金曉玲

（慶陽(yáng)市畜牧技術(shù)推廣中心，甘肅 慶陽(yáng) 745000）

紫花苜蓿屬豆科植物，根瘤菌可與其共生形成根瘤，這一共生體系的共生固氮作用不僅具有巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，同時(shí)在改善生態(tài)環(huán)境等方面具有重要意義。苜蓿多采用種子繁殖，種子用量很大但不耐貯藏（Lopez et al,2001)。已報(bào)道苜蓿種子內(nèi)攜帶根瘤菌，但由于儲(chǔ)藏時(shí)溫度及儲(chǔ)藏方式等，常常會(huì)影響到種帶根瘤菌數(shù)量。因此，適應(yīng)的貯藏溫度利于體內(nèi)根瘤菌的繁殖。此外，種子含水量也會(huì)影響種子活力?；羝交鄣龋?011）采用硅膠室溫干燥法對(duì)隴東紫花苜蓿進(jìn)行了超干處理，使種子含水量由9.03%(CK)分別降至7.09%、6.93%、6.36%、5.72%、5.46%、5.18%、4.97%和4.59%，4.59%；之后將種子用雙層鋁箔紙密封，置于盛滿硅膠的干燥皿中，室溫(23～26℃)下貯藏一年，結(jié)果顯示不同程度的干燥脫水對(duì)種子活力有顯著影響。雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)溫度或者含水量對(duì)種子生長(zhǎng)影響有所研究，但是對(duì)于溫度和含水量?jī)烧呦嗷ソ徊孀饔脤?duì)種子根瘤菌影響的研究報(bào)道目前尚少。

因此，本試驗(yàn)以含根瘤菌的紫花苜蓿種子為試驗(yàn)材料，分別用不同溫度和包裝條件貯存，研究種子內(nèi)根瘤菌存活和增殖的適宜條件，通過不同保存方式對(duì)含根瘤菌種子內(nèi)根瘤菌增殖的影響，繼而篩選出最適保存條件，為獲得含有大量根瘤菌的苜蓿種子奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘農(nóng)5號(hào)紫花苜蓿(medicago sativa L.Gannong No.5) 在結(jié)莢期以切主根澆灌、根部直接澆灌、加入600 mg/ml苦參堿（濃度1.3%）澆灌三種接種方法接種兩種熒光標(biāo)記根瘤菌（Sinorhizobium meliloti.12531f（S.12531f）和 Rhiz obium meliloti.GN5f（R.GN5f）。結(jié)莢期收獲種子，未進(jìn)行標(biāo)記根瘤菌接種的處理為對(duì)照。室內(nèi)風(fēng)干2個(gè)月進(jìn)行不同方法的貯存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 含熒光標(biāo)記根瘤菌種子的貯存 根瘤菌生長(zhǎng)的臨界低溫值為-10℃（祁娟，2006），最高適應(yīng)生長(zhǎng)溫度為28℃，因此本次設(shè)定25℃（室溫），4℃（低溫），-4℃（超低溫），采用鋁箔紙（種子用鋁箔紙密封包裝)、信封加布袋（種子裝于布袋內(nèi)，外加信封袋）、信封袋3種包裝方式貯存處理；以用紙質(zhì)信封袋包裝后置于有干燥硅膠的干燥器內(nèi)在室溫下貯存處理為對(duì)照，貯藏6個(gè)月后測(cè)定種子內(nèi)生根瘤菌數(shù)量。

