張 亮 侯婷婷 田學(xué)宗 劉 鑫 梁成云 許海林 崔泰花 李官浩

(1. 延邊大學(xué)食品研究中心，吉林 延吉 133000；2. 北京尚德在線教育有限公司，北京 100193； 3. 龍井長(zhǎng)白山犇福清真肉業(yè)有限公司，吉林 延吉 133000)

應(yīng)激是指動(dòng)物受到體內(nèi)外非特異性的、異常的、不良的脅迫因子刺激或長(zhǎng)期作用時(shí)，會(huì)引起非特異性、生理性緊張狀態(tài)的反應(yīng)，并由此引起各種機(jī)能和代謝改變，來(lái)提高機(jī)體的適應(yīng)能力和維持內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定[1]。肉牛屠宰放血后為了維持肌肉結(jié)構(gòu)完整、保持一定溫度和彈性仍需消耗ATP，加上屠宰時(shí)異?？謶趾童d孿，肌肉激烈收縮使ATP分解，宰后胴體肌細(xì)胞又過(guò)多地消耗ATP，糖原酵解加強(qiáng)，產(chǎn)生大量乳酸使pH值迅速下降，導(dǎo)致肌內(nèi)膜變性、崩裂，肌外膜組織脆弱，致密性下降，肌球蛋白變性，持水性降低，肌紅蛋白隨水分大量流失，進(jìn)而產(chǎn)生劣質(zhì)肉[2]。劣質(zhì)肉不僅口感差、貨價(jià)期短、不適宜深度加工，而且由于色澤異常很難被消費(fèi)者接受，降低了肉生產(chǎn)的附加值，影響經(jīng)濟(jì)效益。因此，降低動(dòng)物宰前應(yīng)激對(duì)改善肉質(zhì)有重要的作用。

磷酸鹽是應(yīng)用最為廣泛的食品添加劑之一。目前已有大量研究[3-5]表明，磷酸鹽可作為品質(zhì)改良劑應(yīng)用于肉制品當(dāng)中。磷酸鹽在肉類加工中的主要作用有：保水、助滲透以及殺菌等，其中最主要的是保水作用。在肉品質(zhì)研究中，可運(yùn)用“蛋白質(zhì)組學(xué)”來(lái)尋找預(yù)測(cè)肉嫩度的標(biāo)記蛋白質(zhì)[6]，現(xiàn)已證實(shí)：肌鈣蛋白(Troponin)、肌間線蛋白(Desmin)、半肌動(dòng)蛋白(Nebulin)、肌聯(lián)蛋白(Titin)等蛋白與肌肉嫩度相關(guān)[7]。其中Troponin-T作為一種可調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，與Troponin-Ⅰ亞基和Troponin-C亞基共同形成鈣離子敏感調(diào)控開(kāi)關(guān)，可以調(diào)節(jié)橫紋肌的伸長(zhǎng)與收縮[8-9]。在延邊黃牛肉品質(zhì)的研究中，已有學(xué)者采用蛋白質(zhì)組學(xué)來(lái)研究其對(duì)肉品質(zhì)的影響[10]，相比之下，通過(guò)Desmin和Troponin-T的表達(dá)量來(lái)探究延邊黃牛宰前飲用復(fù)合磷酸鹽水來(lái)緩解宰前應(yīng)激的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

試驗(yàn)擬將延邊黃牛分為4組，對(duì)照組飲用自來(lái)水，試驗(yàn)組(A、B、C)分別飲用濃度為0.05%，0.10%，0.15%的復(fù)合磷酸鹽水。研究其對(duì)延邊黃牛肉品質(zhì)指標(biāo)、血清生化指標(biāo)及相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響，以確定復(fù)合磷酸鹽的適宜添加量，為降低延邊黃牛宰前應(yīng)激及改善肉質(zhì)的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

延邊黃牛：延邊朝鮮族自治州龍井市犇福牧場(chǎng)；

焦磷酸鈉、三聚磷酸鈉、六偏磷酸鈉：食品級(jí)，市售；

牛皮質(zhì)醇(COR)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、牛促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、BCA濃度測(cè)定試劑盒：索萊寶生物科技有限責(zé)任公司；

鉬酸銨、磷酸二氫鉀、甲醛、尿素、硫脲、丙磺酸、二硫蘇糖醇等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀：ELx800型，美國(guó)Bio-TECK有限公司；

旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)：RM2255型，上海醫(yī)療器械廠；

攤片機(jī)：KD-P型，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；

烘片機(jī)：KD-H型，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；

多功能顯微鏡：OLMPUS型，日本OLMPUS光學(xué)株式會(huì)社；

電泳儀：164-5050型，美國(guó)伯樂(lè)公司；

蛋白轉(zhuǎn)印儀：BIO-RAD型，美國(guó)伯樂(lè)公司；

化學(xué)發(fā)光成像儀：Alliance型，英國(guó)UVItec公司；

電子天平：FA1104N型，上海精密科學(xué)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)分組 試驗(yàn)分組如表1所示，復(fù)合磷酸鹽水為焦磷酸鈉∶三聚磷酸鈉∶六偏磷酸鈉=1∶5∶14(質(zhì)量比)復(fù)合得到。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物分組情況

1.2.2 血樣采集 延邊黃牛宰前禁食禁水期間，用抗凝采血管(EDTA)采集延邊黃牛頸靜脈新鮮血液適量，并在采血管空白處進(jìn)行標(biāo)號(hào)。需將抗凝采血管勻速搖晃，以使血液能夠與采血管中的抗凝劑充分接觸，在4 ℃，3 000 r/min 下離心10 min，收集上清分裝于滅菌的1.5 mL 離心管中，并于-20 ℃冰箱中保存，以備指標(biāo)測(cè)定分析。

1.2.3 牛皮質(zhì)醇(COR)含量的測(cè)定 采用牛皮質(zhì)醇酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。

1.2.4 牛促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)含量的測(cè)定 采用牛促腎上腺皮質(zhì)激素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。

1.2.5 血液生化指標(biāo)的測(cè)定 采用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行血液生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.6 肌纖維結(jié)構(gòu)的測(cè)定 將切取的肉塊用10%中性福爾馬林水溶液固定，將固定好的肉樣修整結(jié)束后，進(jìn)行脫水處理。處理好的肉樣用石蠟包埋，而后進(jìn)行切片、攤片、烘干，最后染色，并使用顯微鏡觀察。

1.2.7 肌纖維組織學(xué)性狀測(cè)定(直徑、表面積、周長(zhǎng)) 采用HE染色法對(duì)切片進(jìn)行染色，將染好色的切片置于顯微鏡下觀察，用圖像處理軟件CellSens Entry，選擇多邊形選項(xiàng)對(duì)各個(gè)形狀進(jìn)行測(cè)定和記錄。

1.2.8 總蛋白的裂解 將400 μL裂解液與4 μL蛋白酶抑制劑裝于1.5 mL離心管內(nèi)，置于冰上。切取適量組織(約200 mg)投入研缽中加入適當(dāng)液氮研磨，取適量于上述裂解液中，置于冰塊上15 min。在超聲機(jī)20%功率(100 W)下超聲，超聲2 s停止8 s，共超聲10 min。將超聲完的樣品在4 ℃下離心10 min，離心轉(zhuǎn)數(shù)為13 000 r/min。離心后的上清液即為所需全蛋白。蛋白提取液在超低溫冰箱-80 ℃下保存。

1.2.9 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定 采用BCA濃度試劑盒。

1.2.10 Western Blot檢測(cè) 將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，取出條帶加入ECL超敏發(fā)光液，用凝膠成像儀進(jìn)行CCD掃描。

1.2.11 數(shù)據(jù)處理方法 所有試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)的基本整理采用WPS 2018款最新軟件；采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，并采用鄧肯檢驗(yàn)法標(biāo)記差異顯著性，分析結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05為結(jié)果差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)血清中ACTH、COR含量的影響

ACTH和COR濃度是評(píng)價(jià)應(yīng)激程度的重要指標(biāo)，一般而言應(yīng)激程度越大，ACTH和COR濃度越高。復(fù)合磷酸鹽處理對(duì)延邊黃牛血清中的ACTH含量影響如圖1所示，對(duì)照組ACTH含量顯著高于試驗(yàn)組(P<0.05)，3個(gè)試驗(yàn)組間ACTH含量無(wú)顯著差異(P>0.05)，其中試驗(yàn)組B的含量最低，為(14.93±2.35) pg/mL。復(fù)合磷酸鹽處理對(duì)延邊黃牛血清中的COR含量影響如圖2所示，對(duì)照組的COR含量顯著高于試驗(yàn)組(P<0.05)，各試驗(yàn)組之間的COR含量差異顯著(P<0.05)，其中試驗(yàn)組A的COR含量最低，為(26.29±4.70) ng/mL。

