劉 紅 張維新 張玲燕

(河南省鄭州市中醫(yī)院內(nèi)五科，鄭州450000)

左心室肥厚(Left ventricular hypertrophy，LVH)是心肌重塑的一個(gè)特征，是一種機(jī)體對(duì)動(dòng)脈高血壓或主動(dòng)脈瓣狹窄引起的壓力超負(fù)荷的補(bǔ)償機(jī)制。左心室肥厚是心律失常、猝死、舒張功能障礙和充血性心力衰竭的危險(xiǎn)因素[1]。成人心肌細(xì)胞無(wú)法通過(guò)提高蛋白質(zhì)合成速率來(lái)應(yīng)對(duì)壓力和生長(zhǎng)刺激，從而導(dǎo)致細(xì)胞體積增加。其他研究顯示，除心肌細(xì)胞肥大外，壓力超負(fù)荷也可導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)生成，以及血管周圍和間質(zhì)膠原沉積增加[2]。壓力超負(fù)荷導(dǎo)致心臟組織中配體的局部釋放，包括生長(zhǎng)因子如血小板源生長(zhǎng)因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)激活其酪氨酸激酶受體和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)激活其絲氨酸-蘇氨酸激酶受體[3,4]。多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均涉及心肌細(xì)胞肥大的病理過(guò)程，其中包括絲氨酸-蘇氨酸激酶(c-Raf)及其下游分子絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[5,6]。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(Extra-cellular signal-regulated kinases，ERK 1/2)是MAPK的一個(gè)亞組，在調(diào)節(jié)導(dǎo)致心肌肥厚的基因表達(dá)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7,8]。ERK 1/2的磷酸化與心臟轉(zhuǎn)錄因子c-myc和GATA4的上調(diào)有關(guān)[9]。GATA4是大多數(shù)心臟表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因和肥大相關(guān)基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其中包括心房利鈉肽(Atrial natriuretic peptide，ANP)基因[10,11]。在人類中，c-Raf的突變與遺傳性疾病如Noonan綜合征中的心臟肥大有關(guān)，這表明c-Raf在心臟肥大的病理生理調(diào)節(jié)中具有重要作用[12]。多項(xiàng)數(shù)據(jù)表明，腫瘤發(fā)生與調(diào)節(jié)心臟肥大的信號(hào)通路之間存在相似性，其中包括c-Raf/ERK1/2 信號(hào)通路[13-15]。眾所周知，醛固酮是一種可引起心肌肥厚的類固醇類激素，為腎素-血管緊張素系統(tǒng)的一部分[16]。螺內(nèi)酯是一種醛固酮受體拮抗劑，多項(xiàng)研究均證實(shí)螺內(nèi)酯可用于治療慢性心力衰竭、抑制快速心房起搏所致電重構(gòu)、調(diào)節(jié)心肌膠原重建等作用[17-18]，最近動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯勘砻鳎輧?nèi)酯可預(yù)防由于異丙腎上腺素引起的心肌肥厚[19]。本研究旨在探討螺內(nèi)酯對(duì)壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的左心室肥厚大鼠免疫及炎癥因子的影響，及其在左心室肥厚中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 螺內(nèi)酯購(gòu)自江蘇正大豐海制藥有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字：H32020077)； van Gieson染色液購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；PDGF-BB和TGF-β1 ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司；組織裂解緩沖液購(gòu)自瑞士Roche公司； BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司； RNeasy Mini試劑盒購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司； RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、MultiScribe逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP和RNase抑制劑、Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；Synergy Brands(SYBR)Premix Ex TaqTM試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa Holdingsn公司；Sircol Soluble Collagen Assay膠原蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自英國(guó)Biocolor公司；兔抗大鼠磷酸化-ERK1/2、小鼠抗大鼠總ERK1/2、兔抗大鼠磷酸化c-Raf和兔抗大鼠總c-Raf抗體均購(gòu)自R&D Systems公司；HRP-標(biāo)記的二抗購(gòu)自艾美捷科技有限公司；增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光ECL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Perkin-Elmer公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 使用6～8周體重210～260 g的雄性SD大鼠(四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)進(jìn)行研究，嚴(yán)格按照國(guó)家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南中的建議進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本研究已獲得動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將40只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)、模型組(Model)、螺內(nèi)酯組(Spironolactone)和假手術(shù)組(Sham)，每組10只。在本研究中，對(duì)照組大鼠為相同飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)但未進(jìn)行建模的大鼠；模型組大鼠為建立壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的左心室肥厚模型的大鼠；螺內(nèi)酯組大鼠為應(yīng)用螺內(nèi)酯處理的左心室肥厚模型大鼠；假手術(shù)組大鼠為只進(jìn)行開(kāi)腹手術(shù)操作但未進(jìn)行腹主動(dòng)脈縮窄絲線結(jié)扎的大鼠。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型建立 參考胡詠梅等文獻(xiàn)報(bào)道的方法[20]，采用腹主動(dòng)脈縮窄法建立壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的左心室肥厚大鼠模型。所有手術(shù)均在2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉下進(jìn)行，在大鼠雙側(cè)腎動(dòng)脈上方游離腹主動(dòng)脈，在主動(dòng)脈長(zhǎng)軸旁平行放置直徑0.7 mm 的7號(hào)針頭，然后用絲線將腹主動(dòng)脈及針頭捆扎在一起，然后抽出針頭，即可造成腹主動(dòng)脈狹窄。假手術(shù)組未用絲線結(jié)扎，其他步驟與模型組相同。術(shù)后第4周對(duì)大鼠進(jìn)行心臟超聲檢查，若舒張末期左室后壁厚度和舒張末期室間隔厚度明顯增加則證實(shí)形成左心室肥厚。

