劉保 丁捷 白婷 周智威 李洋 何江紅 孫群

摘要：為探究植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）對牦牛肌肉蛋白提取物的降解能力，以自然發(fā)酵牦牛酸醡肉中分離的4株植物乳桿菌為發(fā)酵菌株，分別構(gòu)建肌漿蛋白和肌原纖維發(fā)酵模擬體系。結(jié)果表明，在發(fā)酵過程中，接種4株植物乳桿菌均能使肌漿蛋白的磷酸化酶和肌紅蛋白以及肌原纖維蛋白的肌球蛋白重鏈和肌動蛋白在內(nèi)的多個條帶降解消失，其中植物乳桿菌M2降解肌原纖維蛋白效果最好。兩種發(fā)酵模擬體系中接種組的游離氨基氮含量均顯著大于對照組（P<0.05），以肌原纖維發(fā)酵模擬體系中M2處理組最高。綜上，植物乳桿菌M2具有較強(qiáng)降解牦牛肌肉蛋白，特別是肌原纖維蛋白的能力，有望用于后續(xù)牦牛酸醡肉功能發(fā)酵劑的開發(fā)。

關(guān)鍵詞：植物乳桿菌;牦牛肉;肌肉蛋白;蛋白降解

中圖分類號：TS251 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-5124（2019）10-0071-07

收稿日期：2019-05-15;收到修改稿日期：2019-06-23

基金項(xiàng)目：四川省科技支撐計(jì)劃（2016NZ0005）

作者簡介：劉保（1992-），男，安徽穎L縣人，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)橘Y源微生物學(xué)。

通信作者：孫群（1967-），女，四川成都市人，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锛夹g(shù)與食品安全。

0 引言

發(fā)酵肉制品是在自然或人工條件下，由乳酸菌等益生菌以及其他環(huán)境微生物通過發(fā)酵作用而形成，具有較長的保質(zhì)期，且營養(yǎng)價值較高[1]。乳酸菌作為主要發(fā)酵菌種，不僅可抑制腐敗菌的生長，還可賦予肉制品特殊的風(fēng)味、色澤和質(zhì)地[2]。發(fā)酵肉制品中常用的乳酸菌包括彎曲乳桿菌、戊糖乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、清酒乳桿菌等[3]。其中，植物乳桿菌廣泛應(yīng)用于發(fā)酵香腸、臘肉、酸肉等發(fā)酵肉制品工藝中[4]。黃忠白[5]、裘迪紅[6]等研究發(fā)現(xiàn)利用植物乳桿菌發(fā)酵水產(chǎn)品具有去腥增香的效果。車振民等[7]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌發(fā)酵風(fēng)干牛肉干的色澤、硬度、咀嚼性得到顯著改善。陳曦等[8]研究發(fā)現(xiàn)添加植物乳桿菌發(fā)酵香腸不僅使香腸的微生物安全性和感官品質(zhì)明顯提高，同時還降低了水分活度，延長了香腸的保質(zhì)期。

蛋白質(zhì)的降解過程對于發(fā)酵肉制品成熟起到至關(guān)重要的作用。肌肉蛋白質(zhì)尤其是肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的降解作用通常是由肌肉內(nèi)源蛋白酶和微生物蛋白酶共同協(xié)作完成[9]。降解過程中肌肉內(nèi)源性蛋白酶起主要作用，微生物酶則在蛋白水解后期發(fā)揮重要作用，如胞內(nèi)的氨肽酶、二肽酶和三肽酶等[10]。大分子蛋白降解為多肽后，微生物酶將多肽進(jìn)一步水解為短肽和游離氨基酸，多數(shù)氨基酸又可進(jìn)一步形成風(fēng)味物質(zhì)或者風(fēng)味前體物質(zhì)，再通過微生物的一系列生化反應(yīng)最終生成醛、酸、醇和酷等芳香化合物，賦予肉制品獨(dú)特的風(fēng)味和質(zhì)地[11-12]。牦牛肉營養(yǎng)價值極高，具有高蛋白低脂肪富含氨基酸等特點(diǎn)，但其肉質(zhì)較老，口感粗糙，硬度較大嚴(yán)重限制了其開發(fā)利用[13]。植物乳桿菌具有較為完善蛋白水解系統(tǒng)，利用植物乳桿菌發(fā)酵有望對牦牛肉品質(zhì)嫩度進(jìn)行改善，同時賦予其新的風(fēng)味[14-15]。

