錢雅麗，王先之，來興發(fā)，李峻成，沈禹穎*

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2.草業(yè)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，甘肅 蘭州 730020)

隴東黃土高原是我國蘋果(Malusdomestica)種植的優(yōu)勢區(qū)域之一[1]。傳統(tǒng)果園通常采用清耕的管理方式，長期清耕會(huì)造成土壤板結(jié)、微生物多樣性衰減[2]、蘋果產(chǎn)量下降和果品質(zhì)量變差等問題[3]，給該地區(qū)蘋果園的健康、可持續(xù)發(fā)展提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。果園生草覆蓋是一種有效的土壤管理制度[4]，具有改善土壤養(yǎng)分、減輕病蟲危害和提高土壤微生物多樣性等功能[5]。有研究表明，蘋果園生草能提高土壤水解氮、速效磷、速效鉀的含量，有利于蘋果對(duì)營養(yǎng)元素的吸收，且種植豆科牧草后土壤有機(jī)質(zhì)的提升效果要強(qiáng)于禾本科牧草[6]。

土壤真菌作為土壤微生物的重要組分，能夠參與有機(jī)物質(zhì)分解與合成[7]，與土傳病害、植物互作等亦有密不可分的關(guān)系[8-9]。孫計(jì)平等[10]研究生草梨(Pyrusspp.)園的結(jié)果表明，長期生草能提高表層土壤真菌數(shù)量。陳月星等[11]在蘋果園進(jìn)行的生草試驗(yàn)也有類似結(jié)論。不同草種釋放的根系分泌物不同，會(huì)影響土壤微生物群落生長代謝和群落結(jié)構(gòu)[12]。因此，不同生草類型可以通過土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)而影響土壤微生物棲息環(huán)境[13-14]。前人對(duì)蘋果園不同植被條件下土壤酶活性以及真菌數(shù)量等方面已經(jīng)開展了研究工作[15-16]，而關(guān)于生草蘋果園土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道尚少，且這些研究多采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法和稀釋平板法等，不能準(zhǔn)確地反映自然田間狀態(tài)下土壤真菌群落的組成和特異性[17]。明晰生草后土壤真菌群落變化特征，對(duì)土壤微環(huán)境調(diào)節(jié)的深入揭示具有重要理論意義。為此，本研究采用高通量測序法，以黃土高原區(qū)蘋果園為研究對(duì)象，研究鴨茅(Dactylisglomerata)、白三葉(Trifoliumrepens)和紫花苜蓿(Medicagosativa)3種生草模式以及清耕處理下0～10 cm土層土壤真菌群落組成和多樣性特征，以探明蘋果園生草后土壤真菌群落組成變化及特異菌屬組成。研究結(jié)果在理論上有助于從分子角度揭示種植不同牧草后對(duì)土壤真菌群落特征的影響，在實(shí)踐上可為果園生草草種選擇提供一定指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

本試驗(yàn)在慶陽市西峰區(qū)什社鄉(xiāng)境內(nèi)的甘肅省慶陽草地農(nóng)業(yè)研究觀測站(N 35°39′-E 107°51′，海拔1297 m)內(nèi)進(jìn)行。年均降水量為564 mm(1970-2015年)，年降水總量的70%主要集中在6-9月。年均氣溫9.2 ℃，年極端最高、最低氣溫分別為39.6、-22.4 ℃，>5 ℃的年平均積溫3446 ℃。生長期255 d。試驗(yàn)地土壤類型為黑壚土，質(zhì)地為粉壤土，其0～10 cm基況為：土壤有機(jī)質(zhì)16.2 g·kg-1，全氮1.2 mg·g-1，pH值8.1，土壤容重1.4 g·cm-3。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采取隨機(jī)區(qū)組排列，以試驗(yàn)站內(nèi)13齡秦冠蘋果園(行距4 m，株距4 m)為試驗(yàn)區(qū)進(jìn)行生草試驗(yàn)。于2014年4月分別在試驗(yàn)區(qū)建植多年生牧草鴨茅、白三葉和紫花苜蓿，采用單播的方法，播量均為15 kg·hm-2，以清耕(CK)為對(duì)照。每處理3個(gè)重復(fù)，共12個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積為30.0 m×2.6 m。生草區(qū)均為行間生草，行內(nèi)清耕，生草帶距樹干距離為0.7 m。每年5、7和9月對(duì)小區(qū)進(jìn)行刈割管理，并定期除雜。

