劉 楊，劉翊忠，李瓊毅

（1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

EMCV是微RNA病毒科心病毒屬的病毒。1945年首次從一只黑猩猩的體內(nèi)分離得到，隨后在多國(guó)被相繼報(bào)道[1]。懷孕母豬感染EMCV之后可導(dǎo)致木乃伊胎和繁殖機(jī)能障礙，臨近分娩時(shí)可發(fā)生流產(chǎn)、木乃伊胎增加和小豬離乳前死亡。仔豬感染致死，哺乳小豬致死率甚至可達(dá)到100%[2]。較大豬和成豬通常不顯性感染，成豬偶爾發(fā)生死亡。人感染時(shí)常呈現(xiàn)散發(fā)，患者可表現(xiàn)間歇性頭痛、頸項(xiàng)強(qiáng)直，嘔吐和發(fā)熱[3]。

該病毒可通過(guò)多種途徑感染動(dòng)物和人類，但具體的感染機(jī)制目前尚未完全清楚，有報(bào)道稱包括EMCV在內(nèi)的心臟病毒可能經(jīng)由內(nèi)吞途徑感染宿主細(xì)胞[4]。發(fā)動(dòng)蛋白可以參與多種內(nèi)吞途徑，為大多數(shù)內(nèi)吞途徑提供動(dòng)力[5]，包括經(jīng)典的網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑，在非網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑中，目前發(fā)現(xiàn)只有小窩蛋白依賴的內(nèi)吞途徑需要發(fā)動(dòng)蛋白的參與。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究提示發(fā)動(dòng)蛋白依賴型內(nèi)吞途徑可參與多種病毒感染宿主細(xì)胞，如猿猴空泡病毒40、冠狀病毒和口蹄疫病毒等[6]。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及毒株

人宮頸癌細(xì)胞（Hela）、倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK-21）、腦心肌炎病毒（EMCV）由甘肅省蘭州市西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心提供。

1.2 主要儀器與試劑

凝膠成像系統(tǒng)（GE）；酶標(biāo)儀（Thermo Fisher）；Proliferation細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Gromega公司；鼠源VP1抗體由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室提供；抑制劑Dynasore 購(gòu)自Abcam公司，MitMab購(gòu)自Tocris公司。

1.3 特異性抑制劑濃度篩選

參考已有文獻(xiàn)將發(fā)動(dòng)蛋白特異性抑制劑Dynasore和MitMab配置成含F(xiàn)BS的不同濃度工作液，然后作用于Hela細(xì)胞24 h。24 h后，按照Proliferation細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)，重復(fù)三次，篩選兩種抑制劑適宜工作濃度。

1.4 特異性抑制劑試驗(yàn)

1.4.1 特異性抑制劑作用下EMCV攻毒 配置含F(xiàn)BS的適宜濃度的Dynasore和MitMab工作液，作用于Hela細(xì)胞1h，1h后進(jìn)行EMCV攻毒，接毒量為0.1MOI，病毒體積=細(xì)胞數(shù)× 0.1MOI/0.7 ×TCID50[7]。接毒1 h后棄去毒液，換為Dynasore和MitMab的細(xì)胞維持液。于感染后24 h收集細(xì)胞和上清。

1.4.2 Western bolt檢測(cè)Hela細(xì)胞中VP1含量 收集Hela細(xì)胞，RIPA裂解，產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜。脫脂奶粉封閉1 h，加入鼠抗VP1一抗（1：5000稀釋），室溫孵育2 h，PBST洗膜5次，每次5 min，再加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，PBST洗膜5次，ECL顯色。

1.4.3 病毒滴度檢測(cè) 將收集到的上清10倍梯度稀釋（10-1～10-8）接種于96孔板的BHK-21細(xì)胞中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育6天，統(tǒng)計(jì)病毒感染陽(yáng)性細(xì)胞孔的數(shù)量，Karber法計(jì)算病毒滴度。

1.4.4 病毒拷貝數(shù)檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定量測(cè)定上清的病毒拷貝數(shù)，TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR參考本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法。