牦牛酸醡肉是以新鮮牦牛肉為主料，輔以青棵粉及多種調(diào)味料經(jīng)自然發(fā)酵而成，同時結(jié)合了牦牛肉和發(fā)酵肉的優(yōu)點(diǎn)，營養(yǎng)價值極高且風(fēng)味獨(dú)特，并對提高牦牛肉嫩度有明顯作用[16]。本課題組前期從自然發(fā)酵的牦牛酸醡肉中分離篩選到4株具有蛋白酶活性的植物乳桿菌，為探究該4株乳酸菌對耗牛肌肉蛋白的降解能力，本研究以新鮮牦牛肉為材料，構(gòu)建體外發(fā)酵模擬體系篩選降解牦牛肌肉蛋白能力較強(qiáng)的菌株，以期為后續(xù)牦牛酸醡肉的發(fā)酵劑開發(fā)及品質(zhì)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與樣品

菌株：植物乳桿菌M2、M4、M5、M6分離于自然發(fā)酵成熟的牦牛酸醡肉。

牦牛肉樣品：牦牛背最長肌，購于四川省甘孜州白玉縣農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.2 主要試劑

氯化鈉、磷酸氫二鈉、碘化鉀、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、四硼酸鈉、葡萄糖等購于成都金山化學(xué)試劑有限公司;寬范圍彩色預(yù)染蛋白質(zhì)Marker購于北京天根生化科技有限公司;鄰苯二甲醛、10% SDS溶液、牛血清蛋白、5×蛋白上樣緩沖液、TritonX-100等購于北京索萊寶科技有限公司;苯丙氨酸購于上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

WF2212112型勻漿機(jī)，美國Waring公司;高速臺式冷凍離心機(jī)，德國艾本德公司;PowerBac^TMBasic電泳儀，Universal Hood Ⅱ型凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司;PH計(jì)，上海儀電公司;恒溫水浴鍋，上海躍進(jìn)醫(yī)療公司;紫外分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株懸浮液制備

將植物乳桿菌M2、M4、M5、M6分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16h，活化傳代2次。將培養(yǎng)后的菌種發(fā)酵液在4℃，8000g條件下離心10min，棄日青，并將菌體沉淀懸浮于0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.5）中，離心（4℃，8000g，10min）棄上清，重復(fù)2次上述操作后，再懸浮于0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.5）中，同時在600nm處測定OD值，以0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.5）為空白對照，將各菌株菌懸液調(diào)至相同OD值約為0.9，即得到各株乳酸菌的菌懸液。

1.2.2 肌肉蛋白提取物制備

肌漿蛋白的提取參照Fadda的方法[ly]，即取耗牛肉背最長肌10g，用無菌蒸餾水沖洗3次后加入10倍體積的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.5）勻漿3min，然后在4℃，10000g條件下離心20min，吸取上清液用濾紙片進(jìn)行過濾，濾液再用0.22μm濾膜過濾除菌，即得肌漿蛋白提取液。

肌原纖維蛋白提取參照Sanz的方法[18]，將上述步驟肌肉蛋白沉淀懸浮于10倍體積的0.03mol/L、含0.1%（v/v）TritonX-100的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）中，勻漿2min，然后在4℃，10000g條件下離心20min，棄上清，重復(fù)上述操作3次，清洗沉淀以除去肌肉蛋白酶。沉淀稱量，并懸浮于9倍體積的0.1mol/L、pH6.5的磷酸鹽緩沖液（含0.7mol/LKI）中，勻漿4min，10000g、4℃離心20min，上清液透析并過濾除菌后，用無菌水稀釋6倍，即得肌原纖維蛋白提取液。

