曹艷華 薛 霞 李 娟 曹佩華 欒 云

(山東大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部,濟(jì)南250033)

腎透明細(xì)胞癌(Renal clear cell carcinoma,RCC)簡(jiǎn)稱腎癌，是起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，是泌尿系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤之一，在泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中占第二位，在腎癌發(fā)病患者中大約有25%的腎癌患者發(fā)展成為晚期腎癌或者轉(zhuǎn)移腎癌[1,2]。隨著現(xiàn)代人生活飲食方式的改變，RCC的發(fā)病率越來越高，也越來越年輕化[3]。但其發(fā)病原因尚不明確，主要與內(nèi)在基因和環(huán)境因素有關(guān)。目前，RCC缺乏早期的診斷標(biāo)志，晚期的和轉(zhuǎn)移的RCC常對(duì)化療藥物(如吉西他濱、長(zhǎng)春新堿、5-氟尿嘧啶等)和激素不太敏感，同時(shí)對(duì)細(xì)胞因子如干擾素α、IL-2等的治療有效率也偏低，且長(zhǎng)期使用的副作用較大，因此，目前的治療手段很難為進(jìn)展期行手術(shù)治療后的患者提供持續(xù)有效的后期治療，迫切需要對(duì)傳統(tǒng)的治療方法進(jìn)行革新[4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有局部侵襲的腎透明細(xì)胞癌患者行腎癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)35%～65%[5]。因此，尋找新的方法來提高患者的生存率、無復(fù)發(fā)生存率以及生活質(zhì)量十分有意義。

傘形科植物川芎是我國(guó)的傳統(tǒng)中草藥，具有良好的活血化瘀功效，在我國(guó)應(yīng)用歷史悠久，其提取單體川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)是它的主要有效成分之一[6]。川芎嗪是一種生物堿，無色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)80～82℃(顯微測(cè)定)，沸點(diǎn)190℃。具有異臭，有吸濕性，易升華，易溶于二甲基亞砜、石油醚，溶于氯仿、稀鹽酸，微溶于乙醚，不溶于冷水。具有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)，為四甲基吡嗪，自1957年被分離提純以來，其人工合成工藝已日臻成熟。目前，該藥已廣泛應(yīng)用到多種疾病的治療和預(yù)防之中[7,8]。近年來，川芎嗪的抗腫瘤作用在許多研究中得到了證實(shí)，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注該藥在抗癌方面的作用。

上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transformation，EMT)在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中扮演了重要角色，腫瘤細(xì)胞EMT的程度直接決定了腫瘤的惡性程度[9]。 EMT發(fā)生時(shí)伴有顯著的形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為上皮樣細(xì)胞少而間質(zhì)細(xì)胞增多。 EMT最顯著的特征是上皮標(biāo)志物N-cadherin間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白和有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)[10]。 EMT可通過不同的信號(hào)通路如Notch、 Wnt 等通路激活，這些分子通路受到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子 Snail 和 Slug 的調(diào)控來誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[11]。

因此，本研究采用RCC細(xì)胞系A(chǔ)498，主要探討川芎嗪是否通過促進(jìn)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)從而影響RCC惡性生物行為。

1 材料與方法

1.1材料 川芎嗪?jiǎn)误w購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；腎透明細(xì)胞癌A498細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；6周齡雄性裸鼠由山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；蛋白定量試劑盒、SDS凝膠試劑盒、二甲基亞砜(DMSO)細(xì)胞裂解液、結(jié)晶紫、高錳酸鉀、草酸、冰醋酸和磷鎢酸均購(gòu)自西安科昊生物有限公司；蛋白酶抑制劑購(gòu)自羅氏試劑生物有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、優(yōu)級(jí)胎牛血清、胰蛋白酶消化液均購(gòu)自美國(guó) HyClone；青鏈霉素混合液、4%多聚甲醛、天狼星紅染液、苯胺藍(lán)和蘇木素均購(gòu)自北京碧云天有限公司，Actin、N-cadherin、Snail和Slug抗體、兔二抗購(gòu)自英國(guó) Abcam；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó) Advansta；Transwell小室購(gòu)自康寧。

1.2方法

1.2.1MTT增殖實(shí)驗(yàn) 川芎嗪?jiǎn)误w先用DMSO溶解再用PBS溶解為20 mg/ml的母液，pH=7.4。A498細(xì)胞計(jì)數(shù)4×105鋪板，培養(yǎng)條件 5%CO2，37℃孵箱分別培養(yǎng)24、48和72 h。隨后每孔加入20 μl的MTT，孵箱放置4 h后吸取培養(yǎng)液，每孔加入150 μl 二甲基亞砜，振蕩15 min。酶標(biāo)儀570 nm 測(cè)吸光值。

