何杜朋， 陳錦桃， 崔旭蘭， 袁勁松

（1.南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院，廣東深圳518000；2.北京大學深圳醫(yī)院，廣東深圳518000）

銀杏葉為銀杏科植物銀杏（Ginkgo biloba L.）的干燥葉，含有多種成分，如黃酮類、內酯類、多糖類、酚類等，具有免疫調節(jié)、抗衰老、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂等生物活性[1，2]。近年來關于銀杏葉多糖的抗氧化活性研究表明，其對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子等具有較強清除作用[3，4]，又基于多糖類物質具有較好的吸濕、保濕及營養(yǎng)肌膚等作用研究[5]，提示銀杏葉多糖在現代保健、護膚等產品開發(fā)方面具有一定的潛在價值。而有關銀杏葉多糖的保濕吸濕性能及透皮吸收性能的評價尚無研究報道。另有研究報道，丙三醇、海藻酸鈉具有良好的保濕吸濕功能，已廣泛應用于美容護膚產品[6]。因此，本研究以其為對照，采用水提醇沉、Seveage法除蛋白、纖維素柱層析等方法制備銀杏葉多糖，測定其在不同相對濕度環(huán)境下的吸濕率、保濕率，同時通過離體透皮實驗，分析評價其經皮滲透能力，為其作為天然抗氧化劑的開發(fā)應用提供依據，現將研究結果報道如下。

1 材料

1.1 儀器UV-1700雙光束紫外分光光度計[島津企業(yè)管理（中國）有限公司]；YB-P6智能透皮試驗儀（天津藥典標準儀器廠）；DL-720E超聲儀（上海之信儀器有限公司）；SC-3610低速離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；S30-UV實驗室純水系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）；CP-225D電子天平（0.01mg）（德國賽多利斯公司）；ME-204電子天平（0.000 1 g）（瑞士梅特勒—托利多公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）。

1.2 試藥 銀杏葉（批號：魯1702001），由江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司提供，經北京大學深圳醫(yī)院袁勁松主任中藥師鑒定，所用藥材符合《中華人民共和國藥典》2015版要求。D-無水葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-201506）。其余試劑均為市售分析純。

1.3 動物SPF級健康SD大鼠，體質量（200±10）g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，動物質量合格證號：SYXK（粵）2017-0125。

2 方法與結果

2.1 銀杏葉多糖的制備[7]稱取銀杏葉干品100 g，先用石油醚提取至提取液無色，藥渣風干后加入水加熱回流提取3次，1.5 h/次，過濾，濾液濃縮至適量，加入氯仿和正丁醇溶液混合液（V∶V=5∶1），振蕩，反復多次除去變性蛋白質。在已脫蛋白溶液中加入體積分數95%乙醇調至終濃度為80%，4℃靜置24 h，抽濾，沉淀物依次用體積分數95%乙醇、無水乙醇洗滌2～3次，真空干燥至恒質量，得到粗多糖8.36 g。再將粗多糖通過纖維素柱，蒸餾水洗脫，Molish反應檢測至洗脫液呈陰性。合并洗脫液，濃縮至適量，用乙醇沉淀，4℃靜置24 h，抽濾，沉淀物依次用無水乙醇洗、丙酮洗滌2～3次，真空干燥，得到多糖4.28 g（多糖含量為2.94 g）。

2.2 吸濕性能研究[8，9]于室溫（25±1）℃，將飽和醋酸鉀溶液、飽和碳酸鉀溶液和飽和硫酸銨溶液分別放入干燥器內，控制相對濕度（RH）為43%、60%、81%。準確稱取3份銀杏葉多糖、丙三醇、海藻酸鈉，1.0 g/份，加入到直徑3 cm的稱量瓶中，再分別放置于以上干燥器內，于1、2、4、8、12、16、24 h等不同時間點，測定樣品放置前、后的質量（m0、mn），計算吸濕率：吸濕率（%）=100（mn-m0）/m0。同時，以吸濕率為縱坐標、時間為橫坐標，繪制變化曲線，計算其趨勢線斜率k，即為樣品的吸濕速率。

