王 威,白江平，王 清，黃惠英

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

中國(guó)紅豆杉(Taxuswallichianavar.chinensis)為紅豆杉科紅豆杉屬常綠喬木。紅豆杉屬植物，全世界有11 種，中國(guó)原產(chǎn)有4個(gè)種1個(gè)變種，即中國(guó)紅豆杉(中國(guó)特有物種)、東北紅豆杉、云南紅豆杉、西藏紅豆杉、南方紅豆杉(變種)。紅豆杉是植物界的活化石，國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)珍稀瀕危植物。從紅豆杉中提取的紫杉醇及其衍生物是目前世界上公認(rèn)的廣普、高活性抗癌藥物，被稱為“晚期癌癥的最后一道防線”[1-2]。

從一棵紅豆杉樹(shù)皮中提取的紫杉醇含量?jī)H為0.01%～0.05%。治療一個(gè)癌癥病人需要3～6棵100年的紅豆杉樹(shù)皮用于提取紫杉醇子[4]。紅豆杉在自然條件下生長(zhǎng)緩慢，再生能力差，種子處于深休眠狀態(tài)，需經(jīng)兩冬一夏才能萌發(fā)，發(fā)芽率低[5]。人工繁殖主要靠扦插和種子育苗移栽等方法[6-8]，但繁殖速度較慢，繁殖材料利用率低，無(wú)法滿足紫杉醇提取所需用的原料[9]。利用組織培養(yǎng)技術(shù)工廠化生產(chǎn)紅豆杉種苗，再進(jìn)行人工栽培，是解決紫杉醇原料短缺的途徑之一[10]。

近年來(lái)有關(guān)紅豆杉的研究主要集中在人工種植，組織和細(xì)胞培養(yǎng)[10-13]，微生物和基因工程[14-16]，遺傳轉(zhuǎn)化[16]，紫杉醇的合成、化學(xué)提取等方面[16-17]。通過(guò)尋找最優(yōu)化的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和愈傷組織分化培養(yǎng)條件，建立高效的植株再生系統(tǒng)及組培體系，以期為中國(guó)紅豆杉基因工程的遺傳轉(zhuǎn)化，組培生產(chǎn)大量的愈傷組織或懸浮細(xì)胞，從中提取紫杉醇提供技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)用的中國(guó)紅豆杉枝條采自甘肅省隴南市徽縣，2016年6月剪取8年齡當(dāng)年生的嫩枝。中國(guó)紅豆杉的試管苗由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院組培實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 外植體的滅菌處理及培養(yǎng) 將采回來(lái)的枝條剪去葉片后剪切成2～4 cm長(zhǎng)的段,每段帶2～3個(gè)側(cè)芽,先用洗衣粉溶液浸泡10～15 min，再用自來(lái)水沖洗40 min，在超凈工作臺(tái)上,用75%的乙醇浸泡30 s后用15%的84消毒液浸泡12～15 min，再用0.1%的HgCl2消毒6～10 min,無(wú)菌水沖洗4～5次，然后接種到WPM附加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2-ip，6-BA和NAA的初代培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件在25±2℃，16 h/d、1 600～2 000 lx光照條件下培養(yǎng)。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)和芽分化培養(yǎng) 將試管苗的葉片剪為長(zhǎng)0.5 cm的小片，莖剪切成1 cm小段，分別接種到愈傷組織誘導(dǎo)的10種培養(yǎng)基(接種時(shí)莖段平放于培養(yǎng)基上，葉片的上表皮面與培養(yǎng)基接觸)。每瓶培養(yǎng)基上接種10塊，每個(gè)處理接種3瓶，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。將接種好材料的三角瓶和培養(yǎng)皿置于人工氣候箱，在(25±1)℃、12 h/d、1 600 lx光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d后觀察出愈時(shí)間，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，50 d后統(tǒng)計(jì)芽分化率和出苗的情況。

出愈率=愈傷化外植體數(shù)/總接種外植體數(shù)×100%

分化率=分化出芽愈傷組織數(shù)/總愈傷組織數(shù)×100%

各處理，各階段培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基，全部以WPM為基本培養(yǎng)基，附加AC 0.3%、蔗糖3%、瓊脂0.6%，pH 5.8。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理采用《農(nóng)業(yè)田間試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析軟件》[18]。

