蘭海生 黃許森 單云龍 黃海舸 岑小寧 鐘麗華 李明尚

【摘要】?目的?動態(tài)觀察濕潤燒傷膏對大鼠慢性難愈合創(chuàng)面組織中BMP-7表達的影響。方法?按照隨機數(shù)表將54只健康成年SPF級SD雄性大鼠分為慢創(chuàng)組（18只）、美寶濕潤燒傷膏（MEBO）組（18只）和貝復(fù)濟組（18只），模型建立后，慢創(chuàng)組創(chuàng)面局部涂生理鹽水、MEBO組局部涂美寶濕潤燒傷膏、貝復(fù)濟組局部涂外用重組牛堿性成纖維細胞生長因子干預(yù)治療，并分別于治療后第3、7、14天檢測并對比各組大鼠創(chuàng)面組織中BMP-7蛋白的表達水平以及脂肪細胞的生成情況。結(jié)果?（1）在治療的第3天、第7天、第14天，創(chuàng)面組織中BMP-7蛋白的表達水平組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），BMP-7蛋白的表達水平逐漸升高（第3天<第7天<第14天），組間對比：MEBO組、貝復(fù)濟組與慢創(chuàng)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），MEBO組與貝復(fù)濟組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。（2）隨著治療時間延長，脂肪細胞生成數(shù)逐漸增多（P<0.01），其中MEBO組、貝復(fù)濟組脂肪細胞生成數(shù)較慢創(chuàng)組多（P<0.05）。結(jié)論?濕潤燒傷膏可有效上調(diào)創(chuàng)面組織中BMP-7的表達水平，促進創(chuàng)面組織中脂肪細胞的生成。

【關(guān)鍵詞】?濕潤燒傷膏;慢性難愈合創(chuàng)面;BMP-7;脂肪細胞

中圖分類號：R642?文獻標志碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.09.003

體表慢性難愈合創(chuàng)面是指由多種原因引起的治療1個月以上仍未愈合且無明顯愈合傾向的創(chuàng)面[1]。慢性難愈合創(chuàng)面是外科常見疾病之一，因其治療周期長、難度大及費用高，往往造成患者巨大負擔(dān)。在創(chuàng)面修復(fù)過程中，往往伴隨著一系列復(fù)雜炎癥免疫反應(yīng)及內(nèi)環(huán)境變化，如：肌成纖維細胞在損傷部位遷移復(fù)位以及細胞外基質(zhì)沉積，而過度的細胞外基質(zhì)沉積往往造成疤痕愈合，疤痕愈合不僅影響美觀同時也影響機體的功能，因此尋找有效促進慢性難愈合創(chuàng)面愈合，并且減少疤痕產(chǎn)生的藥物成為臨床研究的熱點和難點[2]。目前研究表明，美寶濕潤燒傷膏（MEBO）可通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等多條信號通路促進創(chuàng)面愈合，但其對瘢痕修復(fù)的具體機制未完全闡明，而骨形成蛋白7（Bone morphogenetic protein 7，BMP-7）能夠通過拮抗轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）等信號通路抑制纖維化，從而抑制疤痕產(chǎn)生[1，3～4]。遂筆者通過觀察創(chuàng)面組織中BMP-7的表達情況，為揭示該藥物在促進創(chuàng)面愈合，減少疤痕產(chǎn)生的部分分子機制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?實驗材料

1.1.1?實驗動物

健康成年SPF級SD雄性大鼠54只購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，鼠齡12～14周，體重240～270 g，于屏障環(huán)境動物實驗室內(nèi)進行飼養(yǎng)、造模、取標本。本研究經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2?主要試劑

貝復(fù)濟（rb-bFGF，外用重組牛堿性成纖維細胞生長因子，國藥準字19991021，珠海億勝生物制藥有限公司生產(chǎn)）;濕潤燒傷膏（moist exposed burn ointment，MEBO，國藥準字Z20000004，汕頭市美寶制藥有限公司生產(chǎn)）;水合氯醛（CAS登記號302-17-0，泰興市豪申化工貿(mào)易有限公司生產(chǎn)）;醋酸氫化可的松注射液（國藥準字H31021290，上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)）;改良油紅O染色液（北京索萊寶科技有限公司，貨號20190423）;BMP-7一抗：Rabbit Anti-BMP7抗體[EPR5897]，分子量：49 kD，abcam，貨號ab129156，稀釋比例：1∶1000;二抗：山羊抗兔的二抗，北京中杉，貨號ZB2301，稀釋比例：1∶3000。