1.2.2治療方案 將20只建模后的大鼠隨機(jī)分為螺內(nèi)酯組和模型組，每組各10只。對(duì)照組大鼠未做手術(shù)處理。將螺內(nèi)酯溶于生理鹽水(0.9%NaCl)中，每天按照20 mg/kg的劑量對(duì)螺內(nèi)酯組大鼠進(jìn)行灌胃，根據(jù)大鼠體重計(jì)算螺內(nèi)酯用量，將螺內(nèi)酯溶解到2 ml生理鹽水中，然后對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃。為了排除溶劑對(duì)本試驗(yàn)的影響，因此本研究對(duì)模型組、假手術(shù)組和對(duì)照組大鼠灌胃等體積(2 ml)的生理鹽水，共治療8周。最后一次灌胃后12 h內(nèi)處死大鼠，收集血液和左心室組織用于后續(xù)分析。

1.2.3組織學(xué)分析 將左心室切除并快速固定在10%福爾馬林中，石蠟包埋。切片厚度為7 μm，將切片用van Gieson染色以檢測(cè)心室的膠原沉積[21]。在光學(xué)顯微鏡下觀察染色切片并用數(shù)碼相機(jī)拍照。

1.2.4PDGF-BB和TGF-β1的檢測(cè) 采用ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠左心室PDGF-BB和TGF-β1的水平。將100 mg快速冷凍的左心室組織在500 μl含有50 mmol/L Tris HCl (pH 7.5)、150 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、0.25%Triton X-100、0.1%NP-40、1 mmol/L PMSF和cocktail蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中勻漿。裂解物在4℃下以14 000 g離心15 min。將ELISA水平標(biāo)準(zhǔn)化為每種樣品的總蛋白質(zhì)水平。