1.3 樣品采集與處理

取樣時(shí)間為2015年9月24日，每小區(qū)“S”型5點(diǎn)取樣，去除表層凋落物后，用φ=40 mm土鉆采集0～10 cm土層土壤，混勻，去除植物殘?bào)w和石礫等雜質(zhì),共計(jì)12個(gè)樣。每次取樣前后對(duì)土鉆均用75%的酒精進(jìn)行消毒，防止樣品被污染。所取樣品均被放入滅菌袋用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃冰箱中保存，供土壤微生物DNA提取及后續(xù)測定。

1.4 土壤微生物總DNA提取及ITS rRNA基因高通量測序

土壤真菌ITS rRNA的測定工作由北京安諾優(yōu)達(dá)基因科技有限公司進(jìn)行。采用FastDNA?SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals)試劑盒提取，對(duì)提取到的基因組DNA進(jìn)行1.0%的瓊脂糖電泳檢測DNA樣品是否有降解以及雜質(zhì)存在；用NanoPhotometer分光光度計(jì)檢測樣品純度；Qubit2.0 Flurometer檢測DNA樣品濃度，取適量的樣品于離心管中，用無菌水稀釋樣品至1 ng·μL-1。選擇V3+V4區(qū)，以稀釋的基因組DNA為模板，使用341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCA-3′)-805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃，3 min；(95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s)25個(gè)循環(huán)；16 ℃ 10 min。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，通過2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物純化濃度。將土壤樣品16S rRNA基因的PCR純化產(chǎn)物等摩爾數(shù)混合，利用Thermo Scientific公司的GeneJET膠回收試劑盒。使用New England Biolabs公司的NEB Next UltraDNA Library Prep Kit for Illumina (NEB，USA)試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit@2.0熒光計(jì)(Life Technologies，CA，USA)和安捷倫科技公司生物分析儀2100系統(tǒng)定量和文庫檢測合格后，進(jìn)行上機(jī)測序，測序平臺(tái)為IlluminaHiseq PE250，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。然后對(duì)所有樣品的全部序列進(jìn)行聚類，以97%的相似度將序列聚類成分類操作單元 (operational taxonomic units, OTUs)，然后對(duì)OTUs的代表序列進(jìn)行物種注釋，在Unite庫比對(duì)，得到OTUs的分類學(xué)信息。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用QIIME軟件(1.8.0版)分析數(shù)據(jù)，得出土壤真菌Alpha多樣性指數(shù)(Shannon和Simpson)、菌群豐富度指數(shù)(Chao1和Observed_species)。Beta多樣性中樣本間距離采用Unifrac方法計(jì)算。采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及制圖，采用SPSS 19.0軟件對(duì)土壤真菌門、屬水平不同生草模式下真菌相對(duì)豐度進(jìn)行單因素方差分析，使用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤真菌OTUs水平分析

對(duì)真菌ITS區(qū)進(jìn)行測序分析，過濾去除原始數(shù)據(jù)中的低質(zhì)量序列后，獲得的原始讀數(shù)為214944條，其中高質(zhì)量序列所占比例大于70%，說明測序質(zhì)量很好(表1)。在相似度大于97%分類水平下將其聚類為用于物種分類的OTUs，12個(gè)樣品共產(chǎn)生2381個(gè)OTUs。由表1可知，紫花苜蓿處理下土壤真菌OTUs數(shù)最多，其次是白三葉處理，鴨茅處理最少。與對(duì)照相比，建植紫花苜蓿后土壤真菌OTUs數(shù)量增加了17.11%，建植鴨茅后則減少了1.60%。

2.2 土壤真菌群落Alpha多樣性

表1 不同生草模式下土壤真菌讀數(shù)(Reads)及OTUs數(shù)Table 1 Sequence readings and OTUs of soil fungi under different grass planting patterns

注：CK為未種植生草處理。下同。

Note: CK is unplanted grass treatment. The same below.