RH43%的環(huán)境中，各樣品在0～24 h內的吸濕率高低依次為丙三醇＞海藻酸鈉＞銀杏葉多糖，在24 h的吸濕率分別為81.2%、32.8%、27.5%。其中，丙三醇的吸濕率上升速度最快（k=9.434），而海藻酸鈉（k=3.088）與銀杏葉多糖（k=2.634）則是緩慢上升，且較為接近。吸濕率變化見圖1，趨勢線見表1。

圖1 RH43%時不同樣品的吸濕率變化情況（n=3）Figure 1 Comparison of themoisture-absorption rate of the differentsam p les atRH43%（n=3）

表1 RH43%時不同樣品的吸濕率變化趨勢線Tabel1 Trend line of themoisture-absorption rate of the differentsam p les atRH43%

RH60%的環(huán)境中，各樣品在0～24 h內的吸濕率高低依次為丙三醇＞海藻酸鈉≈銀杏葉多糖，在24 h的吸濕率分別為93.2%、35.7%、36.9%。其中，丙三醇的吸濕率上升速度依然最快（k=10.570），而海藻酸鈉（k=3.292）與銀杏葉多糖（k=2.788）則是緩慢上升，且較為接近。與RH42%環(huán)境相比，各樣品吸濕率均有所增加。吸濕率變化見圖2，趨勢線見表2。

圖2 RH60%時不同樣品的吸濕率變化情況（n=3）Figure 2 Com parison of themoisture-absorption rate of the differentsam ples atRH60%（n=3）

表2 RH60%時不同樣品的吸濕率變化趨勢線Table 2 Trend line of themoisture-absorption rate of the differentsam p les atRH60%

RH81%的環(huán)境中，各樣品在0～24 h內的吸濕率高低依次為丙三醇＞銀杏葉多糖＞海藻酸鈉，在24 h的吸濕率分別為114.5%、47.2%、42.5%。其中，丙三醇的吸濕率上升速度仍是最快（k=13.270），而銀杏葉多糖（k=3.992）與海藻酸鈉（k=3.400）則表現為緩慢上升，且較為接近。與RH42%、RH60%環(huán)境相比，各樣品吸濕率均明顯增加，表明隨著環(huán)境相對濕度的增加，其吸濕效率也隨之提高。吸濕率變化見圖3，趨勢線見表3。

圖3 RH81%時不同樣品的吸濕率變化情況（n=3）Figure 3 Comparison of themoisture-absorption rate of the differentsam ples atRH81%（n=3）

表3 RH81%時不同樣品的吸濕率變化趨勢線Table 3 Trend line of themoisture-absorption rate of the differentsam p les atRH81%

2.3 保濕性能研究[8，9]各平行稱取3份銀杏葉多糖、丙三醇、海藻酸鈉，5 g/份，加入2 g超純水，混勻后稱取2 g于直徑3 cm的稱量瓶中，于室溫（25±1）℃置于裝有干硅膠的干燥器內。于1、2、4、8、12、16、24 h等不同時間點，測定樣品放置前、后的水分質量（m0、mn），計算保濕率：保濕率（%）=100mn/m0。同時，以保濕率為縱坐標、時間為橫坐標，繪制變化曲線，計算其趨勢線斜率k，即為樣品的保濕速率。

干硅膠環(huán)境中，在0～24 h的保濕率高低依次為銀杏葉多糖＞海藻酸鈉＞丙三醇，在24 h的保濕率分別為63.6%、59.6%、42.5%，其中，丙三醇的下降速率最快（k=-6.676），海藻酸鈉次之（k=-5.221），銀杏葉多糖最慢（k=-4.359）。保濕率變化見圖4，趨勢線見表4。

2.4 多糖含量測定[10，11]

2.4.1 溶液制備 對照品溶液：稱取D-無水葡萄糖對照品10.17mg于100mL容量瓶中，加入超純水溶解、定容，配制成質量濃度為0.101 7mg/mL的對照品溶液。供試品溶液：稱取銀杏葉多糖15.22mg于100mL容量瓶中，加入生理鹽水超聲溶解、定容，配制成質量濃度為0.152 2mg/mL的供試品溶液。

