何雙

摘要：目的 ?觀察胚胎停育婦女絨毛織組中caspase-3和survivin的表達，探討過度凋亡與胚胎停育的關系。方法 ?選取2018年5月1日～12月31日在天津市第一中心醫(yī)院婦科計劃生育門診確診胚胎停育患者30例作為觀察組，另選取同期在我院計劃生育門診正常妊娠要求人工流產的患者30例作為對照組，采用SP法檢測兩組患者絨毛組織中caspase-3和survivin的表達。結果 ?對照組光鏡下見絨毛組織大小一致，絨毛間可見正常結構的間充質細胞。觀察組光鏡下見絨毛組織發(fā)生不同程度的退行性改變，間充質變性，結構模糊，同時伴炎性反應;觀察組絨毛組織細胞及對照組絨毛組織細胞皆有caspase-3蛋白的表達，觀察組絨毛組織caspase-3表達量高于對照組，觀察組陽性率為96.66%，高于對照組的86.66%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;觀察組絨毛組織細胞及對照組絨毛組織細胞皆有survivin蛋白的表達，觀察組絨毛組織survivin表達量低于對照組，觀察組陽性率為73.33%，低于對照組的96.66%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 ?胚胎停育可能與絨毛組織中caspase-3高表達、survivin低表達導致的細胞凋亡過度有關。

關鍵詞：胚胎停育;caspase-3;survivin;凋亡

中圖分類號：R714.2 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.19.023

文章編號：1006-1959（2019）19-0080-03

Study on the Relationship Between Caspase-3，Survivin and Embryonic Stop

HE Shuang

（Department of Obstetrics and Gynecology，Tianjin First Central Hospital，Tianjin 300192，China）

Abstract：Objective ?To observe the expression of caspase-3 and survivin in embryos and women's chorionic villi， and to explore the relationship between excessive apoptosis and embryonic cessation.Methods ?From May 1st to December 31st， 2018， 30 cases of embryos were diagnosed in the gynecological family planning clinic of the First Central Hospital of Tianjin as the observation group， and the abortion was performed in the normal pregnancy of the family planning clinic in our hospital.30 patients were used as the control group. The expression of caspase-3 and survivin in the villus tissues of the two groups was detected by SP method.Results ?In the control group， the size of the villus was consistent under the light microscope， and the mesenchymal cells with normal structure were observed between the villi. Under the light microscope， the villus tissue showed different degree of degenerative changes， mesenchymal degeneration， structural ambiguity， and inflammatory reaction. The expression of caspase-3 protein was observed in the villous tissue cells of the observation group and the villus tissue cells of the control group. The expression of caspase-3 in the villus tissue of the observation group was higher than that of the control group. The positive rate of the observation group was 96.66%，the difference of 86.66% in the control group was statistically significant （P<0.05）. The expression of survivin protein was observed in the villous tissue cells of the observation group and the villous tissue cells of the control group. The expression of survivin in the villus tissue of the observation group was lower than that of the control group. The positive rate was 73.33%， which was lower than that of the control group 96.66%，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion ?Embryo arrest may be associated with excessive expression of caspase-3 in villus tissues and excessive apoptosis induced by low expression of survivin.

Key words：Embryonic stop;Caspase-3;Survivin;Apoptosis

隨著國家二胎政策的開放，妊娠婦女人數(shù)增多，胚胎停育的發(fā)病率也逐步升高，調查顯示胚胎停育的患者高達13.4%[1]。胚胎停育，又稱稽留流產，是指胚胎或胎兒已死亡滯留宮腔內未能及時自然排出[2]。有研究顯示細胞過度凋亡參與了胚胎停育的發(fā)生[3]。Caspase-3是在胎盤絨毛組織表達的一種促凋亡蛋白，survivin是在胎盤絨毛組織表達的一種細胞凋亡抑制蛋白，本研究通過檢測胚胎停育患者絨毛組織中caspase-3、survivin的表達，分析細胞過度凋亡與稽留流產的關系，進而指導臨床采取有效的預防措施，以期為優(yōu)生優(yōu)育指導提供理論依據。