柴進(jìn)等[11]在宰前應(yīng)激對(duì)豬肉質(zhì)的影響及其機(jī)制研究中也闡述了應(yīng)激對(duì)HPA的影響，說(shuō)明了ACTH和COR的相互作用，當(dāng)COR分泌時(shí)反過(guò)來(lái)又抑制CRF和ACTH的釋放。試驗(yàn)結(jié)果顯示試驗(yàn)組的ACTH和COR濃度均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明在宰前飲用復(fù)合磷酸鹽水后會(huì)減少宰前應(yīng)激并降低血液中COR和ACTH濃度。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 1 Effect of compound phosphate treatment on content of ACTH in Yanbian cattle blood

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 2 Effect of compound phosphate treatment on content of COR in Yanbian cattle blood

2.2 對(duì)血清激素和酶的影響

復(fù)合磷酸鹽處理對(duì)延邊黃牛肉血清生化指標(biāo)的影響如表1所示。血清酶的最主要來(lái)源是動(dòng)物的特定組織器官，其活性高低與相應(yīng)組織器官的代謝能力和功能狀態(tài)有著直接的關(guān)系[12]。當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體的承受能力會(huì)被打破，機(jī)體的內(nèi)環(huán)境及一些組織如心臟、肝臟、脾臟、腎、肌肉、淋巴和免疫器官不可避免地遭受病理性損傷和破壞，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化致使血清酶的含量發(fā)生變化[13]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組的CK含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，試驗(yàn)組B和C的LDH含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。仲慶振等[14]研究表明在宰前應(yīng)激存在情況下，血液中的CK和LDH含量會(huì)顯著提高，其原因是宰前應(yīng)激過(guò)度消耗了機(jī)體能量導(dǎo)致心肌受到一定損傷，破壞細(xì)胞膜。血糖作為體內(nèi)代謝過(guò)程的重要物質(zhì)，可以反映機(jī)體的能量變化[15]。在應(yīng)激狀態(tài)下，使機(jī)體的HPA軸興奮增強(qiáng)，提高糖原酵解速度，從而提供葡萄糖作為能量同時(shí)也能夠剌激肌肉、淋巴以及結(jié)締組織中的糖異生作用，導(dǎo)致血糖升高。試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組的GLU含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，3個(gè)試驗(yàn)組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。Hana等[16]表明在應(yīng)激狀態(tài)下時(shí)，體能消耗增大同時(shí)也增加了血液中的GLU含量來(lái)適應(yīng)應(yīng)激，其研究結(jié)論與韓瑾瑾等[17]的一致。AST含量最多的是心肌、其次為肝臟和骨骼肌，應(yīng)激會(huì)使AST含量升高，可能是由于應(yīng)激時(shí)心肌收縮力加強(qiáng)，血液循環(huán)加速，心肌細(xì)胞代謝加強(qiáng)，使其更新或受損加快所致[18]。Pérez等[19]研究發(fā)現(xiàn)，豬血液中的活性在經(jīng)歷運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激后也會(huì)明顯升高。試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組的AST含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其中試驗(yàn)組B的AST含量最低。ALP廣泛存在于組織和體液中[20]，李鵬飛等[21]對(duì)黃芪多糖粉和銀黃粉緩解羊運(yùn)輸應(yīng)激的研究表明，各種應(yīng)激原的作用使得羊骨骼和肌肉受到損傷致使ALP進(jìn)入血液，加上長(zhǎng)時(shí)間的禁食禁水也會(huì)對(duì)小尾寒羊膽汁的生成和分泌造成影響，使得血液中ALP含量升高。試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組的TP和CHO含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)組A的ALP和TG含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，試驗(yàn)組B和C均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。以上試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，宰前飲用復(fù)合磷酸鹽水能夠降低在宰前應(yīng)激存在情況下機(jī)體組織的受損程度，且降低血清中相關(guān)酶的含量，同時(shí)也證明了宰前飲用水中添加復(fù)合磷酸鹽對(duì)減少宰前應(yīng)激有一定作用，其中試驗(yàn)組B效果最佳。

表2 復(fù)合磷酸鹽處理對(duì)延邊黃牛血清激素和酶的影響?