圖4 干硅膠環(huán)境中不同樣品的保濕率變化情況Figure 4 Com parison of themoisture-retention rate of the differentsam ples under dry silica gelcondition

表4 干硅膠環(huán)境中不同樣品的保濕率變化趨勢線Table 4 Trend line of themoisture-absorption rate of the differentsamp les under dry silica gelcondition

2.4.2 線性范圍考察 精確吸取D-無水葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，分別加水至1.0mL，再加入5%苯酚溶液1.0mL、濃硫酸5.0 mL，沸水浴反應15min；取出冷卻至室溫，平行操作3份。另取超純水1.0mL，加入同量的5%苯酚、濃硫酸，作為空白對照。于紫外分光光度計中490 nm波長處測定吸光度值。以吸光度值為縱坐標、D-無水葡萄糖質量濃度為橫坐標，得回歸方程Y=0.090 9X+0.032 1（R2=0.998 5），表明D-無水葡萄糖對照品在1.451～7.257μg/mL范圍內呈現良好的線性關系。

2.4.3 精密度考察 精確吸取D-無水葡萄糖對照品溶液0.3mL，平行3份，同法顯色反應后連續(xù)測定6次，計算得平均吸光度值為0.421，相對標準偏差（RSD，sR）=0.49%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復性考察 精確吸取供試品溶液0.3mL，平行6份，同法顯色反應后測定吸光度值，計算得平均吸光度值為0.438，sR=0.92%，表明方法的重復性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性考察 精確吸取供試品溶液0.3mL，平行3份，同法顯色反應后每隔1 h測定吸光度值，連續(xù)6 h，計算得平均吸光度值為0.440，sR=0.62%，表明方法的穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率 精確吸取已知含量的供試品溶液0.3mL，平行6份，分別加入質量濃度0.101 7 mg/mL的D-無水葡萄糖對照品溶液0.3mL，同法顯色反應后測定吸光度值，計算得平均回收率為98.63%，sR=0.92%，表明方法的準確性良好。

2.5 體外透皮吸收實驗[12，13]將雄性大鼠處死，腹部脫毛后取其皮膚，去除脂肪等，生理鹽水沖洗干凈，剪成2.0 cm×2.0 cm大小。取大鼠皮膚角質層向上，固定于Franz擴散池的供給室與接受室之間，再往接受室中加入生理鹽水，排盡氣泡。準確稱取濃度為5%、10%的銀杏葉多糖溶液1.0 g于供給室，鋪滿離體大鼠皮膚，敞口密封。設置水浴溫度（37±1）℃、轉速200 r/min，計時開始后于1、2、4、6、8、10、12、18、24 h等不同時間進行取樣1.0mL，同時補加等量同溫的接受液。樣品溶液采用苯酚—硫酸法進行顯色反應，應用紫外—可見分光光度計測定多糖含量，計算單位面積的累積滲透量（Q）：。

其中Cm為第m個取樣點測得的藥物濃度（μg·mL-1），V為接受液體積（17mL），Ci為第i個取樣點測得的藥物濃度（μg·mL-1），Vi為取樣體積，A表示釋藥面積（cm2）。

同時，以時間t為橫坐標、藥物累積滲透量Q為縱坐標，繪制累積滲透曲線，同時進行線性回歸，所得Q-t直線方程的斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率JSS，通過方程的截距可算得滯后時間Tlag，滲透系數K p=JSS/C（0C0為擴散池中的藥物初始質量濃度）。

由結果可知，在0～24 h內，1%、5%、10%濃度的銀杏葉多糖均較為勻速地緩慢滲透，其中，穩(wěn)態(tài)透皮速率JSS、時滯Tlag均逐漸上升，而滲透系數K p及累積透過率則逐漸下降。三者相比，銀杏葉多糖溶液的滲透速率、時滯均隨濃度的提高而升高，但是滲透系數與累積滲透率卻隨著逐漸下降。見圖5、表5。