1資料與方法

1.1一般資料 ?選取2018年5月1日～12月31日在天津市第一中心醫(yī)院計劃生育門診確診胚胎停育需行清宮術的患者30例作為觀察組，另隨機選取同期在我院計劃生育門診正常妊娠要求人工流產的患者30例作為對照組。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會審批，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。納入標準：①月經周期規(guī)律;②血HCG陽性，經我院B超確診宮內孕，對照組患者B超顯示有胎心搏動，觀察組患者B超顯示可見胎囊無胎心搏動。排除標準：①近半年內曾服用激素類藥物;②曾放置宮內節(jié)育器;③有藥物過敏史;④有生殖系統(tǒng)急性炎癥及腫瘤;⑤合并內外科相關疾病。觀察組年齡20～40歲，平均年齡（26.83±5.52）歲;停經40～63 d，平均停經（44.00±3.20）d;胎囊最大徑線1.5～2.0 cm，平均徑線（1.90±0.45）cm。對照組年齡20～40歲，平均年齡（27.33±5.46）歲;停經40～63 d，平均停經（45.00±2.23）d，胎囊最大徑線1.4～2.0 cm，平均徑線（1.82±0.35）cm。兩組年齡、停經時間及胎囊徑線比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2方法 ?負壓吸宮術后取絨毛組織置于生理鹽水中沖洗2次，取小于0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm組織塊，置于4%多聚甲醛固定，取材，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，連續(xù)切片厚度為5 μm;將切片置于二甲苯及梯度乙醇中脫蠟，自來水及PBS沖洗后依次入甲醇雙氧水、蒸餾水及MPBS沖洗;將切片放入抗原修復液中經加熱、冷卻及PBS沖洗進行修復，切片上滴加正常山羊血清封閉液室溫20 min后滴加第一抗體（caspase-3及survivin抗體），4℃過夜，MBPS沖洗5 min×3次;滴加生物素化第二抗體（IgG），37℃，20 min，MBPS沖洗5 min×3次;切片上滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃，20 min，MBPS沖洗，5 min×3次;使用混勻DAB顯色試劑加至切片上顯色6 min，充分水洗;經過蘇木素復染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹脂封片，在光鏡下觀察。

1.3判定標準 ?光鏡下觀察細胞內出現(xiàn)淺棕黃色、棕黃色 、棕褐色顆粒為survivin、caspase-3陽性細胞。陽性著色細胞分級：（A）判斷標準：<25%記0分，25%～50%記1分，50%～75%記2分，>75%記3分。陽性細胞著色強度（B）判斷標準：無著色或背景均勻一致，淡黃色記0分;淺棕黃色記1分;棕黃色記2分;棕褐色記3分。隨機選取5個不重疊的高倍視野（×400倍），根據兩項指標的積分數(shù)（積分=A×B）積分。積分0分：（-），1～3分：（+），4～6分：（++），7～9分：（+++）。

1.4統(tǒng)計學方法 ?所有數(shù)據用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗。計數(shù)資料用（n，%）表示，比較采用？字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1兩組病理形態(tài)比較 ?對照組患者光鏡下見絨毛組織大小一致，內層細胞滋養(yǎng)細胞邊界清晰，外形為卵圓形或立方形，細胞漿透明，外層合體滋養(yǎng)細胞，細胞核深染且有多個。絨毛間可見正常結構的間充質細胞，見圖1。觀察組患者光鏡下見絨毛組織發(fā)生不同程度的退行性改變，滋養(yǎng)層細胞數(shù)量明顯減少并發(fā)生萎縮，間充質變性，結構模糊，同時伴炎性反應，見圖2。

2.2兩組絨毛組織中caspase-3表達比較 ?觀察組絨毛組織細胞及對照組絨毛組織細胞皆有caspase-3蛋白的表達，觀察組絨毛組織caspase-3表達量高于對照組，觀察組陽性率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（？字2=16.364，P=0.001），見表1。

2.3兩組絨毛組織中survivin表達比較 ?觀察組絨毛組織細胞及對照組絨毛組織細胞皆有survivin蛋白的表達，觀察組絨毛組織survivin表達量低于對照組，觀察組陽性率低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（？字2=8.419，P=0.038），見表2。

