魏琦麟，向 蓉，袁明貴，彭新宇，康樺華，余丹妮，徐志宏

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070； 2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所 廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣州 510640)

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)在厭氧發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一系列的短鏈脂肪酸(SCFAs)，其代謝產(chǎn)物主要為丁酸和丁醇，乙酸和丙酮是副產(chǎn)物，還有少量的乳酸和乙醇產(chǎn)生[1]。丁酸梭菌在腸道內(nèi)定植后，主要代謝產(chǎn)生乙酸、丁酸和琥珀酸等[2]，90%以上的SCFAs通過(guò)質(zhì)子化和陰離子擴(kuò)散的方式被腸上皮細(xì)胞吸收，只有5%～10%被排泄到體外[3]。SCFAs不僅可以降低腸道pH，抑制有害菌的生長(zhǎng)，還可以作為腸上皮細(xì)胞能量代謝和生長(zhǎng)發(fā)育的重要能量來(lái)源，維持腸道健康。SCFAs中的丁酸可以作為配體激活特異性G蛋白偶聯(lián)受體，激活腸黏膜免疫活性，在一定程度上起到增強(qiáng)免疫力的作用[4]。因此，丁酸梭菌發(fā)酵過(guò)程中的代謝產(chǎn)物及其功能作用受到廣泛關(guān)注。

生物樣品中SCFAs的分析方法較多，如氣相色譜法(GC)[5]、高效液相色譜法(HPLC)[6-7]、毛細(xì)管電泳法(CE)[8]和離子排斥色譜法(IC)[9]等。Chen等[10]將人體的血液樣品經(jīng)衍生化處理后，通過(guò)液相色譜法測(cè)定血液中丁酸和己酸含量，雖然該方法可靠性高，但復(fù)雜的前處理操作，導(dǎo)致方法的重現(xiàn)性和簡(jiǎn)便性較差。CE和IC由于儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，成本較高，不具有普遍適用性[11-13]。GC具有靈敏度高，分析時(shí)間短，無(wú)需衍生化處理等優(yōu)點(diǎn)，是測(cè)定生物樣品中SCFAs最常用的方法[14]。樣品一般通過(guò)有機(jī)溶劑萃取后經(jīng)濾膜過(guò)濾，再進(jìn)行GC分析，然而由于生物樣品的復(fù)雜性，雜質(zhì)的存在會(huì)污染進(jìn)樣口和毛細(xì)管柱，降低分析的準(zhǔn)確性，增加維護(hù)成本[15]。頂空進(jìn)樣器(Headspace sampler，HS)是一種廣泛應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)樣品中短鏈物質(zhì)的分析方法[16-17]，在測(cè)定生物樣品中的短鏈成分時(shí)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，避免了非揮發(fā)性組分對(duì)分析造成的干擾，減少了對(duì)色譜柱及進(jìn)樣口的污染[18]，在很大程度上彌補(bǔ)了以上方法的缺陷。本文建立了HS-GC分析丁酸梭菌發(fā)酵液中SCFAs的方法并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，以期為生物樣品中SCFAs的測(cè)定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

丁酸梭菌；乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、己酸和2-乙基丁酸均為色譜純，購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

島津GC-2010 Plus氣相色譜儀，配備氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)；HS-10頂空自動(dòng)進(jìn)樣器；Rtx-Wax彈性石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精確稱取乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸和己酸標(biāo)準(zhǔn)品，純水定容，配制成200 mmol/L的乙酸、異丁酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，100 mmol/L的丙酸、戊酸和己酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，備用。

分別移取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其中，乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸和己酸的終濃度均為20 mmol/L。將標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液用純水梯度稀釋成不同濃度，在各濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液中加入內(nèi)標(biāo)物2-乙基丁酸，使內(nèi)標(biāo)物濃度均為1 mmol/L。

1.2.2 丁酸梭菌發(fā)酵液的制備

將活化后的丁酸梭菌，按3%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃下厭氧培養(yǎng)。每隔2 h取樣，樣液在5 000 r/min、室溫下離心10 min，將上清液與甲酸以100∶1的體積比混合均勻后取1 mL移入頂空進(jìn)樣瓶中，同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)2-乙基丁酸，加蓋密封，待測(cè)。

1.2.3 HS-GC分析條件

頂空進(jìn)樣器條件：恒溫爐溫度70℃，樣品流路溫度90℃，傳輸線溫度110℃；樣品瓶加壓氣壓160.0 kPa，樣品瓶恒溫時(shí)間10 min，樣品瓶加壓時(shí)間1 min，GC循環(huán)時(shí)間22 min。

GC條件：氫氣和空氣流速分別為60 mL/min和400 mL/min，高純度氦氣流速1.67 mL/min；程序升溫為初溫80℃，以10℃/min升溫至200℃，保持1 min，以20℃/min程序升溫至220℃，保持1 min；進(jìn)樣口溫度220℃；FID檢測(cè)器溫度300℃，分流比1∶10。

1.2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程與檢測(cè)范圍確定

取1.2.1中梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進(jìn)行GC測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，不同濃度下標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行擬合得線性回歸方程。

1.2.4.2 日內(nèi)精密度及日間精密度考察

日內(nèi)精密度為在同一天內(nèi)，取同一批分析樣品每隔2 h測(cè)定1次，每天連續(xù)測(cè)定6次。日間精密度為同一樣品連續(xù)3 d進(jìn)行GC測(cè)定分析。通過(guò)計(jì)算各SCFAs色譜峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD判斷方法的精密度是否符合要求。

1.2.4.3 穩(wěn)定性考察

將已知濃度的SCFAs混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液在4℃下存放，連續(xù)3 d取樣，在室溫下進(jìn)行GC分析，考察溶液在3 d內(nèi)的穩(wěn)定性。