1.2.2克隆形成實(shí)驗(yàn) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A498細(xì)胞，胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)，6孔板，每孔300個(gè)細(xì)胞，2 ml培養(yǎng)液，培養(yǎng)15 d后，PBS沖洗，室溫風(fēng)干，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)。

1.2.3Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A498細(xì)胞，無血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至5×104，Transwell下室加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液600 μl，上室加入200 μl無血清DMEM細(xì)胞懸液。鋪板12 h后PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，放置室溫自然風(fēng)干。隨后結(jié)晶紫染色10 min，PBS沖洗3次，棉簽輕輕擦去上層未遷移的細(xì)胞，33%乙酸脫色，酶標(biāo)儀570 nm讀值。

1.2.4Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A498細(xì)胞，無血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至5×104，Transwell下室加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液600 μl，上室先鋪水化的BD膠基底膜，再加200 μl無血清細(xì)胞懸液。鋪板24 h后PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，放置室溫自然風(fēng)干。隨后結(jié)晶紫染色10 min，PBS沖洗3次，棉簽輕輕擦去上層未遷移的細(xì)胞，33%乙酸脫色，酶標(biāo)儀570 nm讀值。

1.2.5裸鼠皮下荷瘤模型 裸鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組和川芎嗪給藥組各7只，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A498細(xì)胞，調(diào)整至5×106個(gè)/200 μl，將細(xì)胞在無血清DMEM培養(yǎng)液中混勻，分別接種至兩組裸鼠，給藥組，川芎嗪5 mg/kg每3 d腹腔給藥1次。裸鼠7 d后皮下成瘤，游標(biāo)卡尺測(cè)腫瘤大小，每2 d測(cè)1次，長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，計(jì)算腫瘤體積：公式(V) =ab2/2。

1.2.6Western blot 調(diào)整A549細(xì)胞數(shù)4×105個(gè)/孔，直接鋪板接種6孔板，培養(yǎng)箱設(shè)定37℃、5%CO2進(jìn)行培養(yǎng)，80%細(xì)胞密度時(shí)收集細(xì)胞，PBS洗滌1 min后加含有蛋白酶抑制劑的裂解液放置冰上裂解，30 min 后高速離心吸抽蛋白。蛋白定量完成后加上樣緩沖液，沸水煮5 min。SDS-PACE電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作，轉(zhuǎn)膜成功后用脫脂牛奶進(jìn)行封閉，PBST清洗，均為1∶1 000稀釋一抗，室溫孵育1 h后4℃過夜。次日反復(fù)清洗條帶，加二抗室溫孵育90 min，PBS反復(fù)沖洗，發(fā)光拍照。

2 結(jié)果

2.1不同濃度川芎嗪處理后抑制A498細(xì)胞增殖能力 不同濃度的川芎嗪作用 A498 細(xì)胞 24、48、72 h 后，MTT 比色法測(cè)得的各組OD570值。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各處理組(≥0.2 mg/ml)與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)0、0.2、0.4、0.8及1 mg/ml川芎嗪處理組能有效抑制 A498 細(xì)胞的增殖，并隨著川芎嗪濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖的抑制率增加(P<0.05)。當(dāng)川芎嗪的藥物濃度<0.2 mg/ml時(shí)，對(duì)細(xì)胞的抑制作用不明顯(P>0.05)，即使時(shí)間延長(zhǎng)未見明顯的抑制作用。以川芎嗪作用24 h細(xì)胞的存活率分別為 98.7±8.8、93.6±6.4、90.2±5.1、82.3±4.6、63.6±5.3;作用48 h的細(xì)胞存活率為 95.6±8.7、90.2±6.2、82.3±5.7、73.6±6.2、52.9±4.4；作用72 h的細(xì)胞抑制率為94.3±7.1、86.6±6.3、72.3±5.7、61.2±6.4、40.6±3.8。川芎嗪作用24 h的IC50約為1.24 mg/ml，48 h的IC50約為0.1.05 mg/ml，72 h的IC50約0.95 mg/ml。川芎嗪對(duì)A498細(xì)胞增殖的抑制用在一定的濃度(≥0.2 mg/ml)和時(shí)間范圍內(nèi)，表現(xiàn)出時(shí)效與量效關(guān)系。見圖1。

2.2不同濃度川芎嗪處理后抑制A498細(xì)胞克隆形成能力 分別以0、0.2、0.4、0.8及1 mg/ml川芎嗪處理A498 細(xì)胞，與0 mg/ml相比，其余各組均抑制了A498，且隨著藥物濃度的增加，抑制作用越明顯(P<0.05)， 見圖2。

