夏春陽 杜吉到 韓毅強 孫浩月 李 明 吳洪斌 張 琦 于晟龍

(黑龍江八一農墾大學農學院，黑龍江 大慶 163319)

普通菜豆又名蕓豆、四季豆，屬豆科蝶形花亞科菜豆族菜豆屬菜豆種，是菜豆屬重要的栽培種之一[1]。中國普通菜豆的主產(chǎn)區(qū)主要分布在黑龍江、內蒙古、吉林、云南、貴州、山西、陜西等地。普通菜豆適應性強在世界范圍內均有種植，是最受消費者歡迎的食用豆類作物之一[2]，成熟普通菜豆經(jīng)過加工后可以制成豆沙或者糕點等，未達到成熟時期的可作為蔬菜食用。普通菜豆籽粒中蛋白質含量為17%～23%，脂肪含量為1.3%～2.6%，碳水化合物含量為56%～61%[3]，還含有礦物質以及多種維生素，在欠發(fā)達國家和地區(qū)，菜豆可供人們直接食用，并且是人們膳食結構中重要的組成部分[4-5]。

目前中國對菜豆種質資源研究包括對現(xiàn)有的資源進行系統(tǒng)的形態(tài)鑒定；對部分菜豆種質資源進行抗病蟲、抗逆性試驗鑒定，首先篩選出一部分優(yōu)質種質資源，對菜豆特殊功能成分進行提取及分析[6]。Lei等[7]對233份菜豆進行形態(tài)多樣性鑒定，并篩選出183份優(yōu)異種質。Blair等[8]和欒非時等[9]分別對323份蕓豆和60份蕓豆基于形態(tài)性狀進行聚類分析，分別劃出2個類群與3個類群。遺傳多樣性是指在群體內個體間基因組成的差異，這是一個種群和一個物種中的遺傳基礎，一個種群的遺傳多樣性越豐富，種質資源對生存環(huán)境的適應力越強，更容易擴展分布的范圍和開拓新環(huán)境[10]。分子標記是DNA水平遺傳變異的直接反映，新的DNA標記技術如簡單重復序列(SSR)、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)、表達序列標簽(EST)擴增片段多態(tài)性(AFLP)、簡單重復序列標記(ISSR)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)等分子標記技術不斷涌現(xiàn)應用，已成為現(xiàn)代作物育種領域的研究內容與技術手段。SSR標記與RAPD、RFLP等分子標記相比，SSR具有共顯性、豐富的多態(tài)性、高度的穩(wěn)定性，簡便的操作性等優(yōu)點[11]。為了更好地利用菜豆的種質資源，利用SSR分子標記對菜豆進行遺傳多樣性分析，得到相關數(shù)據(jù)從而判斷其遺傳關系，有助于菜豆優(yōu)勢基因的挖掘和種質材料的利用。目前SSR分子標記技術已被廣泛應用于水稻[12]、小麥[13]、玉米[14]等大田作物。張赤紅等[15]基于SSR標記技術對377份菜豆進行了遺傳多樣性評價并予以分類。試驗擬利用分子標記技術對普通菜豆種質資源進行遺傳多樣性研究，探討DNA水平上的遺傳差異和遺傳結構，分析普通菜豆種質資源的遺傳多樣性豐富程度，為保護菜豆種質資源保護和研究利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菜豆(見表1)：國家雜糧技術中心種質資源庫。

1.2 普通菜豆基因組DNA提取和檢測

普通菜豆種子在室溫下種植，取生長至3周葉齡葉片采用CTAB法提取基因組DNA，利用核酸蛋白定量檢測儀和1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA的質量和濃度。濃度稀釋至100 ng/μL，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設計和篩選

32對試驗引物參照文獻[15-16]設計，以參試材料基因組DNA為模板進行PCR擴增，以條帶清晰、多態(tài)性好、方便統(tǒng)計、穩(wěn)定性好的SSR引物作為核心引物。

1.3.1 PCR擴增

(1) PCR反應體系：Taq酶(1.25 U) 0.1 μL，1.6 μL dNTP (2.5 mmol/L)，1 μL模板DNA(100 ng/μL)，1 μL上、下游引物(10 μmol/L)，2 μL 10×Taq Buffer，用超純水將體積補齊至20 μL。

(2) PCR擴增程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，依據(jù)各引物退火溫度復性30 s，延伸溫度72 ℃延伸40 s，設置30個循環(huán)；最終72 ℃延伸7 min。

1.3.2 擴增產(chǎn)物檢測 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術檢測，電泳結束后對凝膠結果進行快速銀染檢測。

(1) 灌膠：用8%的變性聚丙烯酰胺灌膠，防止出現(xiàn)氣泡，輕輕插入梳子，使其聚合1.5 h左右。

(2) 電泳：清除氣泡及殘膠，插入樣品梳子，接通電源，170 W恒功率電泳，預電泳10 min。每一個加樣孔點入5 μL 樣品。電泳2 h，電泳結束后小心分開兩塊玻璃板。

(3) 固定：50%無水乙醇+2%冰醋酸，輕輕晃動3 min。

(4) 漂洗：蒸餾水快速漂洗1次，不超過15 s。

(5) 顯影：1.6% NaOH+0.4%甲醛顯影，輕輕晃動至條帶出現(xiàn)(膠背景為蛋黃色)。

1.4 數(shù)據(jù)記錄和統(tǒng)計分析

采用手動讀帶法，統(tǒng)計清晰穩(wěn)定、有差異的條帶，有帶記為1，無帶記為0。用PopGene32v1.32軟件計算各SSR引物的等位基因數(shù)、多態(tài)性信息含量值(PIC)、Shannon’s多樣性指數(shù)。用NT-SYS計算品種間的相似系數(shù)，按類平均法(UPGMA)進行聚類分析，繪制品種間的親緣關系聚類樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 SSR標記多態(tài)性引物的篩選