1.2?實驗方法

1.2.1?動物分組及模型建立

按照隨機數(shù)表將54只大鼠分為慢性難愈合創(chuàng)面組（慢創(chuàng)組）、MEBO濕潤燒傷膏組（MEBO組）和貝復(fù)濟組各18只，其中貝復(fù)濟組為陽性對照組。以水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/l00 g）及背部備皮后，用直徑為l.5 cm的圖章標記，并在無菌條件下沿標記分別于脊柱兩側(cè)各做深達筋膜層的全層皮膚缺損創(chuàng)面，建立全層皮膚缺損創(chuàng)面后，立即肌肉注射醋酸氫化可的松注射液（8 mg/100 g），使其形成慢性難愈合創(chuàng)面，創(chuàng)面常規(guī)消毒后，慢創(chuàng)組創(chuàng)面局部涂生理鹽水、MEBO組局部涂美寶濕潤燒傷膏、貝復(fù)濟組局部涂外用重組牛堿性成纖維細胞生長因子，并予無菌干紗布包扎固定，每天換藥2次[1，3]。

1.2.2?標本采集

分別于創(chuàng)面處理后第3天、第7天、第14天，從每組中隨機選取6只大鼠，取創(chuàng)面組織制作冰凍切片，余暫時存放于液氮中，并置于-80℃的冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3?Western blotting技術(shù)檢測BMP-7蛋白表達水平

取組織100 mg，置于冰面上，加入1 mL組織裂解液，予勻漿機將標本攪碎，15 000 r/min進行離心20 min，取上清，提取組織蛋白，檢測蛋白含量，并將蛋白變性后保存?zhèn)溆?將提取的蛋白上樣置于80 V恒壓下進行電泳，待條帶均勻后，在300 mA恒流下進行半干轉(zhuǎn)60 min，隨即室溫搖床封閉，并于4℃搖床內(nèi)孵育一抗過夜;一抗孵育后，用PBST洗膜三次，每次5 min，并加二抗室溫孵育l.5 h;二抗孵育后，用PBST洗膜三次，每次5 min，并于暗室內(nèi)曝光;最后用Image J圖像分析軟件對檢測結(jié)果進行灰度分析，樣本蛋白含量=目的條帶積分吸光度值/內(nèi)參條帶積分吸光度值[1，5]。

1.2.4?改良油紅O染色檢測脂肪細胞表達情況

取新鮮組織置于10%福爾馬林固定10 min后水洗，于冰凍切片機制成10 μm厚度切片，切片入蒸餾水沖洗，再入60%異丙醇浸洗20 s，入改良油紅O染色液中加蓋密閉染色10 min，然后入60%異丙醇分色，入蒸餾水稍沖洗，Mayer蘇木素染色液復(fù)染核2 min，入1%鹽酸分化10 s，蒸餾水沖洗多余染料，濾紙吸干水分，甘油明膠封片，最后用Imagepro plus圖像分析軟件對脂肪細胞計數(shù)。

1.3?統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，其中計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，并根據(jù)方差齊性檢驗結(jié)果采用LSD法或Games-Howell法進行組間對比，組間不同時項對比采用重復(fù)測量方差分析，檢驗水準：α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2?結(jié)果

2.1?三組大鼠創(chuàng)面組織內(nèi)BMP-7蛋白的表達水平對比

經(jīng)重復(fù)測量方差分析，組間干預(yù)因素以及不同觀察時項之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（干預(yù)方法為主效應(yīng)，F(xiàn)=26.52，P=0.01;以觀察時項為主效應(yīng)，F(xiàn)=71.01，P=0.001;兩者交互作用，F(xiàn)=4.35，P=0.21），在治療的第3天、第7天、第14天，創(chuàng)面組織中BMP-7蛋白的表達水平組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），BMP-7蛋白的表達水平逐漸升高（第3天<第7天<第14天），同一時項組間比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中MEBO組與貝復(fù)濟組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），BMP-7蛋白的表達水平，MEBO組=貝復(fù)濟組>慢創(chuàng)組。見表1。Western blotting法檢測BMP-7蛋白表達條帶見圖1。

2.2?三組大鼠創(chuàng)面組織油紅O切片中脂肪細胞數(shù)對比

在治療的第3天、第7天、第14天，創(chuàng)面組織油紅O切片中脂肪細胞數(shù)組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），脂肪細胞數(shù)逐漸升高（第3天<第7天<第14天），同一時項組間比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），其中MEBO組與貝復(fù)濟組脂肪細胞數(shù)第3天、第7天、第14天均明顯多于慢創(chuàng)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），第7天和第14天MEBO組脂肪細胞數(shù)多于貝復(fù)濟組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表2。大鼠創(chuàng)面組織的油紅O染色情況見圖2。