1.2.5RT-qPCR 使用RNeasy Mini試劑盒從大鼠左心室心肌中提取總RNA。使用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、MultiScribe逆轉(zhuǎn)錄酶(50 U/μl)、dNTP和RNase抑制劑(20 U/μl)反轉(zhuǎn)總RNA(2.5 μg)。通過(guò)Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)和Synergy Brands(SYBR)Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)體系為25 μl。引物序列如下：ANP，上游：5′- AGC TCA AGC GAG GTC GGA TG-3′，下游：5′- GGC TGC CTG TCC TGT TGG TT -3′。GATA4，上游：5′- CGA AAA GTC GAG GCC TCA AAC TTT G-3′，下游：5′- CGG CCA TGA AGC CAA TCC-3′。c-myc，上游：5′- AGC TCA GTC AGC AGG GAG TG-3′，下游：5′- GGC TGT GTT TGC CTG TCC TG-3′。GAPDH，上游：5′- TCG GGG TGA TGC CTC AAC CT-3′，下游：5′- CGC ACA GTG AAG GCT CAC T-3′。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)，60℃延伸60 s。使用GAPDH作為內(nèi)參基因。通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6膠原蛋白檢測(cè) 使用Sircol Soluble Collagen Assay膠原蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定大鼠左心室勻漿中的總可溶性膠原。將1 ml天狼星紅染料加入到10 μl 心室勻漿中，并在室溫下孵育30 min。在12,000 g離心10 min后，將沉淀的膠原-染料復(fù)合物用1 ml 0.5 mol/L NaOH溶解，并在540 nm處讀取吸光度。定量結(jié)果表示為膠原蛋白與總蛋白含量的比值。

1.2.7蛋白質(zhì)印跡分析 將大鼠心室組織在50 mmol/L Tris HCl (pH 7.5)、150 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、0.25%Triton X-100、0.1%NP-40、1 mmol/L PMSF和cocktail蛋白酶抑制劑中裂解。通過(guò)BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離蛋白質(zhì)(每個(gè)泳道100 μg)并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。室溫下將膜在含有0.1%吐溫20和5%脫脂乳的Tris緩沖鹽水(pH7.4)中封閉1 h，并在4℃下與以下一抗孵育過(guò)夜：兔抗大鼠磷酸化-ERK1/2 (1∶1 000)、小鼠抗大鼠總ERK1/2(1∶1 000)、兔抗大鼠磷酸化c-Raf(1∶1 000)和兔抗大鼠總c-Raf(1∶1 000)。將膜在含有0.1% Tween-20的TBS中洗滌1 h，并用HRP-標(biāo)記的二抗(1∶2 000)在含有0.1%吐溫20和5%脫脂乳的TBS中孵育1 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光ECL試劑盒進(jìn)行顯影。

2 結(jié)果

2.1螺內(nèi)酯可抑制壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠左心室肥厚 本研究通過(guò)大鼠左心室重量與體重比值(VW/BW)來(lái)評(píng)價(jià)螺內(nèi)酯對(duì)壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠左心室肥厚的影響。將大鼠麻醉開(kāi)胸后迅速去除心臟，首先用冰生理鹽水洗清，然后濾紙吸干水分，減去心房及血管組織，分別沿室間隔分離左心室，用電子天平稱取左心室重量。圖1顯示，模型組大鼠VW/BW(3.62±0.31 mg/kg)比對(duì)照組(2.65±0.23 mg/kg)顯著增加了36.60%，而螺內(nèi)酯可顯著降低大鼠的VW/BW(2.78±0.24 mg/kg)(P<0.05)。

圖1 螺內(nèi)酯對(duì)大鼠左心室重量與體重比值(VW/BW)的影響Fig.1 Effect of spironolactone on ratio of left ventricular weight to body weight (VW/BW) in ratsNote: Compared with the control group,*.P<0.05.

