-2、IL-4、IL-17、IL-31、IFN-γ、TGF-β1 mRNA表達(dá)比較圖3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組豚鼠皮膚組織IL-4、IL-17、IL-31、TGF-β1 mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05），IL-2、IFN-γmRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，膚悅康洗劑低、中、高劑量組和哈西奈德組豚鼠皮膚組織IL-4、IL-17、IL-31、TGF-β1 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.001），IFN-γmRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001），膚悅康洗劑高劑量組IL-2 mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.001），且膚悅康洗劑的作用效果呈劑量依賴性。

2.4各組豚鼠皮膚組織IFN-γ、TGF-β1蛋白表達(dá)比較圖4結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組豚鼠皮膚組織IFN-γ蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），TGF-β1蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，膚悅康洗劑低、中、高劑量組及哈西奈德組皮膚組織IFN-γ蛋白表達(dá)水平升高（除膚悅康洗劑低劑量組，P＜0.01或P＜0.001），TGF-β1蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01或P＜0.001），且膚悅康洗劑的作用效果呈劑量依賴性。

圖1 治療21 d后各組豚鼠濕疹的皮損情況Figure 1 Comparison of the skin lesions of guinea pigs with eczema in various groups after 21-day treatment

圖2 各組療效指數(shù)比較Figure 2 Comparison of the curative efficacy index in various groups（s）

圖3 各組皮膚組織IL-2、IL-4、IL-17、IL-31、IFN-γ、TGF-β1 mRNA表達(dá)比較Figure 3 Comparison of the mRNA expression levels of IL-2，IL-4，IL-17，IL-31，IFN-γand TGF-β1 in skin tissues of various groups（s，n=3）

圖4 各組皮膚組織IFN-γ和TGF-β1蛋白表達(dá)比較Figure 4 Comparison of the mRNA expression levels of IFN-γand TGF-β1 in skin tissues of various groups（-x±s，n=3）

3 討論

濕疹是一種過敏性皮膚病，病因復(fù)雜，其特征是反復(fù)發(fā)作，有明顯瘙癢和多形性病變[8]。其病因主要是致敏物質(zhì)的敏化特性和宿主對(duì)外源性過敏原的反應(yīng)[9]。有證據(jù)表明，濕疹是一種與免疫調(diào)節(jié)障礙有關(guān)的疾病，濕疹患者的皮膚炎癥因子表達(dá)量明顯高于正常人，其中，CD4+T輔助T（Th）細(xì)胞在免疫疾病中發(fā)揮重要作用[10]。各種促炎細(xì)胞因子刺激抗原呈遞細(xì)胞（APC），然后將初始T細(xì)胞極化 為Th1、Th2、Th17[11，12]。Th1細(xì)胞 分 泌IL-2、IFN-γ、TNF-β1及其他細(xì)胞因子[13，14]，Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等細(xì)胞因子[15，16]，主要介導(dǎo)體液免疫。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)濕疹患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能下降或受損會(huì)減弱對(duì)Th2細(xì)胞的抑制作用，Th1/Th2漂移是濕疹發(fā)病和復(fù)發(fā)的主要機(jī)制[17]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞及相關(guān)的細(xì)胞因子IL-17/IL-23參與了濕疹的發(fā)病，并且影響著疾病的嚴(yán)重程度，IL-31作為新發(fā)現(xiàn)的與皮膚慢性炎癥和瘙癢相關(guān)的細(xì)胞因子，在特應(yīng)性皮炎患者中的表達(dá)也有升高的趨勢(shì)。TGF-β在細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)方面有著重要的作用，能夠抑制絲裂原、同種異體抗原刺激的免疫系統(tǒng)中T細(xì)胞的增殖[18-20]。

濕疹作為一種慢性皮膚病，在常規(guī)治療中長(zhǎng)期使用激素，這種治療方法會(huì)產(chǎn)生一系列副作用[21，22]，如耐藥性、皮膚角質(zhì)層變薄、毛細(xì)血管擴(kuò)張等。因此尋找一種療效好而副作用少的治療方法是目前治療濕疹的新方向，膚悅康洗劑中含有許多具有免疫調(diào)節(jié)作用的中草藥成分，從中醫(yī)理論或現(xiàn)代免疫學(xué)來看，膚悅康洗劑具有很大的潛在功效[3]。

對(duì)豚鼠的耳朵反復(fù)涂抹DNCB已被證實(shí)是一種接觸性濕疹的新動(dòng)物模型[23]。本研究結(jié)果顯示：治療21 d后，膚悅康洗劑高劑量組可有效消除紅斑、水腫和鱗屑，與哈西奈德組的結(jié)果相似。膚悅康洗劑低、中、高劑量和哈西奈德組療效指數(shù)較模型組升高，且膚悅康洗劑的作用效果呈劑量依賴性。低、中、高劑量膚悅康洗劑可使?jié)裾钅Ｐ碗嗍笃つw組織升高的IL-4、IL-17、IL-31和TGF-β1表達(dá)水平明顯降低，使降低的IL-2、IFN-γ水平顯著提高，且膚悅康洗劑的作用效果呈劑量依賴性。IFN-γ和TGF-β通常被認(rèn)為是Th1和Th2的特征性細(xì)胞因子。這表明膚悅康洗劑可通過調(diào)節(jié)皮膚TGF-β和IFN-γ的水平來維持Th1/Th2細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)平衡。

綜上所述，膚悅康洗劑對(duì)豚鼠因DNCB引起的濕疹有良好的治療作用，其機(jī)制可能與調(diào)控Th1/Th2的平衡有關(guān)。膚悅康洗劑能降低皮膚組織中IL-31的表達(dá)水平，緩解皮膚瘙癢引起的皮膚糜爛等問題，這為臨床治療濕疹提供了一種新的有效的方法。本研究就膚悅康洗劑對(duì)濕疹的治療機(jī)制進(jìn)行了探討，同時(shí)對(duì)膚悅康洗劑治療濕疹的用量范圍進(jìn)行了摸索。我們?cè)诮窈蟮难芯繉⒗^續(xù)探究膚悅康洗劑安全性方面的問題和治療濕疹具體的用量問題。