3?討論

創(chuàng)面愈合包括了細胞的遷移、增殖分化、炎癥反應(yīng)、細胞生長因子分泌、基質(zhì)沉積和血管形成等。在慢性難愈合創(chuàng)面愈合過程中，損傷炎癥刺激后，成纖維細胞在趨化因子的作用下進入創(chuàng)口并分裂增殖，成纖維細胞的增殖和膠原的沉積有利于創(chuàng)面的愈合，但長期過度增殖和過多的膠原沉積往往導(dǎo)致增生性瘢痕形成，修復(fù)的瘢痕不僅影響美觀，而且彈性較差、汗液蒸發(fā)緩慢、近關(guān)節(jié)處瘢痕易限制關(guān)節(jié)活動等一系列問題影響了組織的功能[6]。

因虛感邪，邪氣致瘀，瘀阻傷正，化腐致?lián)p是慢性難愈合創(chuàng)面病情演變特點之一，隨著對慢性難愈合創(chuàng)面了解的不斷深入，近年來越來越多中醫(yī)療法應(yīng)用于慢性難愈合創(chuàng)面的治療，其中又以中醫(yī)外治法效果最為顯著[3，7]。MEBO由黃連、黃柏、黃芩、地龍、罌粟殼為主要成分，目前研究表明，MEBO所含的低分子蛋白質(zhì)、脂肪和糖等營養(yǎng)物質(zhì)，可直接作用于潰瘍創(chuàng)面，并在局部被組織吸收，為創(chuàng)面組織的再生修復(fù)提供營養(yǎng)原料，加快創(chuàng)面的愈合，此外，MEBO干預(yù)治療能通過調(diào)控ERK1/2和p38的傳導(dǎo)信號通路明顯提高創(chuàng)面肉芽組織VEGF、bFGF、EGF基因及蛋白表達，從而加速成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞的增殖分化，調(diào)節(jié)創(chuàng)面修復(fù)基質(zhì)的形成，促進肉芽組織生長及肉芽組織在創(chuàng)面的填充，促進創(chuàng)面成纖維細胞增殖和毛細血管再生，最終加快創(chuàng)面愈合的進程，減少創(chuàng)面疤痕的產(chǎn)生[1，8～9]。因其療效顯著，皮膚再生醫(yī)療技術(shù)（MEBT/MEBO）已納入國家規(guī)劃教材《中西醫(yī)結(jié)合外科學(xué)》，同時制定相關(guān)臨床應(yīng)用規(guī)范，廣泛應(yīng)用于臨床慢性難愈合創(chuàng)面的治療[10]。

BMP-7是BMP家族中的成員之一，是一種分泌型多功能蛋白，BMP-7最初被認為具有促進骨形成的作用，但近年研究發(fā)現(xiàn)，BMP-7與多種疾病的抗纖維化作用有關(guān)。BMP-7因具有抑制纖維化、促進皮膚發(fā)育等功能，故BMP-7在創(chuàng)面修復(fù)中可能起到促進再生，減少疤痕愈合的作用。Smad依賴途徑在調(diào)控纖維化中具有重要作用，BMP-7通常與受體結(jié)合并使之發(fā)生磷酸化后發(fā)揮作用。當受體磷酸化后，可作用于下游的Smad蛋白并與不同的Smad蛋白結(jié)合形成相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物，從而進入到細胞核內(nèi)作用于特定基因序列，發(fā)揮抗纖維效應(yīng)[11]。Guo等人[12]研究證實，外源性給予BMP-7干預(yù)，可減少瘢痕組織中膠原沉積和纖維化蛋白的表達，且呈時間和劑量依賴型。在本研究中，創(chuàng)面形成的第3天，慢創(chuàng)組BMP-7蛋白的表達量低于MEBO組和貝復(fù)濟組，隨著時間延長，在創(chuàng)面形成的第7天和第14天，各組的BMP-7蛋白的表達逐漸上升，MEBO組和貝復(fù)濟組表達量高于慢創(chuàng)組，提示美寶濕潤燒傷膏和貝復(fù)濟均能促進創(chuàng)面中BMP-7蛋白的表達。

在人皮膚中，BMP-7蛋白主要表達在表皮、真皮乳頭層和毛囊外結(jié)構(gòu)，其中在皮脂腺、汗腺、立毛肌和血管中顯著表達，同時BMP-7蛋白的分布又隨毛發(fā)周期改變而改變，提示BMP-7可能參與皮膚發(fā)育和功能的調(diào)節(jié)[13～14]。在創(chuàng)面愈合過程中，組織的再生需要新生毛囊，趨化因子通過激活骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進成纖維細胞轉(zhuǎn)化成脂肪細胞，從而促進毛囊的生成，促進再生。在本研究中，創(chuàng)面組織中的脂肪細胞隨時間延長，數(shù)量增多，而在同一時項，MEBO組和貝復(fù)濟的脂肪細胞生成數(shù)多于慢創(chuàng)組，提示美寶濕潤燒傷膏能有效促進創(chuàng)面組織中脂肪細胞的生成，脂肪細胞充分填充皮下纖維結(jié)締組織，有利于減少成纖維細胞的沉積，從而減輕創(chuàng)面疤痕修復(fù)。

