黎雁澤 陳夏菁 張士昂 徐 磊

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

目前，多數(shù)人群處于亞健康狀態(tài)，主要原因是膳食、腸道菌群失衡的共同影響[1-4]，如菌群多樣性降低、單一化等，便會(huì)使有害菌數(shù)量增加[5-6]，菌群結(jié)構(gòu)改變同樣可導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生免疫抑制，對(duì)環(huán)境應(yīng)激能力下降，進(jìn)而引發(fā)代謝問題，如便秘、過度肥胖、糖尿病、腫瘤、心血管疾病、結(jié)腸癌等[7-8]。

青春雙歧桿菌作為一種益生菌，可治療慢性腹瀉、便秘，還具有抗衰老作用。可以使人體腸道內(nèi)酸性增強(qiáng)，減少有害菌群數(shù)量，調(diào)節(jié)腸道菌群向良性方向發(fā)展[9]。青春雙歧桿菌在腸道中起到了生物屏障的作用，供給營養(yǎng)，促進(jìn)代謝[10-11]；代謝產(chǎn)物主要是乙酸和乳酸，還可產(chǎn)生多種有機(jī)酸，如丙酸、異丁酸和丁酸等短鏈脂肪酸[12]，青春雙歧桿菌的代謝物和抗菌物質(zhì)對(duì)致病菌有著很強(qiáng)的拮抗作用[13]。腸道菌群在正常情況下可以保持相對(duì)平衡，在失衡情況下功能性低聚糖可以改善腸道菌群。有研究[14]證明，持續(xù)攝入低聚糖短期內(nèi)可大量繁殖益生菌并抑制有害菌，幫助腸道恢復(fù)原有平衡狀態(tài)。近年來國內(nèi)外學(xué)者向無害、無毒的益生菌制劑方向展開研究，目的就是為了獲得能夠維持腸道內(nèi)菌群平衡的益生菌產(chǎn)品[15-16]。

青春雙歧桿菌是一種嚴(yán)格厭氧菌，這使其在益生菌發(fā)酵產(chǎn)品的應(yīng)用方面存在局限。目前有關(guān)青春雙歧桿菌的研究主要集中在青春雙歧桿菌生長條件的優(yōu)化、青春雙歧桿菌抑菌機(jī)理等方面，而對(duì)青春雙歧桿菌耐氧馴化前后生理特性的變化及其對(duì)青春雙歧桿菌增殖因子的影響等方面的研究還未見報(bào)道。試驗(yàn)擬以青春雙歧桿菌(ATCC 15703)為出發(fā)菌種，通過對(duì)馴化前后青春雙歧桿菌各項(xiàng)指標(biāo)的測定和不同低聚糖對(duì)青春雙歧桿菌增殖效果的影響，探討青春雙歧桿菌在耐氧馴化前后的變化情況，旨在為青春雙歧桿菌的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種來源

青春雙歧桿菌(ATCC15703)：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉、MRS培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)公司；

低聚木糖、木聚糖、D-木糖、半胱氨酸鹽酸鹽：北京陸橋生物技術(shù)公司；

葡萄糖、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二胺、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫80、NaOH、HCl等：分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠；

CMRS培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基中加入0.01%的半胱氨酸鹽酸鹽制得；

改良MRS培養(yǎng)基：基于MRS培養(yǎng)基用大豆低聚糖、低聚麥芽糖、低聚木糖分別等量代替MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖而制得。

1.1.3 儀器設(shè)備

紫外—可見光分光光度計(jì)：A360型，上海翱藝儀器有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：LDZM-80KCS型，上海甲安醫(yī)療器械廠；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DNP-9052型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DHG-9145A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

離心機(jī)：H1650-W型，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

厭氧培養(yǎng)箱：YQX-Ⅱ型，上海新苗儀器有限公司；

厭氧培養(yǎng)盒：2.5 L，日本三菱氣體化工有限公司；

pH計(jì)：PHS-C型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；

高效液相色譜：U3000型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 青春雙歧桿菌的活化 將厭氧青春雙歧桿菌在MRS培養(yǎng)基中活化，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，之后繼續(xù)在厭氧條件下連續(xù)傳3代，活化后的青春雙歧桿菌進(jìn)行耐氧馴化。