2.2螺內(nèi)酯可抑制壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠左心室膠原蛋白沉積 van Gieson染色結(jié)果顯示，模型組大鼠心室血管周圍間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)明顯的膠原蛋白沉積，而用螺內(nèi)酯處理可明顯降低膠原蛋白的沉積(圖2A)。定量結(jié)果描述為膠原蛋白含量與總蛋白含量的比值，如圖2B顯示，與對(duì)照組相比(5.21±0.34 μg/mg protein)，模型組大鼠心室總膠原蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)了46.45%(7.63±0.71 μg/mg protein)。而螺內(nèi)酯組(5.68±0.45 μg/mg protein)顯著低于模型組，且與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3螺內(nèi)酯可下調(diào)壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠促肥大生長(zhǎng)因子的表達(dá) 采用ELISA法檢測(cè)大鼠左心室促肥大因子血小板源生長(zhǎng)因子BB(PDGF-BB)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)的表達(dá)，如圖3所示，與對(duì)照組相比(2.21±0.18 pg/mg protein)， 模型組大鼠的PDGF-BB表達(dá)量顯著上調(diào)了70.14%(3.76±0.32 pg/mg protein)，螺內(nèi)酯組(2.54±0.22 pg/mg protein)顯著低于模型組，且與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比(3.14±0.28 pg/mg protein)，模型組大鼠的TGF-β1表達(dá)量顯著上調(diào)了118.47%(6.86±0.60 pg/mg protein)。然而，螺內(nèi)酯組(4.02±0.35 pg/mg protein)顯著低于模型組，且與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 螺內(nèi)酯對(duì)大鼠左心室膠原蛋白沉積的影響Fig.2 Effect of spironolactone on left ventricular collagen deposition in ratsNote: A.Van Gieson staining legend;B.Quantitative analysis of total ventricular collagen in rats;compared with control group,*.P<0.05.

圖3 螺內(nèi)酯對(duì)大鼠心室組織PDGF-BB (A)和TGF-β1 (B)表達(dá)的影響Fig.3 Effect of spironolactone on expression of PDGF-BB (A) and TGF-β1(B) in rat ventricular tissueNote: Compared with the control group,*.P<0.05.

2.4螺內(nèi)酯可抑制壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠c-Raf/ERK1/2信號(hào)通路的活化 采用Western blot檢測(cè)大鼠左心室組織中c-Raf和ERK1/2的活化情況，研究如圖4所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠的c-Raf和ERK1/2磷酸化水平分別顯著上調(diào)了106.25%和74.00%，而螺內(nèi)酯組顯著低于模型組，且與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5螺內(nèi)酯可抑制壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠促增殖和促肥大轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá) 采用RT-qPCR檢測(cè)大鼠左心室組織中促增殖核轉(zhuǎn)錄因子c-myc和促肥大轉(zhuǎn)錄因子GATA4的表達(dá)情況，如圖5A、B所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠的c-myc和GATA4 mRNA表達(dá)水平分別顯著上調(diào)了115.01%和254.00%，而螺內(nèi)酯處理可抑制c-myc和GATA4 mRNA的上調(diào)，顯著低于模型組，且與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，心房利鈉肽(ANP)基因是一種促肥大基因，其轉(zhuǎn)錄受GATA4直接調(diào)控。圖5C顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠的ANP mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)了421.00%，而螺內(nèi)酯處理可抑制ANP mRNA的上調(diào)，顯著低于模型組，且與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 螺內(nèi)酯對(duì)大鼠心室組織c-Raf和ERK1/2磷酸化的影響Fig.4 Effect of spironolactone on c-Raf and ERK1/2 ph-osphorylation in rat ventricular tissueNote: A and B.Quantitative analysis of c-Raf phosphorylation and protein bands; C and D.Quantitative analysis of ERK1/2 phosphorylation and protein bands;compared with the control group,*.P<0.05.

圖5 螺內(nèi)酯對(duì)大鼠心室組織c-myc (A)、GATA4 (B)、ANP (C) mRNA表達(dá)的影響Fig.5 Effect of spironolactone on expression of c-myc (A),GATA4 (B) and ANP (C) mRNA in rat ventricular tissueNote: Compared with the control group,*.P<0.05.