3討論

胚胎停育近年來一直是婦產科優(yōu)生與遺傳領域的研究熱點，其發(fā)病原因錯綜復雜，具體發(fā)病機制尚未明確[4]。目前認為與染色體異常、內分泌異常、感染、抗生殖免疫抗體、年齡、環(huán)境等因素相關。隨著分子生物學技術的發(fā)展，越來越多的研究證實胚胎停育促凋亡基因及抑制凋亡基因表達異常相關[5，6]。受精卵著床后，經過定位、黏附和侵入三個過程，滋養(yǎng)細胞穿透侵入子宮內膜，輔助胚胎著床。正常情況下，滋養(yǎng)細胞通過細胞抗凋亡與細胞凋亡之間的平衡實現(xiàn)細胞增殖，在妊娠早期，應以絨毛和蛻膜組織細胞增殖為主[7]，妊娠晚期應以細胞凋亡為主，絨毛組織細胞增殖/凋亡的平衡狀態(tài)有利于絨毛內血管及分支形成和相關的侵襲能力的保持[8]。細胞凋亡是主動、有序由基因調控的自我凋亡過程，通過清除壞死細胞，分解ATP，進入能量循環(huán)[9]。本研究從促凋亡因子caspase-3與抑制凋亡因子survivin入手，證實二者介導的細胞凋亡過度參與了胚胎停育的發(fā)生。

促凋亡蛋白caspase-3是caspase家族中的一員，caspase家族是一組在細胞凋亡機制中占據重要地位的蛋白酶，又稱“天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶”，特異性作用于底物的天冬氨酸殘基，caspase-3及其前體pro-caspase-3是目前發(fā)現(xiàn)的在胚胎胎盤組織中唯一表達的caspase成員，與CED-3同源性最高，處于caspase家族介導的細胞凋亡傳導通路的下游，其表達增高會啟動線粒體/細胞色素C及Fas介導的細胞凋亡通路。Caspase-3一旦被激活，凋亡將不可逆轉，凋亡通路一旦活化將促使胚胎絨毛細胞大量凋亡[10]，絨毛細胞過度凋亡勢必阻礙絨毛組織生長，導致胚胎停止發(fā)育?？梢哉J為絨毛組織中caspase-3表達增加，提示絨毛組織中存在細胞過度凋亡。本研究中，觀察組絨毛組織及對照組正常早孕絨毛組織中皆有caspase-3的表達，表明促凋亡蛋白caspase-3參與了正常生理狀態(tài)下絨毛滋養(yǎng)細胞增殖/凋亡的平衡，而觀察組絨毛組織中caspase-3的表達量高于對照組（P<0.05），證明胚胎停育患者絨毛組織中caspase-3基因高表達，細胞凋亡信號過強， caspase-3蛋白產生過量，細胞凋亡過度，打破了絨毛滋養(yǎng)細胞增殖/凋亡的平衡，導致胚胎停止發(fā)育。

抑制凋亡因子survivin是細胞凋亡抑制蛋白（inhibiting apoptosis protein，IAP）中最小的成員，是迄今為止發(fā)現(xiàn)作用最強的凋亡抑制因子，是由Ambrosini等應用效應細胞蛋白酶受體-1的cDNA通過雜交的方法在人類基因組文庫中篩選出來。Survivin主要在胚胎組織及腫瘤組織中表達，在分化成熟的正常組織中表達水平較低[11]。Survivin在調控細胞周期、抑制細胞凋亡的過程中發(fā)揮重要作用，其通過抑制線粒體/細胞色素C介導的細胞凋亡通路，阻斷下游的caspase活化以及抑制p53的功能等多種途徑發(fā)揮抗凋亡作用[12]。此外，survivin還可以上調同家族其它成員的作用，進而調節(jié)細胞周期調節(jié)因子，間接調控妊娠早期高度增生的細胞滋養(yǎng)細胞凋亡。有研究顯示[13]，米非司酮可以下調survivin蛋白的表達，以誘導早孕絨毛、蛻膜組織細胞凋亡，達到抗早孕的目的。王莉等[14]研究顯示，早產胎盤組織中survivin的表達明顯低于足月分娩組，證實survivin低表達引起的細胞過度凋亡導致了不良妊娠結局。本研究應用免疫組化法，檢測到觀察組絨毛及對照組絨毛組織中皆有survivin蛋白的表達，而觀察組絨毛組織中survivin蛋白表達量低于對照組（P<0.05），證明survivin的低表達使抗凋亡作用減弱，caspase-3過量表達間接誘發(fā)細胞過度凋亡，阻礙絨毛增殖，胚胎停止發(fā)育。

綜上所述，絨毛組織中caspase-3、survivin蛋白的異常表達與胚胎停育發(fā)生密切相關。本研究目前僅從組織學方面研究caspase-3、survivin與胚胎停育發(fā)生的關系，尚未在臨床診治中進行探討，因樣本數(shù)量有限，且引起胚胎停育的原因眾多，caspase-3、survivin引起細胞凋亡的分子生物學機制需要更多的細胞凋亡的基礎性研究支持，從而指導臨床診治及預防胚胎停育。

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