利用雙縮脲法分別測定肌漿蛋白和肌原纖維蛋白提取液中的蛋白質(zhì)濃度，并以牛血清蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 模擬體系的構(gòu)建

取各株乳酸菌的菌懸液5mL分別添加于45mL的肌漿蛋白提取液或肌原纖維蛋白提取液中（含有0.1%葡萄糖），混勻;另做一空白對照，即不接種乳酸菌，添加5mL 0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（PH6.5）。將各組樣品置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在第0，2，4，6d取出適量體積的發(fā)酵液，并做下一步分析測定。

1.2.4 活菌數(shù)及PH值測定

在不同發(fā)酵天數(shù)的肌漿蛋白發(fā)酵液和肌原纖維蛋白發(fā)酵液中取適量的發(fā)酵液進(jìn)行梯度稀釋，選取合適的稀釋濃度涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)48h后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。同時用PH計(jì)測定各組發(fā)酵液的PH值。

1.2.5 SDS-PAGE蛋白電泳

取80μL不同發(fā)酵天數(shù)的肌漿蛋白發(fā)酵液或肌原纖維蛋白發(fā)酵液添加20μL5x蛋白上樣緩沖液，充分混勻，置于100℃水浴加熱5min，待冷卻至室溫后，10000r/min離心3min，各組樣品吸取上清液20μL，進(jìn)行電泳。濃縮膠濃度為5%，電壓為80V;分離膠濃度為12%，電壓為120V。電泳結(jié)束后，將凝膠放于考馬斯亮藍(lán)R-250染色液（0.1考馬斯亮藍(lán)R-250、25%異丙醇和10%冰乙酸）中染色2h，取出凝膠，蒸餾水沖洗幾次，然后倒人脫色液（85%蒸餾水、10%冰酯酸和5%無水乙醇）中，過夜脫色，直至背景清晰，再置于凝膠成像儀拍照。

1.2.6 游離氨基氮測定

發(fā)酵模擬體系中游離氨基氮含量的測定利用鄰苯二甲醛（OPA）比色法來進(jìn)行[19-20]。先稱取40mg鄰苯二甲醛溶于1mL的甲醇中，再分別加入25mL 0.1mol/L的四硼酸鈉溶液、2.5mL 20%SDS溶液和100μLβ-琉基乙醇，最后加入蒸餾水定容至50mL，即得到鄰苯二甲醛衍生試劑。OPA試劑需現(xiàn)用現(xiàn)配。以苯丙氨酸作為標(biāo)品，制備不同濃度的苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各150μL加入3mLOPA試劑，混合均勻后，置于室溫反應(yīng)2min，然后于340nm測定吸光度值，根據(jù)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取0.5mL不同發(fā)酵天數(shù)的肌漿蛋白發(fā)酵液或肌原纖維蛋白發(fā)酵液加入1mL12%三氯乙酸溶液（TCA）溶液，混合均勻，室溫靜置10min，待出現(xiàn)蛋白沉淀后，2000r/min離心10min。取上清液150μL加入3mL OPA試劑混合均勻，然后放置于室溫反應(yīng)2min，并在 340mm處測定吸光度值，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算游離氨基氮的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵模擬體系中乳酸菌的生長變化