紫花苜蓿生草處理下土壤真菌群落Shannon指數(shù)最高，比對(duì)照提高27.02%，Simpson指數(shù)也最高，因此其真菌多樣性(Shannon)在4個(gè)處理中最高，為4.09(表2)。其后依次為白三葉>鴨茅>CK；表明蘋果園生草能夠提高土壤真菌多樣性。4個(gè)處理中紫花苜蓿下土壤真菌豐富度(Chao1和Observed_species)最高，為216.15和159.66；與紫花苜蓿處理相比，鴨茅處理豐富度指數(shù)降低14.77%和12.47%。

2.3 土壤真菌群落Beta多樣性

樣本間距離是指樣本之間的相似程度，可以通過數(shù)學(xué)方法估算。樣本間越相似，距離數(shù)值越小，0表示兩個(gè)微生物群落間OTUs的種類一致，其余數(shù)字越接近于1表示處理間群落差異越大。鴨茅、白三葉和紫花苜蓿生草處理與清耕處理相比樣本間距離均大于0.42，大于生草處理間樣本距離，說明3個(gè)生草處理與清耕處理群落有明顯差異。樣本間距離在紫花苜蓿處理與清耕處理間越大，說明兩者間群落差異更明顯(圖1)。

2.4 不同分類水平下土壤真菌群落組成

本研究中蘋果園4個(gè)模式下OTUs的分類結(jié)果表明，土壤真菌群落隸屬于4門12綱24目24科22屬。在門水平土壤真菌主要門類為子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)、 擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和球囊菌門(Glomeromycota)，還有部分未能分類的真菌(圖2)。其中，子囊菌門的相對(duì)豐度最高，占所有真菌門類的32%～42%。鴨茅、白三葉和紫花苜蓿3個(gè)處理中優(yōu)勢菌群均為子囊菌門(42.58%、37.67%和32.33%)和接合菌門(10.02%、9.13%和7.67%)。不同生草模式之間土壤真菌門類相對(duì)豐度有差異(圖2)，種植鴨茅、白三葉和紫花苜蓿土壤中接合菌門相對(duì)豐度比對(duì)照增加196.15%、169.82%和126.92%。而擔(dān)子菌門相對(duì)豐度則減少68.75%、25.00%和55.00%(P<0.05)。鴨茅、白三葉和紫花苜蓿3個(gè)處理中球囊菌門相對(duì)豐度均高于對(duì)照，但差異不顯著。

表2 不同生草模式下土壤真菌Alpha多樣性Table 2 Alpha diversity of soil fungal communities under different grass planting patterns

圖1 不同生草模式下土壤真菌Unweighted UniFrac距離矩陣Fig.1 Unweighted UniFrac distance matrix diagram of soil fungi under different grass planting patternsQG(CK): 清耕 Clean tillage; YM: 鴨茅 Orchard grass； SYC: 白三葉 White clover； MX: 紫花苜蓿 Lucerne. 下同 The same below.

圖2 不同生草模式下土壤在門水平上的真菌群落組成Fig.2 Composition of soil fungi community at phylum level under different grass planting patterns Ascomycota：子囊菌門；Zygomycota：接合菌門；Basidiomycota：擔(dān)子菌門；Glomeromycota：球囊菌門。不同小寫字母代表在不同生草模式下土壤真菌相對(duì)豐度間差異顯著(P<0.05)。下同。Different lowercase letters represent significant differences of soil fungi relative abundances among different grass planting patterns (P<0.05). The same below.

在屬的分類水平，全部真菌序列至少有22個(gè)屬，主要包括：Gloeotinia、鐮孢霉屬(Fusarium)、被孢霉屬(Mortierella)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma)、毛殼菌屬(Chaetomium)、Mrakia、內(nèi)養(yǎng)囊霉屬(Entrophospora)、漆斑菌屬(Myrothecium)、Bionectria、Microdochium、周刺座霉屬(Volutella)、Geomyces、Ilyonectria、輪枝菌屬(Verticillium)、Stephanonectria、Tetracladium、Neonectria、Haematonectria、赤霉菌屬(Gibberella)、Hanseniaspora、Metarhizium和Dactylella等。22個(gè)屬中有11個(gè)的相對(duì)豐度≥0.02%(圖3)。4個(gè)處理下土壤各真菌屬所占相對(duì)豐度大小存在差異，其中鐮孢霉屬相對(duì)豐度在生草處理均高于對(duì)照，且鴨茅和紫花苜蓿與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)；而3個(gè)生草處理下被孢霉屬相對(duì)豐度均低于對(duì)照，且白三葉和紫花苜蓿與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)。內(nèi)養(yǎng)囊霉屬在鴨茅處理下相對(duì)豐度顯著高于白三葉和紫花苜蓿處理(P<0.05)；莖點(diǎn)霉屬在白三葉處理中相對(duì)豐度較高且與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)；紫花苜蓿處理中Ilyonectria菌屬相對(duì)豐度顯著高于其他3個(gè)處理(P<0.05)。