2.3不同濃度川芎嗪處理后抑制A498細(xì)胞遷移能力 分別以0、0.2、0.4、0.8及1 mg/ml川芎嗪處理A498 細(xì)胞，與0 mg/ml相比，其余各組均抑制了A498的遷移能力，且隨著藥物濃度的增加，抑制作用顯著增加(P<0.05)，見圖3。

2.4不同濃度川芎嗪處理后抑制A498細(xì)胞侵襲能力 分別以0、0.2、0.4、0.8及1 mg/ml川芎嗪處理A498 細(xì)胞，與0 mg/ml相比，其余各組均抑制了A498細(xì)胞的侵襲能力，且隨著藥物濃度越大，侵襲能力抑制作用越明顯(P<0.05)，見圖4。

2.5川芎嗪抑制了腎透明細(xì)胞癌在裸鼠體內(nèi)的增殖能力 以5 mg/kg川芎嗪給藥處理，27 d后處死小鼠，測(cè)腫瘤大小并繪制腫瘤成長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示川芎嗪處理組顯著抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生長(zhǎng)。從腫瘤生長(zhǎng)曲線可以看出川芎嗪給藥處理后腫瘤生長(zhǎng)明顯被抑制，且腫瘤體積較對(duì)照組顯著減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

圖1 不同濃度的川芎嗪作用不同時(shí)間對(duì) A498 細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of different concentrations of ligustrazine on proliferation of A498 cells at different timeNote: *.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

圖2 不同濃度川芎嗪處理后A498細(xì)胞克隆形成能力Fig.2 Cloning ability of A498 cells after treatment with different concentrations of tetramethylpyrazineNote: *.P<0.05，***.P<0.001.

圖4 不同濃度川芎嗪處理后A498細(xì)胞侵襲能力影響Fig.4 Effects of different concentrations of ligustrazine on invasive ability of A498 cellsNote: *.P<0.05，***.P<0.001.

圖5 川芎嗪對(duì)腎透明細(xì)胞癌在裸鼠體內(nèi)的增殖能力影響Fig.5 Effect of ligustrazine on proliferation of renal clear cell carcinoma in nude mice

圖6 不同濃度川芎嗪處理后A498細(xì)胞EMT標(biāo)志蛋白N-cadherin、Snail和Slug表達(dá)的影響Fig.6 Effects of different concentrations of ligustrazine on expression of EMT marker proteins N-cadherin,Snail and Slug in A498 cells

2.6川芎嗪抑制了腎透明細(xì)胞癌EMT機(jī)制 川芎嗪對(duì)A498細(xì)胞中EMT標(biāo)志蛋白N-cadherin、Snail和Slug表達(dá)的影響，由Western blot結(jié)果可知,隨著濃度和時(shí)間的增加，川芎嗪抑制了N-cadherin、Snail和Slug的表達(dá)(P<0.05)，見圖6。

3 討論

川芎為傘形科植物川芎的干燥根莖，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛、行氣開郁等諸多功效。川芎嗪是從川芎根莖中分離的藥理活性成分之一，長(zhǎng)期以來被廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療缺血性腦中風(fēng)和心血管疾病。除了在傳統(tǒng)領(lǐng)域的應(yīng)用外，川芎嗪一些新的藥理活性陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，如對(duì)抗自由基，改善微循環(huán)以及抗腫瘤作用[24]?，F(xiàn)有研究表明川芎嗪對(duì)肺間質(zhì)纖維化、術(shù)后腸黏連性的腸梗阻、過敏性紫癜等疾病均有療效。此外，川芎嗪在腫瘤的預(yù)防和治療方面的作用也日益得到重視。其中有文獻(xiàn)報(bào)道TMP能提高NK細(xì)胞活性及通過抑制可溶性MICA表達(dá)水平避免抑制NK細(xì)胞毒性從而起到抑制腫瘤的作用；在體內(nèi)和體外TMP通過下調(diào)NF-κB表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，通過下調(diào)趨化因子受體CXCR4表達(dá)保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤，通過調(diào)節(jié)ERK1/2和p38信號(hào)通路從而減少白細(xì)胞介素的表達(dá)，從而抑制人類卵巢癌的遷移，以及通過多種調(diào)節(jié)抑制肝癌、乳腺癌的增殖遷移等[25]。研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪能夠保護(hù)血管內(nèi)皮，能對(duì)損傷后的血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)起到保護(hù)作用。川芎嗪還能對(duì)腎功能產(chǎn)生影響，具有明顯的利尿作用，增加腎血流量，提高腎小球的濾過率；對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)起到鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜的作用；減少炎癥反應(yīng)；對(duì)癌癥的某些過程產(chǎn)生抑制作用等[26]。