綜上所述，我們猜測，MEBO可能通過上調(diào)創(chuàng)面中BMP-7蛋白的表達，從而促進創(chuàng)面組織中脂肪細胞的生成，減少成纖維細胞的沉積，減少疤痕產(chǎn)生，促進創(chuàng)面的再生。但信號通路調(diào)控與創(chuàng)面修復(fù)的關(guān)系是相當復(fù)雜的，不同通路的激活與拮抗貫穿了修復(fù)與再生的整個過程，而瘢痕組織的過度增生也與免疫炎癥反應(yīng)有著密切的聯(lián)系，本研究中只顯示美寶濕潤燒傷膏能夠有效激活創(chuàng)面組織中BMP-7的表達以及脂肪細胞的生成，但其具體是如何調(diào)控下游信號通路仍需進一步研究。

參?考?文?獻

[1] 葛斌，李利青，唐乾利，等.皮膚再生醫(yī)療技術(shù)對大鼠慢性難愈合創(chuàng)面組織中VEGFR-2表達的動態(tài)調(diào)控作用[J].中國燒傷創(chuàng)瘍雜志，2017，29（6）：399-405.

[2] 曾鴻孟，唐乾利.體表慢性難愈合創(chuàng)面的研究進展[J].中國燒傷創(chuàng)瘍雜志，2016，28（5）：340-344.

[3] 李利青，林也，葛斌，等.濕潤暴露療法/濕潤燒傷膏干預(yù)PI3K-Akt-mTOR信號通路促進體表慢性難愈合創(chuàng)面修復(fù)的實驗研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2019，39（5）：583-590.

[4] Meurer SK，Esser M，Tihaa L，et al.BMP-7/TGF-β1 signalling in myoblasts：Components involved in signalling and BMP-7-dependent blockage of TGF-β-mediated CTGF expression[J].European Journal of Cell Biology，2012，91（6-7）：450-463.

[5] 舒清峰，陳端凱，唐乾利，等.MEBT/MEBO對慢性難愈合創(chuàng)面組織中CK10表達水平的影響[J].中國燒傷創(chuàng)瘍雜志，2019，31（2）：77-86.

[6] Limandjaja GC，van den Broek LJ，Waaijman T，et al.Reconstructed human keloid models show heterogeneity within keloid scars[J].Archives of Dermatological Research，2018，310（10）：815-826.

[7] 張云杰.中醫(yī)藥治療慢性皮膚潰瘍研究概況[J].山東中醫(yī)雜志，2014，33（12）：1040-1042.

[8] 唐乾利.皮膚再生醫(yī)療技術(shù)的基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用進展[C]//中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會燒傷專業(yè)委員會，中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會.第15屆全國燒傷創(chuàng)瘍學(xué)術(shù)會議論文匯編：2018：9.

[9] 吳標良.基于MEBT/MEBO的ERK1/2和p38信號通路與糖尿病足免疫表達關(guān)系[C]//中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會燒傷專業(yè)委員會，中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會.第十四屆全國燒傷創(chuàng)瘍學(xué)術(shù)會議暨第二屆國際燒傷創(chuàng)瘍學(xué)術(shù)會議論文匯編：2016：4.

[10]何清湖.全國中醫(yī)藥行業(yè)高等教育“十三五”國家規(guī)劃教材《中西醫(yī)結(jié)合外科學(xué)》[M].3版.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2016：309-310.

[11]Cervantes-Garcia D，Cuellar-Juarez A，Borrego-Soto G，et al.Adenoviral-bone morphogenetic protein-7 and/or doxazosin therapies promote the reversion of fibrosis/cirrhosis in a cirrhotic hamster model[J].Molecular Medicine Reports，2017，16（6）：9431-9440.

[12]Guo J，Lin Q，Shao Y，et al.BMP 7 suppresses excessive scar formation by activating the BMP 7/Smad1/5/8 signaling pathway[J].Molecular Medicine Reports，2017，16（2）：1957-1963.

[13]Adly MA，Assaf HA，Hussein MR.Expression of bone morphogenetic protein-7 in human scalp skin and hair follicles[J].British Journal of Dermatology，2010，154（3）：551-554.

[14]Plikus MV，Guerrero-Juarez CF，Ito M，et al.Regeneration of fat cells from myofibroblasts during wound healing[J].Science，2017，355（6326）：748-752.

（收稿日期：2019-07-11?修回日期：2019-09-10）

（編輯：潘明志）