3 討論

醛固酮是一種可引起心肌肥厚的類固醇類激素，為腎素-血管緊張素系統(tǒng)的一部分。螺內(nèi)酯是一種醛固酮受體拮抗劑，多項(xiàng)研究均證實(shí)螺內(nèi)酯可用于治療慢性心力衰竭、抑制快速心房起搏所致電重構(gòu)、調(diào)節(jié)心肌膠原重建等作用，最近動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯勘砻?，螺?nèi)酯可預(yù)防由于異丙腎上腺素引起的心肌肥厚[17-19]。本研究采用腹主動(dòng)脈縮窄法建立壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的左心室肥厚大鼠模型，然后探討了螺內(nèi)酯對(duì)大鼠左心室重量與體重比值(VW/BW)的影響，研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的VW/BW顯著增加，而螺內(nèi)酯可顯著降低大鼠的VW/BW。說(shuō)明螺內(nèi)酯可有效抑制壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的左心室肥厚。由于心室膠原蛋白沉積是心室肥厚的主要病理基礎(chǔ)，本研究結(jié)果顯示螺內(nèi)酯處理可有效降低大鼠心室血管周圍間質(zhì)的膠原蛋白沉積，從而防止左心室肥厚。

前人研究顯示，壓力超負(fù)荷可導(dǎo)致心臟組織中配體的局部釋放，包括生長(zhǎng)因子PDGF和TGF-β[4]。PDGF-BB和TGF-β1均是促肥大生長(zhǎng)因子，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，并且PDGF-BB和TGF-β1的上調(diào)可促進(jìn)間質(zhì)膠原沉積，進(jìn)而導(dǎo)致心肌肥大。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的PDGF-BB和TGF-β1表達(dá)量顯著上調(diào)，而螺內(nèi)酯處理可顯著抑制PDGF-BB和TGF-β1的上調(diào)，從而阻斷心室肥大的發(fā)病過(guò)程。

多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均涉及心肌細(xì)胞肥大的病理過(guò)程，c-Raf/ERK1/2信號(hào)通路在壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠左心室肥厚中具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[9]。在人類中，c-Raf的突變與遺傳性疾病如Noonan綜合征中的心臟肥大有關(guān)，這表明c-Raf在心臟肥大的病理生理調(diào)節(jié)中具有重要作用[12]。ERK1/2是c-Raf的下游分子，在調(diào)節(jié)導(dǎo)致心肌肥厚的基因表達(dá)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的c-Raf和ERK1/2磷酸化水平分別顯著上調(diào)了106.25%和74.00%，而螺內(nèi)酯可明顯抑制c-Raf和ERK1/2的活化。

ERK1/2的磷酸化與心臟轉(zhuǎn)錄因子c-myc和GATA4的上調(diào)有關(guān)[9,23,24]。ERK1/2的磷酸化可誘導(dǎo)c-myc的高表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、纖維化和膠原沉積[22]。c-Raf/ERK1/2通路的激活也可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大中的心臟轉(zhuǎn)錄因子GATA4的高表達(dá)[9]。本研究結(jié)果與其他報(bào)道一致，c-Raf/ERK1/2信號(hào)通路的磷酸化和活化伴隨著促增殖核轉(zhuǎn)錄因子c-myc的上調(diào)，以及促肥大轉(zhuǎn)錄因子GATA4的上調(diào)，這些因子與細(xì)胞增殖和纖維化有關(guān)[25]。此外，GATA4可控制促肥大基因ANP的轉(zhuǎn)錄[26]，本研究中也發(fā)現(xiàn)了ANP在模型組大鼠中顯著上調(diào)。然而，螺內(nèi)酯處理則可顯著抑制c-myc、GATA4和ANP的表達(dá)。

綜上所述，本研究表明螺內(nèi)酯可有效抑制壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠左心室肥厚。主要是由于螺內(nèi)酯抑制了促肥大生長(zhǎng)因子(PDGF-BB和TGF-β1)的表達(dá)，減弱了膠原蛋白沉積。此外，螺內(nèi)酯可通過(guò)抑制c-Raf/ERK1/2信號(hào)通路的活化來(lái)阻斷促肥大相關(guān)因子的表達(dá)，并降低炎癥反應(yīng)，從而預(yù)防左心室肥厚。