如圖1所示，4株植物乳桿菌在兩種發(fā)酵模擬體系中的活菌數(shù)均呈現(xiàn)逐步下降趨勢，各接種組的發(fā)酵初始活菌數(shù)約為10⁸CFU/mL，發(fā)酵至第6天，活菌數(shù)降至10⁷CFU/mL左右。由于發(fā)酵液中蛋白分解的小肽和氨基酸可為植物乳桿菌提供少量的碳源，所以菌體可在發(fā)酵體系中存活;但隨著發(fā)酵時間延長，由于肌漿蛋白和肌原纖維蛋白提取液中營養(yǎng)物質(zhì)以氮源為主，碳源嚴(yán)重不足，所以植物乳桿菌的總菌數(shù)呈逐漸下降的趨勢。Fadda等研究了植物乳桿菌CRL681對肌漿蛋白和肌原纖維蛋白提取物的水解能力，發(fā)現(xiàn)接種培養(yǎng)%h后，乳酸菌活菌數(shù)明顯下降[21]。孫雷[22]、Chen[23]、Sanz[24]等的研究結(jié)果也與此類似。

2.2 發(fā)酵過程中pH值的變化

肌漿蛋白和肌原纖維蛋白發(fā)酵模擬體系中pH值的變化如圖2所示，兩種發(fā)酵模擬體系的初始pH一致，在整個發(fā)酵過程中，未接種的對照組pH值均保持穩(wěn)定。在發(fā)酵的前2天，兩種體系中乳酸菌利用有限營養(yǎng)資源代謝產(chǎn)生有機(jī)酸，而致使pH值分別下降至4.4和42，隨后的幾天內(nèi)，pH變化差異不顯著（P>0.05）。從圖2（a）可以看出，在發(fā)酵的中后期，肌漿蛋白發(fā)酵模擬體系中pH值出現(xiàn)輕微上調(diào)，可能是由于營養(yǎng)物質(zhì)有限以及蛋白水解產(chǎn)生的氨基酸和多肽被菌體消耗產(chǎn)生非蛋白含氮化合物和氨的累積所致[25]。肌原纖維蛋白發(fā)酵模擬體系中pH值在發(fā)酵后期并未升高，可能是因?yàn)榫甑漠a(chǎn)酸速率要大于非蛋白含氮化合物和氨的累積速率。

2.3 發(fā)酵過程中肌肉蛋白的降解

分別接種4株植物乳桿菌培養(yǎng)0，2，4，6d的肌漿蛋白電泳圖譜如圖3所示，在培養(yǎng)前，對照組與各接種組的肌漿蛋白電泳條帶無明顯差異，起始條件接近。當(dāng)發(fā)酵至第2天時，如圖3（b）所示，與對照組相比，肌漿蛋白中磷酸化酶（98kDa）和肌紅蛋白（17kDa）對應(yīng)條帶幾乎消失，M型肌酸激酶（42kDa）和甘油醛脫氫酶（35kDa）對應(yīng)條帶強(qiáng)度變?nèi)?，其他多個條帶強(qiáng)度變?nèi)趸蛳?，表明肌漿蛋白發(fā)生了降解。隨后4天發(fā)酵時間內(nèi)，接種組蛋白條帶強(qiáng)度進(jìn)一步減弱。在發(fā)酵至第6天，如圖3（d）所示，接種組蛋白條帶顏色已經(jīng)變得很淺，多處條帶已消失。而在整個6天發(fā)酵周期內(nèi)，對照組條帶未有明顯變化，表明肌漿蛋白未發(fā)生降解反應(yīng)，因此接種的4株植物乳桿菌均可促使肌漿蛋白降解，但無明顯差異。

肌原纖維蛋白電泳圖變化如圖4所示，在培養(yǎng)前對照組與接種組的肌原纖維蛋白電泳圖條帶無明顯差異。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到第2天時，如圖4（b）所示，與對照組相比，所有接種組的蛋白條帶強(qiáng)度明顯減弱，表明肌原纖維蛋白有所降解。在發(fā)酵第4天時，接種組肌原纖維蛋白條帶強(qiáng)度進(jìn)一步減弱或消失，尤其肌球蛋白重鏈（MHC，220kDa）和肌動蛋白（45kDa）條帶強(qiáng)度出現(xiàn)較大程度的減弱，其中接種M2組MHC條帶已經(jīng)降解消失。在發(fā)酵第6天，對照組蛋白條帶相比于培養(yǎng)前強(qiáng)度略為減弱，而接種組肌原纖維蛋白條帶強(qiáng)度微弱，幾乎消失，尤其接種M2組更為明顯，肌動蛋白（45kDa）、肌鈣蛋白-T（37kDa）以及原肌球蛋白（35kDa）已經(jīng)降解消失。從圖中可以看出，在4個接種組中接種M2組降解肌原纖維蛋白效果最好。