1.2.2 青春雙歧桿菌的馴化 將活化后的青春雙歧桿菌先在厭氧條件下連續(xù)傳代，而后通過逐步增加液體培養(yǎng)基中的氧分壓，使青春雙歧桿菌漸漸適應(yīng)有氧環(huán)境。具體操作：取存于螺口試管液深10 cm的CMRS培養(yǎng)基，接種10 μL青春雙歧桿菌菌液，37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h；取菌液10 μL接種于液深16 cm的MRS培養(yǎng)基，37 ℃下有氧培養(yǎng)24 h；之后取菌液10 μL接種于液深10 cm的CMRS培養(yǎng)基，37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h；再取菌液10 μL接種于液深13 cm的MRS培養(yǎng)基，37 ℃下有氧培養(yǎng)24 h；之后取菌液10 μL接種于液深10 cm的CMRS培養(yǎng)基，37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h；再取菌液10 μL接種于液深10 cm的MRS培養(yǎng)基，37 ℃下有氧培養(yǎng)24 h；如此反復(fù)5次，最后將有氧培養(yǎng)下液深10 cm的MRS培養(yǎng)基連續(xù)傳代培養(yǎng)，得耐氧馴化青春雙歧桿菌。

1.2.3 菌株特性檢測

(1) 革蘭氏染色和鏡檢：參考張苓花等[17]的方法，對(duì)馴化過程中的青春雙歧桿菌采用革蘭氏染色法和鏡檢，觀察菌體的大小、顏色、分叉狀態(tài)等是否符合雙歧桿菌屬的基本形態(tài)特征。

(2) 青春雙歧桿菌菌液吸光度的測定：用紫外—可見分光光度計(jì)在600 nm波長下測定青春雙歧桿菌菌液吸光度，記錄青春雙歧桿菌馴化過程中吸光度的變化情況。

(3) 測定青春雙歧桿菌菌液pH值：用pH計(jì)對(duì)青春雙歧桿菌馴化過程中的pH值進(jìn)行測定。

(4) 青春雙歧桿菌的菌體形態(tài)和16S rRNA測序鑒定：對(duì)青春雙歧桿菌進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢，觀察馴化前后的菌體形態(tài)變化，同時(shí)對(duì)其16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增[18]，擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行測序和對(duì)比分析。

1.2.4 菌液有機(jī)酸含量測定 取馴化前后青春雙歧桿菌培養(yǎng)液，10 000×g離心5 min，取上清液，過0.22 μm濾膜后進(jìn)樣，色譜柱為syncronis C18，Dim 250 mm×4.6 mm，5 μm，梯度淋洗程序共持續(xù)30 min，前10 min和后3 min的流動(dòng)相為2%的乙腈和98%的磷酸二氫鉀水溶液(流速0.5 mL/min)，10～27 min時(shí)流動(dòng)相為20%的乙腈和80%的磷酸二氫鉀水溶液(流速0.8 mL/min)，柱溫30 ℃，在210 nm波長下檢測吸收峰[19]。

1.2.5 還原糖含量測定 采用DNS比色法，在紫外分光光光度計(jì)560 nm波長下作出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得青春雙歧桿菌培養(yǎng)液中還原糖的含量[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐氧馴化前后青春雙歧桿菌的吸光度和pH值

2.1.1 菌液吸光度 由表1可以看出，馴化前的青春雙歧桿菌在有氧培養(yǎng)條件下OD600 nm不足0.10，而在厭氧條件下OD600 nm可達(dá)1.75。經(jīng)5次耐氧馴化后，青春雙歧桿菌菌液吸光度值達(dá)到了1.07，說明較馴化前青春雙歧桿菌菌數(shù)有大幅度提升。同時(shí)，有氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)下菌液的吸光度值之比不斷增大，表明在馴化過程中青春雙歧桿菌的耐氧能力也在不斷提升。