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 對(duì)血清無(wú)機(jī)離子的影響

復(fù)合磷酸鹽處理對(duì)延邊黃牛血清無(wú)機(jī)離子指標(biāo)的影響如表3所示。血清中的無(wú)機(jī)鹽離子在機(jī)體血液中起到了至關(guān)重要的作用，能夠維持血液滲透壓、血漿酸堿平衡以及機(jī)體正常生命活動(dòng)[22]。總結(jié)有關(guān)應(yīng)激對(duì)無(wú)機(jī)離子指標(biāo)的影響發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激對(duì)血清中無(wú)機(jī)離子指標(biāo)的影響尚沒(méi)有明確變化規(guī)律。Mota-Rojas等[23]研究發(fā)現(xiàn)，釆用CO2擊暈應(yīng)激會(huì)升高血液中K+的濃度，但Pérez等[19]研究發(fā)現(xiàn)屠宰應(yīng)激不會(huì)引起血液中的K+含量變化。試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組A和C的Na+與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，試驗(yàn)組B的含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，K+和Ca2+含量無(wú)顯著差異(P>0.05)，均處于家畜的正常范圍。試驗(yàn)組B有最低的Na+和Cl-且顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。以上試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，宰前飲用復(fù)合磷酸鹽水對(duì)延邊黃牛血清無(wú)機(jī)離子指標(biāo)無(wú)顯著影響，而離子指標(biāo)間的差異還需進(jìn)一步研究。

2.4 對(duì)肌纖維結(jié)構(gòu)的影響

由表4可知，對(duì)照組的肌纖維面積顯著高于試驗(yàn)組B(P<0.05)，與試驗(yàn)組A和C的無(wú)顯著差異(P>0.05)。對(duì)照組的肌纖維周長(zhǎng)顯著高于試驗(yàn)組B(P<0.05)，與試驗(yàn)組A和C的無(wú)顯著性差異(P>0.05)；試驗(yàn)組C的肌纖維周長(zhǎng)顯著高于試驗(yàn)組A和B(P<0.05)。對(duì)照組的肌纖維直徑顯著高于試驗(yàn)組B和C(P<0.05)，與試驗(yàn)組A的無(wú)顯著性差異(P>0.05)。貯藏初期肌纖維結(jié)構(gòu)觀察圖(200倍)見(jiàn)圖3。

表3復(fù)合磷酸鹽處理對(duì)延邊黃牛血清無(wú)機(jī)離子指標(biāo)的影響?

Table3EffectofcompoundphosphatetreatmentonbloodbiochemicalionindexofYanbiancattle mmol/L

組別Ca2+K+Cl-Na+對(duì)照組2.03±0.0515.30±0.27102.40±1.05a137.57±0.67a試驗(yàn)組A1.96±0.0715.42±0.17102.30±0.50a138.40±1.14a試驗(yàn)組B2.08±0.0815.44±0.3999.27±0.93b135.87±0.23b試驗(yàn)組C1.98±0.0715.64±0.89102.73±0.60a138.03±0.83a

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

肌組織學(xué)與肉品質(zhì)密切相關(guān)。研究[13]表明，肌纖維的密度越大，直徑和面積越小，肉質(zhì)越鮮嫩；肌纖維的密度越小，直徑和面積越大，肉質(zhì)越差，這是由于肌原纖維越粗締合越牢固越難斷裂。應(yīng)激會(huì)對(duì)肉質(zhì)品肌纖維直徑和面積有一定影響，影響機(jī)制為應(yīng)激使肉牛肌肉組織中糖原含量減少，產(chǎn)生乳酸減少pH值升高，內(nèi)源性組織蛋白酶活性受到抑制，減緩了成熟過(guò)程中肌膜的溶解速率，導(dǎo)致肌纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[20]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組的肌纖維面積和直徑均低于對(duì)照組，其中試驗(yàn)組B的面積和直徑顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。以上試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，宰前飲用復(fù)合磷酸鹽水對(duì)延邊黃牛肉貯藏初期肌纖維組織學(xué)特性有一定改善作用，其中試驗(yàn)組B效果最顯著。從貯藏初期肌纖維結(jié)構(gòu)觀察圖可以看出，試驗(yàn)組肌束之間的擴(kuò)散程度均小于對(duì)照組，可能是宰前飲用復(fù)合磷酸鹽水，減少了肌組織內(nèi)部的能量消耗造成的。

表4復(fù)合磷酸鹽處理對(duì)貯藏初期延邊黃牛肉肌纖維結(jié)構(gòu)的影響?