2.5 土壤真菌特異菌屬組成

圖4 不同生草模式下土壤真菌Venn圖Fig.4 Venn diagram of soil fungi under different grass planting patterns

清耕(對(duì)照)、鴨茅、白三葉和紫花苜蓿4個(gè)處理下土壤真菌群落組成分布特征如圖4，4個(gè)處理共同擁有190個(gè)相同的OTUs，特有的OTUs數(shù)分別為34、24、27和43，白三葉和紫花苜蓿處理比鴨茅處理分別增多12.5%和79.17%。白三葉和紫花苜蓿生草下共同含有的OTUs數(shù)為248個(gè)，高于其他兩兩處理共同含有OTUs數(shù)，說明白三葉和紫花苜蓿處理下真菌群落相似度高。經(jīng)篩選比對(duì)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照的特異菌屬主要有節(jié)叢孢屬(Arthrobotrys)、隱球菌屬(Cryptococcus)、擬青霉屬(Paecilomyces)和彎孢聚殼屬(Eutypella)等；鴨茅處理特異菌屬為嗜熱真菌屬(Thermomyces)、單端孢霉屬(Trichothecium)和火菇屬(Flammulina)等；白三葉處理的特異菌屬主要有葡萄穗霉屬(Stachybotrys)、放射毛霉屬(Actinomucor)、Rhizopycnis屬、Wickerhamomyces屬、白僵菌屬(Beauveria)、核瑚菌屬(Typhula)和刺盤孢屬(Colletotrichum)等；紫花苜蓿種植下特異菌屬主要有支頂孢屬(Acremonium)、枝孢屬(Cladosporium)、殼色單隔孢屬(Diplodia)、葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)和多孢菌屬(Pleospora)等。

3 討論

3.1 不同生草模式下土壤真菌群落多樣性

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)越豐富，物種越均勻，多樣性越高時(shí)，對(duì)抗病原菌的綜合能力就越強(qiáng)[18]，研究表明，單一作物中加入草會(huì)對(duì)土壤真菌多樣性有所影響[19]。本研究結(jié)果表明，建植紫花苜蓿的土壤真菌豐富度和多樣性在4個(gè)處理中最高，種植紫花苜蓿有利于土壤真菌的生長和繁殖，這與土壤真菌豐度提高結(jié)果相符[20]。這是由于紫花苜蓿有益于土壤肥力和有機(jī)碳含量的提高、增強(qiáng)微生物活性，從而提高土壤真菌豐富度[21]。3個(gè)生草處理的多樣性均高于對(duì)照，紫花苜蓿真菌多樣性最高，這與蘋果園生草后能夠有效減少土壤蒸發(fā)，穩(wěn)定土壤溫度，有利于真菌的生長有關(guān)[22]。同時(shí)紫花苜蓿的根系屬于直根系，向土壤中深入，其穿透活動(dòng)可以疏松土壤，將地下殘根和地面枯枝落葉經(jīng)過腐解后形成腐殖質(zhì)[23]，更有利于土壤有機(jī)質(zhì)累積，對(duì)土壤真菌多樣性的提升作用也更明顯[24]。3個(gè)生草處理與清耕處理相比，群落差異明顯，但在3個(gè)生草處理間群落差異不明顯?？梢?，地上植被加入和物種多樣性的增加可以穩(wěn)定和增加土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[25]，這與Gelsomino等[26]的研究結(jié)果一致。

3.2 不同生草模式下土壤真菌群落組成分析

不同作物種植類型對(duì)土壤真菌群落組成會(huì)造成影響[27]。本研究中，在門水平上，清耕、鴨茅、白三葉和紫花苜蓿處理土壤真菌群落隸屬于子囊菌門、接合菌門、擔(dān)子菌門和球囊菌門4個(gè)菌門，這與肖禮等[28]對(duì)黃土高原梯田種植類型土壤真菌群落組成的研究一致。蘋果園生草后土壤真菌接合菌門相對(duì)豐度增加，說明生草會(huì)影響土壤接合菌門相對(duì)豐度，這是由于蘋果園生草后產(chǎn)生的枯落物和根系，會(huì)轉(zhuǎn)化為腐殖質(zhì)，提供碳源以增加土壤有機(jī)碳[29]，而接合菌門大多是腐生菌，能很好地利用腐生環(huán)境[30]，適宜生存在生草果園。蘋果園生草后土壤真菌擔(dān)子菌門相對(duì)豐度較清耕處理降低，這是由于果園生草后會(huì)降低土壤pH[31]，提供的酸性環(huán)境對(duì)擔(dān)子菌門生長不利[32]。