2.6 體外透皮吸收規(guī)律研究[14]以不同時間點的累積滲透量擬合零級動力學、一級動力學、Higuchi、Weibull、Hixson-Crowell、Ritger-Peppas等藥物釋放數學模型，比較r2值可知，1%、5%、10%的銀杏葉多糖均以Ritger-Peppas為最佳擬合模型（r2分別0.979 1、0.988 2、0.983 5），表明其體外透皮吸收規(guī)律符合Ritger-Peppas模型。具體結果見表6。

圖5 不同濃度銀杏葉多糖溶液在不同時間點的累積滲透量變化Figure 5 Changes of the cumulative permeability of Ginkgo biloba leaves polysaccharide solution w ith different concentrations atdifferent time points

3 討論

我國的銀杏葉產量占據世界的90%以上，資源十分豐富，且銀杏的葉、果和外種皮等部位均含有多糖。本研究立足于銀杏葉多糖的保濕吸濕、透皮吸收性能的評價，可為其在美容護膚方面的應用提供依據，不僅可以更為顯著地提高銀杏葉的資源利用率，而且還能創(chuàng)造更高的經濟價值，更大地調動種植戶的積極性，具有重要的意義。

由于皮膚直接與空氣接觸，空氣中的濕度對于多糖能否發(fā)揮明顯的保濕吸濕效果起到關鍵性的影響。本研究體外模擬高濕、低濕以及干燥環(huán)境，考察銀杏葉多糖在不同相對濕度環(huán)境下的保濕吸濕性能變化。結果發(fā)現：銀杏葉多糖隨著相對濕度（43%、60%、81%）的上升，吸濕率逐漸上升，顯示吸濕性能亦有所提高；與丙三醇、海藻酸鈉相比，銀杏葉多糖吸濕性能均弱于丙三醇，但與海藻酸鈉相近（中低濕度環(huán)境）甚至更優(yōu)（高濕度環(huán)境）；在干燥環(huán)境下，銀杏葉多糖的保濕性能則優(yōu)于其他二者。表明銀杏葉多糖的保濕吸濕性能較為均衡，可在不同環(huán)境中發(fā)揮不同作用，是一種性價比高、綜合性強的保濕劑。分析認為，丙三醇為小分子，含有多個-OH，因此在吸濕方面表現出更強的能力；而銀杏葉多糖（-OH等）與海藻酸鈉（-COONa、-OH等）均屬于多糖類物質，分子量均較大，表現出相似的性能。

表5 不同濃度銀杏葉多糖的體外滲透動力學參數Table 5 Com parison of the parameters of penetration kinetics of the differentconcentrations of Ginkgo biloba leaves polysaccharose

表6 不同濃度銀杏葉多糖的藥物釋放數學模型擬合Table 6 Mathematicalmodel fitting for drug release of Ginkgo Biloba leaves polysaccharide w ith differentconcentrations

在體外經皮吸收中發(fā)現，1%、5%、10%濃度的銀杏葉多糖溶液的滲透系數分別為28.89×10-5、7.56×10-5、4.11×10-5cm·h-1，表明不同濃度的銀杏葉多糖均能緩慢地經皮滲透。其中在各時間點的單位面積滲透量、穩(wěn)態(tài)滲透速率、時滯方面，隨著濃度的升高，滲透量增加、速率升高、時間滯留量更多，表現出正相關關系；而對于滲透系數與累積滲透率而言，則是隨著濃度的升高而降低，呈現負相關關系。通過對不同時間的累積滲透量進行藥物釋放數學模型擬合發(fā)現，3個不同濃度的銀杏葉均以Ritger-Peppas模型的擬合度為最高，提示銀杏葉多糖在皮膚與接受液所構成的骨架體系中進行溶蝕擴散與釋放。另外，銀杏葉多糖除了對皮膚具有保濕吸濕功能外，還能夠滲透入皮膚，發(fā)揮其他作用。