2.1.2 pH值 在循環(huán)馴化過程中，隨著傳代次數(shù)的增加，菌液pH值不斷下降，青春雙歧桿菌的耐酸能力也在不斷提升，從表1可以看出在馴化結(jié)束前菌液pH值已經(jīng)穩(wěn)定至4.5附近，這有助于青春雙歧桿菌作為益生菌通過胃部酸性環(huán)境，從而作用于腸道，并且馴化后的耐氧青春雙歧桿菌可為發(fā)酵食品的生產(chǎn)提供優(yōu)良菌株。

表1青春雙歧桿菌馴化過程中吸光度和pH值的變化情況

Table1ChangesofabsorbanceandpHvalueintheacclimatedprocessofB.adolescentis

循環(huán)傳代次數(shù)OD600 nm有氧培養(yǎng)厭氧培養(yǎng)有氧培養(yǎng)/厭氧培養(yǎng)pH值第1次0.0941.7540.0536.55±0.08第2次0.2741.6940.1625.93±0.23第3次0.5561.7210.3235.58±0.18第4次0.8731.6440.5315.29±0.12第5次1.0741.6830.6384.50±0.17

2.2 耐氧馴化前后青春雙歧桿菌形態(tài)特征的比較

耐氧馴化前后青春雙歧桿菌的菌落和菌體形態(tài)對(duì)比結(jié)果如表2和圖1、2所示，可以看出青春雙歧桿菌在耐氧馴化前后的形態(tài)保持一致，且馴化前后菌體的16S rRNA 基因序列一致，可以確定青春雙歧桿菌菌株在耐氧馴化后未發(fā)生變異。

2.3 馴化前后青春雙歧桿菌菌液中的有機(jī)酸含量

厭氧菌的培養(yǎng)一般以糖類或醇類為碳源，在青春雙歧桿菌的生長代謝中，會(huì)將碳源分解成乳酸、乙酸、丙酸、丁酸等有機(jī)酸，因此，研究測定耐氧馴化前后青春雙歧桿菌代謝不同有機(jī)酸含量的變化情況。圖3為乳酸、乙酸、丙酸、丁酸混合標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收峰譜圖，圖4、5分別為耐氧馴化前后青春雙歧桿菌代謝有機(jī)酸吸收峰譜圖。對(duì)比圖3～5可以看出，馴化前后青春雙歧桿菌代謝產(chǎn)生的乳酸、乙酸、丙酸、丁酸的出峰時(shí)間符合標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間，確定青春雙歧桿菌馴化前后有機(jī)酸種類無顯著變化。

表2耐氧馴化前后青春雙歧桿菌菌體形態(tài)特征

Table2MorphologicalcharacteristicsofB.adolescentisbeforeandafteraerobicdomestication

培養(yǎng)條件鏡檢形態(tài)菌落形態(tài)革蘭氏染色厭氧多為棒狀桿菌,有Y型、V型,兩端不規(guī)則乳白色或白色、不透明、圓形、邊緣完整陽性有氧體積較厭氧培養(yǎng)時(shí)小、菌體較短、兩端規(guī)則乳白色或白色、菌落較小、不透明、圓形、邊緣完整陽性

圖1 耐氧馴化前青春雙歧桿菌菌體形態(tài)

圖2 耐氧馴化后青春雙歧桿菌菌體形態(tài)

圖3 4種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算有機(jī)酸含量，結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，馴化后青春雙歧桿菌代謝乙酸和乳酸的含量下降幅度較大，丙酸含量變化不明顯。經(jīng)耐氧馴化后，青春雙歧桿菌代謝的4種有機(jī)酸總量下降，而乙酸與乳酸的摩爾數(shù)之比上升，青春雙歧桿菌生長的最佳摩爾比為2.0～4.0[17]，而馴化后的青春雙歧桿菌代謝乙酸與乳酸摩爾比為3.74，在最佳范圍之間，有利于青春雙歧桿菌的生長繁殖，在發(fā)酵食品的生產(chǎn)方面具有一定優(yōu)勢(shì)。