本試驗(yàn)中蘋果園生草后鐮孢霉屬相對(duì)豐度顯著增加，鐮孢霉屬通常在土壤里營腐生性生活[33]，它的許多鐮刀菌是昆蟲的病原真菌，與控制害蟲蟲口密度、生物防治有一定關(guān)聯(lián)[34]，這與生草果園能夠?yàn)樘鞌郴顒?dòng)提供適宜生長環(huán)境，從而減輕病蟲害[35]的結(jié)論一致。莖點(diǎn)霉屬是多分布在豆科牧草中的一種植物病原菌[36]，其次生代謝產(chǎn)物可能對(duì)病原菌和害蟲危害有一定的抑制和防治作用[37]。莖點(diǎn)霉屬相對(duì)豐度在白三葉和紫花苜蓿處理中較高，認(rèn)為這可能是紫花苜蓿與果樹沒有共生病蟲害，且能為病蟲害天敵提供寄宿環(huán)境[38]。Ilyonectria屬廣泛分布在草本植物的根內(nèi)以及土壤中，為植物病原菌，可能會(huì)引起植物根腐病和黑腐病等[39]，這類菌屬在建植紫花苜蓿的土壤中表現(xiàn)出較高豐度。

3.3 不同生草模式下土壤真菌特異菌組成

經(jīng)篩選比對(duì)發(fā)現(xiàn)，4個(gè)處理均有各自特異菌屬存在。節(jié)叢孢屬出現(xiàn)在清耕土壤中，節(jié)叢孢屬最佳生長條件為pH 6.0～6.5，溫度20～25 ℃[40]，多生長在土壤、腐爛的樹葉枝條等處，與動(dòng)物線蟲的防治有密切聯(lián)系[41]。嗜熱真菌屬是建植鴨茅后出現(xiàn)的特異菌屬，其具有的高活力和熱穩(wěn)定性的纖維素酶、蛋白酶等[42]，對(duì)降解高分子多糖和蛋白質(zhì)具有促進(jìn)作用[43]。蘋果園建植白三葉后在其土壤中發(fā)現(xiàn)葡萄穗霉屬、放射毛霉屬和刺盤孢屬，葡萄穗霉屬和放射毛霉屬分泌的植物組織分解酶類均能分解植物中纖維素和半纖維素，轉(zhuǎn)化成各種糖類，有利于植物對(duì)原料的利用及微生物的生長[44-46]。刺盤孢屬又名炭疽菌屬，是一種豆科植物的病原真菌，能夠引起豆科植物的炭疽病[47]。支頂孢屬、枝孢屬、殼色單隔孢屬和葡萄座腔菌屬是紫花苜蓿生草處理下的特異菌屬，支頂孢屬又稱為頂孢屬，是一類很重要的抗生素產(chǎn)生菌，對(duì)植物致病真菌有明顯的抗性作用[48]，而枝孢屬和葡萄座腔菌屬均為植物病原菌，可能會(huì)引發(fā)植物病害[49]，從而影響到果樹生長、果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)[50]。這幾種特異菌屬與土壤真菌生長的關(guān)系，對(duì)于土壤病蟲害防治的作用等還需要通過進(jìn)一步的病蟲害，果品鑒定和果實(shí)產(chǎn)量等試驗(yàn)研究證明。

4 結(jié)論

本研究采用高通量測序技術(shù)研究了黃土高原蘋果園不同生草模式下土壤真菌群落特征。結(jié)果顯示，蘋果園種植鴨茅、白三葉和紫花苜蓿后會(huì)提高土壤真菌多樣性和豐富度。3個(gè)生草處理土壤真菌群落與清耕相比有明顯差異。土壤真菌優(yōu)勢菌門為子囊菌門和接合菌門；主要菌屬為Gloeotinia屬、鐮孢霉屬和被孢霉屬。生草后土壤中均發(fā)現(xiàn)真菌特異菌屬，鴨茅處理下為嗜熱真菌屬；白三葉處理下出現(xiàn)葡萄穗霉屬和放射毛霉屬；紫花苜蓿處理下為支頂孢屬。4個(gè)處理下土壤真菌群落組成相似，但在生草處理下土壤真菌有益菌屬、特異菌屬相對(duì)豐度增加。