近年來，多項(xiàng)研究表明乳酸菌具有降解肌肉蛋白質(zhì)的能力。Chen等[23]研究發(fā)現(xiàn)戊糖片球菌、彎曲乳桿菌、短乳桿菌以及發(fā)酵乳桿菌均可降解肌漿蛋白提取物。Fadda VZ‘]砂移乙顯示{彭孵日干菌CRL681全細(xì)胞胞對肌漿蛋白具有較強(qiáng)水解作用，而對肌原纖維蛋白水解作用較弱。Sanz[24]、孫雷[22]等研究也表明植物乳桿菌可降解肌肉蛋白質(zhì)。本研究中，由圖3和圖4可以看出，對照組條帶未發(fā)生明顯降解，也即排除肌肉內(nèi)源蛋白酶的作用，肌肉蛋白的降解主要是由植物乳桿菌作用引起。

2.4 游離氨基氮分析

蛋白酶在分解蛋白質(zhì)的氨基或羧基末端肽鍵后，可導(dǎo)致氨基態(tài)氮的累積，游離氨基氮測定的是蛋白質(zhì)經(jīng)水解產(chǎn)生的小肽和氨基酸，通過對游離氨基氮的測定可反映發(fā)酵模擬體系中蛋白酶的活力情況[26]。此外，由蛋白降解生成的小肽和游離氨基酸對肉制品的香味和滋味的形成也具有重要的貢獻(xiàn)。

肌漿蛋白發(fā)酵模擬體系中游離氨基氮的變化如圖5（a）所示，在發(fā)酵的6天內(nèi)，對照組的游離氨基氮無顯著增加，說明肌漿蛋白并無水解現(xiàn)象，結(jié)果同圖3肌漿蛋白電泳圖譜變化。而接種組游離氨基氮含量隨著發(fā)酵時間的延長而升高，在發(fā)酵第6天，接種組游離氨基氮含量顯著大于對照組（P<0.05），各接種組之間無顯著差異（P>0.05）。

如圖5（b）所示，肌原纖維蛋白發(fā)酵模擬體系中游離氨基氮含量變化趨勢與肌漿蛋白發(fā)酵模擬體系基本一致，發(fā)酵第6天后，對照組游離氨基氮含量小幅增加，接種組游離氨基氮含量仍顯著高于對照組（P<0.05），其中接種M2組游離氨基氮含量略高于其他3個接種組。結(jié)果表明，在發(fā)酵模擬體系中植物乳桿菌促使肌肉蛋白降解產(chǎn)生小肽和游離氨基酸，與上述肌肉蛋白降解電泳圖譜變化結(jié)果一致。

3 結(jié)束語

由電泳圖譜可以看出，4株植物乳桿菌均顯示出降解肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的能力，此外接種4株植物乳桿菌可促使肌肉蛋白分解產(chǎn)生小肽及氨基酸的累積，其中M2菌株降解肌原纖維蛋白效果最佳，其他3株無明顯差異。后續(xù)還可繼續(xù)對該植物乳桿菌的蛋白水解酶進(jìn)行深入的探討。綜上，可得出植物乳桿菌M2綜合降解能力最強(qiáng)，具有潛在改善耗牛肉品質(zhì)嫩度，增添風(fēng)味的潛力，并有望用于后續(xù)牦牛酸醡肉的開發(fā)。

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（編輯：莫婕）