腎癌導(dǎo)致死亡的主要原因是由于腎癌細(xì)胞在體內(nèi)的增殖形成新的轉(zhuǎn)移病灶。大多數(shù)腎癌患者被發(fā)現(xiàn)是多處于晚期，因?yàn)槟I癌細(xì)胞已經(jīng)在體內(nèi)轉(zhuǎn)移增殖，因此腎癌細(xì)胞在體內(nèi)增殖能力的強(qiáng)弱對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展顯得尤為重要[12,13]。因?yàn)槟[瘤的惡性生物學(xué)行為主要包括了腫瘤細(xì)胞的增殖以及其侵襲能力。細(xì)胞基因突變可能是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞獲得無限增殖的能力，而腫瘤細(xì)胞的增殖能力對(duì)腫瘤在體內(nèi)的增殖生存起到至關(guān)重要的作用[14]。本研究通過MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了川芎嗪?jiǎn)误w對(duì)腎透明細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.4 mg/ml川芎嗪處理腎透明細(xì)胞癌A498細(xì)胞48 h后可以顯著抑制其增殖能力和克隆形成，1 mg/ml作用72 h后抑制作用更加明顯，說明川芎嗪對(duì)腎透明細(xì)胞癌A498細(xì)胞增殖能力具有顯著的抑制作用。細(xì)胞遷移和侵襲能力是腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)端形成新病灶的主要原因[15]，特別是腫瘤細(xì)胞的侵襲能力越強(qiáng)，其對(duì)正常組織的侵潤(rùn)能力越強(qiáng)，大多數(shù)腫瘤患者死亡原因都是后期腫瘤在體內(nèi)擴(kuò)散轉(zhuǎn)移形成多處病變最終導(dǎo)致死亡的。因此針對(duì)腎透明細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移和侵襲能力研究一直是其治療的研究熱點(diǎn)[16,17]。本研究中，透過Transwell下室遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)?zāi)M腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移和侵襲環(huán)境，結(jié)果發(fā)現(xiàn)川芎嗪可以很好地抑制腎透明細(xì)胞癌A498細(xì)胞的遷移和侵襲能力，為川芎嗪的抑癌作用研究提供了有力的證明。

EMT是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲最經(jīng)典分子機(jī)制，腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的程度直接決定了腫瘤細(xì)胞的惡性程度[18]。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)最顯著的特征是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白N-cadherin表達(dá)上調(diào)[19]。同時(shí)腫瘤細(xì)胞內(nèi)Notch/Wnt 等通路信號(hào)活化可以激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug來調(diào)控誘導(dǎo) EMT 的發(fā)生[20]。N-cadherin作為EMT的標(biāo)志蛋白在正常組織中表達(dá)很低，細(xì)胞發(fā)生癌變后其表達(dá)量增加促進(jìn)EMT的發(fā)生并促使血管再生，增加腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[21,22]。Snail是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子其可以與Smad 相互作用促進(jìn)N-cadherin的表達(dá)，從而增加腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[23]。本研究通過Western blot 檢測(cè)了不同濃度川穹嗪處理后A498細(xì)胞不同時(shí)間后EMT 標(biāo)志物和調(diào)控因子蛋白表達(dá)水平的變化，結(jié)果川芎嗪同樣顯著抑制N-cadherin、Snail和Slug的表達(dá)。

本研究體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明川芎嗪抑制腎透明細(xì)胞癌A498細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞遷移和侵襲能力，說明川芎嗪可以抑制腎透明細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移和形成遠(yuǎn)端病灶的能力。此外，體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示川芎嗪顯著抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生長(zhǎng)，結(jié)果同細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一致。Western blot結(jié)果可知,隨著給藥濃度和時(shí)間的增加，川芎嗪抑制了N-cadherin、Snail和Slug的表達(dá)，抑制EMT發(fā)生從而抑制腎透明細(xì)胞癌的增殖、轉(zhuǎn)移和形成遠(yuǎn)端病灶。

綜上所述，本論文首次研究中藥提取物川芎嗪對(duì)腎癌細(xì)胞A498的增殖、遷移和侵襲能力的體內(nèi)和體外研究，同時(shí)首次探討了川芎嗪對(duì)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移侵襲經(jīng)典途徑EMT機(jī)制的影響，發(fā)現(xiàn)川芎嗪在體內(nèi)外可以通過抑制EMT發(fā)生從而抑制腎癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。川芎嗪在腎透明細(xì)胞癌中最先結(jié)合并發(fā)揮作用的首觸分子是如何具體影響EMT發(fā)生的，有待于進(jìn)一步的研究探索。