2 結(jié)果

2.1 特異性抑制劑濃度篩選

將Hela細(xì)胞在含有不同濃度特異性抑制劑Dynasore和MitMab培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后測(cè)定細(xì)胞活力。確定Dynasore的適宜工作濃度：25 μM和50μM（圖1A），MitMab的適宜工作濃度2.5 μm 和5.0 μM（圖1B）。

圖 1 細(xì)胞活力檢測(cè)

2.2 特異性抑制劑作用下EMCV攻毒試驗(yàn)

2.2.1 Hela細(xì)胞中VP1含量檢測(cè)結(jié)果 將Dynasore和MitMab處理過(guò)的Hela細(xì)胞進(jìn)行EMCV攻毒試驗(yàn)，收集細(xì)胞檢測(cè)VP1含量，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。結(jié)果顯示經(jīng)25 μM和50 μM的Dynasore作用后VP1含量顯著下降（圖2AB），經(jīng)過(guò)2.5 μM MitMab作用后VP1下降不明顯（圖2CD），經(jīng)過(guò)5.0 μM MitMab作用后VP1含量下降顯著（圖2CD）。

圖 2 VP1蛋白含量檢測(cè)

2.2.2 病毒滴度檢測(cè)結(jié)果 將Dynasore和MitMab處理過(guò)的Hela細(xì)胞進(jìn)行EMCV攻毒試驗(yàn)，收集上清進(jìn)行病毒滴度檢測(cè)。結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)25 μM和50 μM的Dynasore作用后病毒滴度均下降明顯（圖3A），經(jīng)2.5 μM和5.0 μM MitMab處理后病毒滴度同樣顯著下降（圖3B）。

圖3 病毒滴度檢測(cè)結(jié)果

2.2.3 病毒拷貝數(shù)檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果 上清病毒拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)25 μM和50 μM Dynasore作用后病毒拷貝數(shù)下降很明顯（圖4A）。經(jīng)2.5 μM和5.0 μM MitMab處理后病毒拷貝數(shù)同樣下降明顯（圖4B）。

圖 4 病毒拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果

3 分析與討論

選取對(duì)細(xì)胞活力無(wú)影響的抑制劑濃度作用于Hela細(xì)胞后進(jìn)行EMCV攻毒，接毒24 h后收集細(xì)胞檢測(cè)VP1含量，收集上清液檢測(cè)病毒拷貝數(shù)和病毒滴度，分別從蛋白和基因等水平檢測(cè)病毒感染狀況。蛋白、病毒拷貝數(shù)和病毒滴度檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)抑制劑Dynasore和MitMab作用后EMCV感染Hela細(xì)胞受到抑制，雖然三種檢測(cè)結(jié)果中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的差異顯著性不完全相同，但大體的趨勢(shì)一致；都可提示發(fā)動(dòng)蛋白依賴型內(nèi)吞途徑抑制劑Dynasore和MitMab可以抑制病毒感染Hela細(xì)胞，證明了EMCV感染Hela細(xì)胞依賴于發(fā)動(dòng)蛋白發(fā)揮作用。

本試驗(yàn)初步探索了發(fā)動(dòng)蛋白在EMCV感染Hela細(xì)胞中的作用，證明了發(fā)動(dòng)蛋白參與EMCV感染Hela細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)大大降低了研究EMCV通過(guò)內(nèi)吞途徑感染宿主細(xì)胞的范圍，可以有針對(duì)性的研究網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑。另外，這一發(fā)現(xiàn)為使用Dynasore和MitMab預(yù)防和治療EMCV以及其他通過(guò)發(fā)動(dòng)蛋白依賴型內(nèi)吞途徑感染人與動(dòng)物的病毒提供了一個(gè)可行的思路。隨著發(fā)動(dòng)蛋白參與病毒感染這一機(jī)制研究的不斷深入，有可能從發(fā)動(dòng)蛋白著手，為防治人與動(dòng)物的腦心肌炎提供更優(yōu)的方法。