1.2.2 種子內(nèi)根瘤菌數(shù)量的檢測(cè) 貯存6個(gè)月后隨機(jī)挑選各處理種子25粒，重復(fù)4次，放入50 ml無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)，加入碘伏消毒液(有效碘濃度為2500 mg/L)淹沒浸泡消毒3 min后無(wú)菌水沖洗5次，至三角瓶?jī)?nèi)無(wú)泡沫狀液體出現(xiàn)。以上均在無(wú)菌環(huán)境內(nèi)進(jìn)行。表面消毒后，將最后一次消毒的植物器官各面在培養(yǎng)基平板上印一下，28℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察有無(wú)菌落產(chǎn)生，以驗(yàn)證消毒是否徹底。若有菌落長(zhǎng)出則再次消毒(遲峰,2006)。消毒后的種子各部位置于無(wú)菌研缽中，加入2 ml無(wú)菌水研磨，研磨液離心（4 000 rpm/min，2 min）后依次吸取0.2 ml上清液均勻涂布于含剛果紅YMA固體培養(yǎng)中，28℃培養(yǎng)24 h后黑暗中記錄每培養(yǎng)皿中根瘤菌單菌落數(shù)量。（剛果紅YMA培養(yǎng)基中，根瘤菌形態(tài)為含有粘質(zhì)胞外多糖且不吸附色素的白色半透明菌落，形態(tài)為平坦凸起或半透明凸起，邊緣光滑）（霍平慧,2014）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS20.0.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 常溫（25℃）不同貯存方法對(duì)不同處理種子內(nèi)生根瘤菌數(shù)量的影響

如圖1所示，常溫信封貯存條件下，G切種子的保存效果最好，根瘤菌數(shù)量數(shù)量最多，達(dá)到380.0/cfu·25粒-1，與鋁箔和信封+布袋的貯存條件相比，差異顯著；G澆處理鋁箔貯存條件下內(nèi)生根瘤菌數(shù)量顯著高于其他兩種包裝材料，數(shù)量為197.5/cfu·25粒-1；1澆在信封和鋁箔貯存條件下數(shù)量顯著高于信封+布袋處理，但二者之間差異不顯著；CK種子在鋁箔包裝條件下效果好，達(dá)260.5/cfu·25粒-1，顯著高于其他兩種處理。其余不同處理不同包裝材料間種子內(nèi)生根瘤菌數(shù)量無(wú)顯著性差異。

圖1 常溫（25℃）不同貯存方法下不同處理種子內(nèi)生根瘤菌數(shù)量變化

2.2 常溫（25℃）干燥不同貯存方法對(duì)不同處理種子內(nèi)生根瘤菌數(shù)量的影響

如圖2所示，常溫（25℃）干燥信封+布袋保存條件下，1澆種子保存效果最好，內(nèi)生根瘤菌數(shù)量顯著高于其他處理，數(shù)量達(dá)1021/cfu·25粒-1。G切在鋁箔貯存條件下根瘤菌數(shù)量顯著高于其他兩種包裝方法，達(dá)332.0/cfu·25粒-1；G澆處理內(nèi)生根瘤菌數(shù)量在信封包裝條件下顯著高于其他處理，達(dá)552/cfu·25粒-1；G+苦在信封包裝條件下內(nèi)生根瘤菌數(shù)量顯著高于其他兩種處理，數(shù)量為385.0/cfu·25粒-1；CK種子內(nèi)生根瘤菌數(shù)量最少，僅為58.5/cfu·25粒-1，且三種包裝材料間無(wú)顯著性差異。

圖2 常溫（25℃）干燥不同貯存方法下不同處理種子內(nèi)生根瘤菌數(shù)量變化

2.3 4℃不同貯存方法對(duì)不同處理種子內(nèi)生根瘤菌數(shù)量的影響

如圖3所示，在4℃鋁箔包裝條件下1澆種子內(nèi)生根瘤菌數(shù)量顯著高于其他處理，數(shù)量達(dá)259.5/ cfu·25粒-1。G切處理各包裝材料間無(wú)顯著性差異；G澆在信封貯存條件下內(nèi)生根瘤菌數(shù)量顯著高于另兩種材料，為136.0/cfu·25粒-1；其余四種處理不同包裝材料間差異不顯著。

圖3 4℃不同貯存方法下不同處理種子內(nèi)生根瘤菌數(shù)量變化

2.4 -4℃不同貯存方法對(duì)不同處理種子內(nèi)生根瘤菌數(shù)量的影響

如圖4所示，-4℃下，G切種子在信封貯存條件下根瘤菌數(shù)量最多達(dá)638.5/cfu·25粒-1，顯著高于其它兩種包裝材料；G+苦鋁箔保存條件下根瘤菌數(shù)量達(dá)625.0/cfu·25粒-1，顯著高于其他兩種包裝處理；1切和1澆在鋁箔包裝條件下數(shù)量最高分別為374.5/cfu·25粒-1和312.0/cfu·25粒-1，但與信封+布袋無(wú)顯著性差異；G澆/1+苦和CK各包裝材料間差異不顯著，最多分別為305.5/cfu·25粒-1、213.5/cfu·粒-1和73.5/cfu·25粒-1。