圖4 馴化前青春雙歧桿菌不同有機(jī)酸色譜圖

圖5 馴化后青春雙歧桿菌不同有機(jī)酸色譜圖

表3青春雙歧桿菌馴化前后有機(jī)酸含量

Table3ContentoforganicacidsbeforeandafterthedomesticationofB.adolescentisg/L

青春雙歧桿菌乳酸乙酸丙酸丁酸馴化前8.759.200.271.96馴化后1.294.840.240.47

2.4 不同低聚糖對(duì)馴化前后青春雙歧桿菌增殖效果的影響

2.4.1 青春雙歧桿菌在不同低聚糖培養(yǎng)基中OD600 nm和pH 青春雙歧桿菌在3種低聚糖培養(yǎng)基中的OD600 nm值和pH值如表4所示，總體上馴化后比馴化前OD600 nm值稍有下降，主要是由于青春雙歧桿菌為專性厭氧菌，雖然經(jīng)過耐氧馴化但生長狀況和厭氧培養(yǎng)下的菌株仍存在差距；馴化后比馴化前pH值降低，主要源于耐氧馴化的青春雙歧桿菌提高了自身的耐酸、產(chǎn)酸能力。并且低聚木糖培養(yǎng)基中的青春雙歧桿菌生長情況和產(chǎn)酸能力均強(qiáng)于大豆低聚糖、低聚麥芽糖培養(yǎng)基中的。

表4青春雙歧桿菌在不同低聚糖培養(yǎng)基中吸光度和pH的變化情況

Table4ChangesintheabsorbanceandpHofB.adolescentisindifferentoligosaccharidecultures

低聚糖OD600 nm馴化前馴化后pH馴化前馴化后大豆低聚糖1.0230.7295.034.59低聚木糖 1.5351.1785.744.26低聚麥芽糖0.6470.4335.284.83

2.4.2 馴化前后青春雙歧桿菌在不同低聚糖培養(yǎng)基中的還原糖含量 通過DNS比色法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，將試驗(yàn)中測得的OD560 nm值，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(y=0.012 5x-0.139 3，R2=0.995 2)計(jì)算葡萄糖含量，在3種低聚糖培養(yǎng)基中青春雙歧桿菌菌液還原糖含量如表5。

表5馴化前后青春雙歧桿菌在不同低聚糖培養(yǎng)基中還原糖含量

Table5ReducingsugarcontentofB.adolescentisindifferentoligosaccharideculturesbeforeandafterdomestication g/L

低聚糖種類馴化前馴化后大豆低聚糖13.33215.692低聚木糖 7.4928.612低聚麥芽糖16.49217.852

從表5中也可以看出：在低聚木糖培養(yǎng)基中青春雙歧桿菌生長后，菌液還原糖含量最低，碳源利用率最高，由此可知低聚木糖是良好的促雙歧桿菌生長因子。龔芳紅等[21]研究表明人體每天食用0.7 g低聚木糖17 d后，雙歧桿菌所占比例由8.5%提高到17.9%，21 d后提高到26.2%；徐海燕等[22]研究了低聚木糖對(duì)雙歧桿菌及腸道菌群生長的影響，結(jié)果表明，低聚木糖是對(duì)青春雙歧桿菌有明顯增殖效果的低聚糖，同時(shí)也印證了Crittenden等[19]比較多種低聚糖對(duì)厭氧菌發(fā)酵特性的研究。不同低聚糖對(duì)雙歧桿菌都有著一定的增殖效果，但低聚木糖是其中最優(yōu)良的一種，適合作為雙歧因子。

3 結(jié)論

試驗(yàn)探討了青春雙歧桿菌的耐氧馴化及低聚糖對(duì)青春雙歧桿菌增殖的影響，通過改變氧分壓，逐步提高青春雙歧桿菌對(duì)氧氣的耐受力。同時(shí)培養(yǎng)基中添加低聚糖可以對(duì)青春雙歧桿菌的增殖起到促進(jìn)作用；馴化后的青春雙歧桿菌在有氧條件下生長能力達(dá)標(biāo)，產(chǎn)酸能力得到提升，菌體馴化前后形態(tài)一致，耐氧青春雙歧桿菌代謝產(chǎn)生的乙酸與乳酸比值較厭氧青春雙歧桿菌更適宜發(fā)酵，因此，耐氧青春雙歧桿菌特性良好。后續(xù)可進(jìn)一步對(duì)多種低聚糖共同影響青春雙歧桿菌的增殖效應(yīng)，以及改善耐氧青春雙歧桿菌生長條件進(jìn)行研究。