1.3 選擇試驗(yàn)因素確定上、下線水平

根據(jù)紅豆杉組織和細(xì)胞培養(yǎng)等相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[16-17]，以3種外源激素最高使用濃度為上限，以不使用為下限進(jìn)行設(shè)計(jì)(表1)。

表1 3種外源激素使用濃度上、下界值

1.4 外源激素NAA，6-BA和2-ip配比組合及濃度實(shí)際值

為了減輕工作量，試驗(yàn)對(duì)3種外源激素濃度和不同配比采用了三因子D-飽和最優(yōu)設(shè)計(jì)[19]。根據(jù)3種外源激素使用的濃度上、下界值，計(jì)算濃度梯度的變化區(qū)間，再按照三因素D-飽和最優(yōu)設(shè)計(jì)表配置出10種組合(表2)。

表2 各培養(yǎng)基3種外源激素組合編碼及實(shí)際值

1.5 結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)資料采用多元回歸分析，即先建立結(jié)構(gòu)矩陣，解線性方程組得到相關(guān)矩陣和解。當(dāng)回歸模型通過(guò)擬合性檢驗(yàn)后，利用回歸方程尋求優(yōu)化的因子組合，以獲得外源激素濃度和配比的優(yōu)化組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同的外源激素濃度配比對(duì)中國(guó)紅豆杉試管苗莖段愈傷組織及分化成苗的影響

將中國(guó)紅豆杉試管苗的莖段和葉片分別接種到10種6-BA，NAA和2-ip不同濃度配比的WPM培養(yǎng)基上，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，50 d后統(tǒng)計(jì)分化率(表3)。

運(yùn)用多元二次數(shù)學(xué)模型Y=b0+∑bjXj+∑BijX1X3+∑BijXj2，對(duì)試管苗莖段的愈傷組織誘導(dǎo)率、芽分化率、根誘導(dǎo)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分別得到三元二次回歸方程：

Y(s愈)=0.930-0.037X1-0.039X2-0.035X3-0.039X1X2-0.016X1X3-0.008X2X3-0.074X12-0.04X22-0.030X32

(r=0.946 6,f=83.932)

表3 3種外源激素濃度配比下中國(guó)紅豆杉試管苗莖段愈傷組織誘導(dǎo)率及分化成苗率

Y(S根)=0.046-0.027X1-0.037X2-0.049X3-0.012X1X2-0.125X1X3-0.128X2X3-0.128X12-0.056X22-0.154X32

(r=0.987 6,f=90.521)

Y(S芽)=0.930-0.037X1-0.039X2-0.035X3-0.039X1X2-0.016X1X3-0.008X2X3-0.74X12-0.047X22-0.030X32

(r=0.946 6,f=83.932)

由于試管苗的葉片培養(yǎng)均未發(fā)生芽分化，因此只對(duì)不同外源激素濃度和配比對(duì)葉片愈傷和生根的影響效應(yīng)進(jìn)行多元回歸分析，得到三元二次方程：

Y(1愈)=0.611-0.041X1-0.008X2-0.089X3- 0.006X1X2-0.181X1X3-0.032X2X3-0.180X12-0.377X22-0.187X32

(r=0.992 9，f=154.749)

Y(1根)=0.129-0.018X1-0.091X2-0.038X3-0.237X1X2-0.184X1X3-0.146X2X3-0.128X12-0.056X22-0.154X32

(r=0.9879，f=90.521)

2.2 D-飽和最優(yōu)設(shè)計(jì)對(duì)中國(guó)紅豆杉莖段培養(yǎng)的不同外源激素濃度和配比尋優(yōu)

利用回歸方程尋優(yōu)，得到中國(guó)紅豆杉試管苗莖段、葉片愈傷組織誘導(dǎo)、芽、根分化的3種外源激素使用濃度較優(yōu)組合(表4)。

表4 D-飽和最優(yōu)設(shè)計(jì)對(duì)中國(guó)紅豆杉莖段培養(yǎng)的3種外源激素濃度和配比尋優(yōu)