圖4 -4℃不同貯存方法下不同處理種子內(nèi)生根瘤菌數(shù)量變化

3 討論

適宜的貯藏溫度和良好的貯藏條件是種子內(nèi)生根瘤菌繁殖的關(guān)鍵因素。每種微生物都有其適宜的生長(zhǎng)溫度范圍。本試驗(yàn)在4℃貯存時(shí)各處理種子內(nèi)生根瘤菌最高數(shù)量均低于其他三個(gè)溫度的貯存數(shù)量，以25℃干燥信封+布袋貯存1澆種子內(nèi)根瘤菌數(shù)量最多，由此說明選取的三種溫度均未達(dá)到根瘤菌生長(zhǎng)最低限，但因種子外包裝材料及菌種特性從而影響種子內(nèi)生根瘤菌的繁殖。

含水量是保持種子活力和生活力的關(guān)鍵因素之一。已有研究認(rèn)為貯藏種子含水量低于5%，將導(dǎo)致種子活力下降(Buitinket al,1999;McDonald ,1999)。本研究發(fā)現(xiàn)25℃貯存時(shí)，干燥條件除G切和對(duì)照外，各處理種子內(nèi)根瘤菌數(shù)量均高于未干燥處理，由此表明水分同樣影響種子內(nèi)根瘤菌的繁殖。

相同溫度貯存條件下，不同包裝材料對(duì)不同處理種子內(nèi)根瘤菌數(shù)量影響不同。常溫時(shí)，信封貯存G切種子效果明顯優(yōu)于其他兩種包裝材料，鋁箔貯存G澆和CK種子效果明顯優(yōu)于其他兩種包裝材料，其余處理不因包裝材料不同而不同；25℃干燥時(shí)，鋁箔貯存G切，信封貯存G澆、G+苦種子，信+布貯存1澆種子時(shí)效果明顯優(yōu)于其他兩種包裝材料，4℃鋁箔貯存1澆種子時(shí)效果明顯優(yōu)于其他兩種包裝材料，-4℃時(shí)鋁箔貯存G切和G+苦種子時(shí)效果明顯優(yōu)于其他兩種包裝材料，其余各包裝材料在相同溫度下并未影響種子內(nèi)根瘤菌數(shù)量。由此表明包裝材料對(duì)內(nèi)生根瘤菌數(shù)量的影響因溫度不同而不同，進(jìn)而表明溫度和含水量是共同影響種子內(nèi)根瘤菌存活的因素。

本試驗(yàn)中，適宜種子內(nèi)生根瘤菌增殖的溫度為25℃干燥或-4℃，表明接種根瘤菌后苜蓿種子適宜在常溫干燥或低溫環(huán)境下貯存，但由于種子貯存過程中含水量較難控制，環(huán)境會(huì)影響含水量的變化，因此，生產(chǎn)實(shí)踐中-4℃更利于種子的貯存，而該溫度下，鋁箔包裝材料下種子內(nèi)根瘤菌數(shù)量較多。

因此，從生產(chǎn)實(shí)踐及種子貯存的方便性考慮，-4℃鋁箔紙密封保存更利于種子內(nèi)根瘤菌的增長(zhǎng)和繁殖，但利于更多根瘤菌在種子內(nèi)繁殖并獲得穩(wěn)定高產(chǎn)植株的種子貯存條件仍有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

溫度和水分共同影響紫花苜蓿種子內(nèi)根瘤菌的繁殖，綜合生產(chǎn)實(shí)踐條件，得出-4℃更利于根瘤菌在種子內(nèi)繁殖；鋁箔保存效果優(yōu)于信封和信封+布袋。