Table4EffectofcompoundphosphatetreatmentonmusclefiberstructureofYanbiancattleinearlystorage

組別肌纖維面積/μm2肌纖維周長(zhǎng)/μm肌纖維最小直徑/μm對(duì)照組1 630.55±154.44a166.70±11.57ab137.57±0.67a試驗(yàn)組A1 606.53±128.68a160.50±9.93b138.40±1.14a試驗(yàn)組B1 477.30±155.38b151.50±10.78c135.87±0.23b試驗(yàn)組C1 599.37±140.41a169.60±11.15a138.03±0.83a

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

圖3 貯藏初期肌纖維組織結(jié)構(gòu)圖

2.5 對(duì)Troponin-T表達(dá)量的影響

由圖4可知，外脊和眼肉的試驗(yàn)組C無(wú)明顯的目的條帶，其余3組有較為明顯的目的條帶。肌鈣蛋白與肉的嫩度之間有直接的關(guān)系，但其作用機(jī)理還不明確需要進(jìn)一步的研究。Troponin-T可以起到調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白之間的相互作用，它與原肌球蛋白一起調(diào)節(jié)肌肉收縮時(shí)的細(xì)絲，同時(shí)還促進(jìn)I帶中細(xì)絲的損壞，Troponin-T的降解有利于提高肉的嫩度。Lametsch等[24]認(rèn)為38 kDa 的Troponin-T在宰后積累升高。研究[25]表明，Troponin-T是內(nèi)源性μ-鈣激活酶的作用底物，被降解后會(huì)引起肌纖維粗絲和細(xì)絲的相互作用的損壞，并增加肌原纖維的小片化，其降解產(chǎn)物的生產(chǎn)量可以很好地反映肉的嫩度。試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組的Troponin-T目的條帶較試驗(yàn)組更為清晰，說(shuō)明對(duì)照組的Troponin-T的表達(dá)量高于試驗(yàn)組，同時(shí)隨著復(fù)合磷酸鹽水濃度的增加其蛋白表達(dá)量逐漸降低。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，宰前飲用復(fù)合磷酸鹽水會(huì)降低宰后初期Troponin-T的含量，會(huì)對(duì)延邊黃牛肉品質(zhì)產(chǎn)生影響。

2.6 對(duì)Creatine Kinase 表達(dá)量的影響

如圖5所示，在外脊中試驗(yàn)組有較為明顯的目的條帶，其中試驗(yàn)組A和C較試驗(yàn)組B的目的條帶清晰，對(duì)照組無(wú)目的條帶。在眼肉中，對(duì)照組和試驗(yàn)組C無(wú)明顯條帶，試驗(yàn)組A和B有較為清晰條帶，其中試驗(yàn)組A顏色較試驗(yàn)組B的深。試驗(yàn)結(jié)果顯示，延邊黃牛外脊中試驗(yàn)組的Creatine Kinase表達(dá)量高于對(duì)照組，延邊黃牛眼肉中試驗(yàn)組A和B有較高的蛋白表達(dá)量，說(shuō)明宰前飲用復(fù)合磷酸鹽水可提高延邊黃牛肉中Creatine Kinase的表達(dá)量，來(lái)減少宰前應(yīng)激所帶來(lái)的能量消耗。

Ⅰ. 對(duì)照組 Ⅱ. 試驗(yàn)組A Ⅲ. 試驗(yàn)組B Ⅳ. 試驗(yàn)組C

Figure 4 Effect of compound phosphate treatment on troponin-t expression of Yanbian yellow beef rib and rib-eye steak

Ⅰ. 對(duì)照組 Ⅱ. 試驗(yàn)組A Ⅲ. 試驗(yàn)組B Ⅳ. 試驗(yàn)組C

Figure 5 Effect of compound phosphate treatment on Creatine Kinase expression of Yanbian cattle rib and rib eye steak

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明：宰前飲用復(fù)合磷酸鹽水對(duì)改善延邊黃牛宰后的血液生化指標(biāo)有顯著作用，可在一定程度上減少宰前應(yīng)激并可一定程度地降低延邊黃牛肉的肌纖維面積和周長(zhǎng)，降低宰后Troponin-T表達(dá)量，提高Creatine Kinase表達(dá)量有顯著作用。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果分析，宰前飲用0.10%的復(fù)合磷酸鹽水效果最佳。