結(jié)果表明，在培養(yǎng)基WPM中添加了NAA 0.2 mg/L、6-BA 2.25 mg/L、2-ip 1.5 mg/L，當(dāng)生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素摩爾濃度比為1∶5時(shí)，有利于莖段脫分化形成愈傷組織;(2)在培養(yǎng)基WPM中只添加NAA 0.4 mg/L對(duì)根分化有利；(3)在培養(yǎng)基WPM中只添加6-BA 3.4 mg/L與2-ip 4.5 mg/L，不加NAA，當(dāng)兩種激素摩爾濃度比為1∶1.2時(shí)，有利于芽分化；(4)在培養(yǎng)基WPM中添加NAA 0.3 mg/L和6-BA 3.4 mg/L、2-ip 3.0 mg/L，摩爾濃度比增大到(1∶6)時(shí)，有利于葉片脫分化形成愈傷組織。

3 討論

(1)組織培養(yǎng)技術(shù)是生物工程技術(shù)的基礎(chǔ)，在紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)和基因工程的遺傳轉(zhuǎn)化工作中建立好的植株再生體系主要依賴于植物組織培養(yǎng)技術(shù)，與一般的植物組織培養(yǎng)相比要求更高，內(nèi)容更加復(fù)雜。首先要有一個(gè)高頻的再生系統(tǒng)，其中包括外植體的選擇，最佳培養(yǎng)基和適宜品種的確定等。試驗(yàn)對(duì)中國(guó)紅豆杉試管苗的莖段及葉片的再生能力進(jìn)行了研究，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)對(duì)比，初步確定試管苗莖段是比較容易再分化的材料，具有生長(zhǎng)狀況易于確定，誘導(dǎo)率高、分化能力較強(qiáng)的突出特點(diǎn)，試驗(yàn)結(jié)果與Wang G Y等[20]的研究基本一致。用試管苗葉片誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織容易死亡，再生能力差，試驗(yàn)結(jié)果與甘煩遠(yuǎn)等[21]的研究結(jié)論相似。因此，用葉片作細(xì)胞培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料有待進(jìn)一步研究。

(2)好的細(xì)胞培養(yǎng)和植株再生體系的基礎(chǔ)是篩選出好的培養(yǎng)基。紅豆杉組織培養(yǎng)技術(shù)研究始于20世紀(jì)80年代，文獻(xiàn)報(bào)道的培養(yǎng)基配方中的基本成分大部分是MS或B5等[21-22]，在試驗(yàn)中變化最多的是植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，尤其是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素[23]。通常篩選最佳培養(yǎng)基配方采用的方法是將激素設(shè)計(jì)為系列濃度，然后組配所有可能的組合，進(jìn)行培養(yǎng)篩選。如果將這一方法應(yīng)用到細(xì)胞培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化體系的培養(yǎng)基篩選中工作量很大。為了得到可靠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，在試驗(yàn)中快速、準(zhǔn)確的設(shè)計(jì)和處理大量的數(shù)據(jù)，可采用三因素D-飽和最優(yōu)設(shè)計(jì)方法。采用了以WPM為基本培養(yǎng)基，附加0.3% AC、3%蔗糖、0.6%瓊脂，pH 5.8，針對(duì)6-BA，2-ip和NAA，用三因素D-飽和最優(yōu)設(shè)計(jì)配置10個(gè)組合，篩選出了適合誘導(dǎo)莖段和葉片愈傷組織的培養(yǎng)基，莖段愈傷組織分化芽的培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。

4 結(jié)論

對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA，2-ip和NAA應(yīng)用三因素D-飽和最優(yōu)設(shè)計(jì)方法，在配置的10個(gè)組合培養(yǎng)基中篩選出了WPM +6-BA 2.25 mg/L+2-ip 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L為最適合誘導(dǎo)莖段愈傷組織的培養(yǎng)基。WPM+6-BA 3.4 mg/L+2-ip 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L為葉片最適合誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基；WPM+6-BA 3.4 mg/L+2-ip 3.0 mg/L為最適合莖段愈傷組織分化芽的培養(yǎng)基，WPM+NAA 0.4 mg/L為適合的生根培養(yǎng)基。

從試管苗莖段和葉片的再生能力比較試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用葉片誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和繼代次數(shù)的增加，愈傷組織逐漸變黑死亡，未能分化出芽。初步判斷試驗(yàn)中篩選的培養(yǎng)基適合試管苗莖段的植株再生培養(yǎng)，而不適合葉片的植株再生培養(yǎng)。