利用69份普通菜豆種質資源材料對32對SSR引物進行多態(tài)性篩選，最終獲得17對條帶清晰、多態(tài)性好、方便統(tǒng)計、穩(wěn)定性好的SSR引物用于對69份普通菜豆種質資源進行遺傳多樣性分析。引物BM170的PAGE電泳效果圖如圖1。

表1 69份供試材料

2.2 普通菜豆種質間的遺傳多樣性分析

利用PopGene32v1.32軟件對69份普通菜豆種質資源進行遺傳多樣性分析見表2。經(jīng)多態(tài)性分析結果顯示：17對SSR標記共檢測獲得等位變異位點55個，變幅2～5個，平均每對檢測到標記3.24個。其中標記BM143、BM141檢測到的變異位點數(shù)最高為5個位點，標記BM183、DH2檢測到的變異位點數(shù)最少為2個位點，其余標記皆檢測到3～4個變異位點。17對引物的多態(tài)性位點數(shù)17個，多態(tài)性百分含量100%；17對SSR標記有效等位基因數(shù)(ne)介于1.417與3.805之間，平均2.347；觀測等位基因數(shù)(na)介于2與5之間；Shannon(l)指數(shù)變異范圍為0.566～1.360，平均0.912；基因流(Nm)介于0.030 與1.098之間，平均0.255。表明普通菜豆種質資源間變異范圍較大，親緣關系較遠，具有豐富的遺傳多樣性。

2.3 69份普通菜豆種質資源的聚類分析

2.3.1 普通菜豆種質資源的GS聚類分析 GS聚類結果顯示(圖2) 69份菜豆種質材料間存在著不同程度的遺傳差異性。材料間遺傳相似性系數(shù)(GS)變異范圍為0.392～0.963，平均值為0.659；其中編號5的秋豆角和編號60的農家品種Y96間遺產(chǎn)相似性系數(shù)最大為0.963，說明兩份材料間親緣關系最近；其次編號為11和28的材料CX50、紅茬蕓豆及編號為16和18的材料DQ01和白花蕓豆間關系相對較近，遺傳相似性系數(shù)為0.960，說明以上材料在菜豆雜交育種中應盡量避免作為親本選配組合。其中編號4的墾蕓3號和編號43的GHR1302間遺傳相似性系數(shù)最小為0.392，說明這些材料間親緣關系最遠；其次編號8的黑蕓豆Y120和編號45的紅花臉間的遺傳相似性系數(shù)為0.393，兩者親緣關系也相對較遠；以上這些親緣關系較遠的材料可用作親本選配雜交組合材料。以69份菜豆核心種質材料間的遺傳相似性系數(shù)按UPGMA法進行聚類分析(圖2)。SSR標記能很好地區(qū)分69份菜豆種質材料，在遺傳相似系數(shù)0.60水平上將69份菜豆種子材料分為兩個組群：第一組群包含編號為1、7、19等27份菜豆；在遺傳相似系數(shù)0.67水平上分為I、II兩個亞組群：第I亞組群包括編號為19、26、53的Y10Y14、花臉豆和腳印；第II亞組群包含編號為1的紅腰飯豆等24份菜豆材料。第二組群包含編號為2、3、6等在內的42份材料；在遺傳相似性系數(shù)0.67水平上又分為I、II兩亞組群；第I亞組群包括編號43、52的GHR1302、蒙古圓兩份材料；第II亞組群包含編號為40、68、64的翻眼蕓豆、小紅蕓豆、白菜豆等40份菜豆材料，表明普通菜豆種質遺傳多樣性豐富。

從左至右依次為1～69號材料

Figure 1 DNA amplification results of 69 common kidney bean materials by primers BM170

表2 基于SSR標記的69份菜豆種質材料遺傳多樣性分析

圖2 根據(jù)SSR構建的69份普通菜豆種質的聚類分析

2.3.2 SSR標記主坐標聚類分析 通過主坐標分析法對獲取的69份材料SSR標記數(shù)據(jù)進行聚類分析，可將69份菜豆分為兩大類，此分類同GS聚類中的聚類結果基本一致，見圖3。

3 結論

試驗利用篩選17對SSR標記引物對69份普通菜豆種質資源進行遺傳多樣性分析，經(jīng)多態(tài)性分析結果顯示：17對SSR的多態(tài)性位點數(shù)和平均等位變異位點分別為17.00，3.24個，多態(tài)性百分含量100%；有效等位基因數(shù)(ne)、觀測等位基因數(shù)(na)和Shannon(l)指數(shù)的平均值分別為2.347，0.912，0.255，表明引物具有較高的多態(tài)性，可用于普通菜豆品種的區(qū)分；69份菜豆種質材料間遺傳相似性系數(shù)(GS)變異范圍為0.392～0.963，平均值為0.659，在遺傳相似系數(shù)0.60水平上將69份菜豆種子材料分為兩大組群，在遺傳相似系數(shù)0.67處兩個組群還共分為4個亞組群，表明普通菜豆種質遺傳多樣性豐富。后續(xù)將進行構建普通菜豆品種分子身份證，從而利用普通菜豆分子身份證構建和遺傳多樣性分析為優(yōu)質親本選配、品種鑒定和菜豆品質的監(jiān)督與管理提供幫助。

圖3 SSR主坐標分析聚類圖