1.2.4.4 樣品加標(biāo)回收率考察

取20 h發(fā)酵液樣品，測(cè)定其中SCFAs濃度后，分別在發(fā)酵液中加入低、中、高3個(gè)不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其中低濃度的加入量為樣品測(cè)定濃度的80%，中濃度的加入量與樣品測(cè)定濃度相近，高濃度的加入量為樣品測(cè)定濃度的120%，按下式計(jì)算加標(biāo)回收率。

加標(biāo)回收率=(加標(biāo)試樣測(cè)定值-初始量)/加標(biāo)量×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖(見(jiàn)圖1)

注：1.乙酸；2.丙酸；3.異丁酸；4.丁酸；5.戊酸；6.2-乙基丁酸；7.己酸。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖

由圖1可見(jiàn)，乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、己酸的保留時(shí)間分別為4.840、5.779、6.112、6.800、8.057、9.270 min，內(nèi)標(biāo)物2-乙基丁酸的保留時(shí)間為8.315 min。各SCFAs峰形良好，基線穩(wěn)定，拖尾較小，各組分的分離度較好，內(nèi)標(biāo)物與其他組分間峰位相近且分離度良好，表明該測(cè)定方法可以將待測(cè)組分很好地分離，適合SCFAs的分離和鑒定。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程與檢測(cè)范圍

按1.2.4.1方法，得到各SCFAs的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，如表1所示。

表1 SCFAs的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、檢測(cè)限、定量限

由表1可見(jiàn)，乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸和己酸在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，表示在該方法的濃度范圍內(nèi)，各SCFAs標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好。由信噪比法計(jì)算得到檢出限(LOD)范圍為0.01～0.17 mmol/L(S/N>3)，定量限(LOQ)范圍為0.02～0.53 mmol/L(S/N>10)。檢出限與定量限較低，說(shuō)明該方法可以作為丁酸梭菌發(fā)酵過(guò)程中SCFAs含量檢測(cè)定量方法使用。

2.2.2 日內(nèi)精密度與日間精密度

按1.2.4.2考察方法的日內(nèi)精密度和日間精密度，結(jié)果分別如表2、表3所示。

表2 日內(nèi)精密度(n=6)

表3 日間精密度(n=3)

由表2、表3可見(jiàn)，峰面積的日內(nèi)精密度良好，RSD范圍為0.12%～0.93%，3 d內(nèi)各標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的日間RSD為1.18%～2.86%，保留時(shí)間的日內(nèi)RSD和日間RSD分別為0.01%～0.03%和0.07%～0.45%。說(shuō)明在試驗(yàn)期內(nèi)，各SCFAs的出峰時(shí)間穩(wěn)定，峰面積變化在誤差允許范圍內(nèi)，有較好的日內(nèi)精密度及日間精密度。

2.2.3 穩(wěn)定性

按照1.2.4.3方法考察樣品的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖2所示。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性

由圖2可見(jiàn)，混合標(biāo)準(zhǔn)品中各SCFAs含量的RSD均在8%以下，表明在該條件下各SCFAs在3 d內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，說(shuō)明在3 d內(nèi)可使用同一樣品進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2.4 加標(biāo)回收率

按1.2.4.4方法考察樣品的加標(biāo)回收率，結(jié)果如表4所示。

由表4可見(jiàn)，乙酸和丁酸的加標(biāo)回收率范圍分別在90.14%～108.71%和88.90%～95.36%之間。表明該方法適用于發(fā)酵液樣品中乙酸和丁酸的定量測(cè)定。

表4 加標(biāo)回收率

2.3 樣品分析

丁酸梭菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中隨時(shí)間變化產(chǎn)SCFAs情況如圖3和圖4所示。

圖3 48 h內(nèi)乙酸含量變化

圖4 48 h內(nèi)丁酸含量變化

由圖3、圖4可見(jiàn)，應(yīng)用HS-GC在丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基中檢測(cè)到乙酸和丁酸兩種SCFAs。接種后的培養(yǎng)基內(nèi)含有少量的乙酸，在0～14 h時(shí)，乙酸和丁酸的含量變化緩慢，14 h開(kāi)始，進(jìn)入到二者含量變化的對(duì)數(shù)期，乙酸和丁酸的含量增加迅速，尤其是丁酸，在15 h左右含量超過(guò)了乙酸，成為發(fā)酵液中含量最高的短鏈脂肪酸，在22 h時(shí)進(jìn)入乙酸和丁酸含量的穩(wěn)定期，二者含量分別為10.5 mmol/L和12.5 mmol/L左右，持續(xù)到32 h，有小幅度的增長(zhǎng)，最終丁酸和乙酸的含量分別穩(wěn)定在14.1 mmol/L和11.9 mmol/L左右。

2.4 討論

微生物發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的短鏈物質(zhì)種類較多，且含量變化各不相同，增加了分析測(cè)定的難度。在SCFAs檢測(cè)過(guò)程中，易揮發(fā)的性質(zhì)導(dǎo)致樣品定量不準(zhǔn)確、重復(fù)性差，同時(shí)雜質(zhì)的存在也會(huì)影響樣品峰形及基線穩(wěn)定。在相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中，張小菊等[19]采用同時(shí)蒸餾萃取法提取了花生粕混合菌發(fā)酵物的短鏈物質(zhì)，并使用帶有普通進(jìn)樣器的氣相色譜儀進(jìn)行短鏈物質(zhì)的測(cè)定。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)同時(shí)蒸餾萃取的短鏈物質(zhì)較少，在樣品中只檢測(cè)到少量乙醇，可能的原因是前處理?yè)p耗了較多的短鏈成分，另外蒸餾萃取過(guò)程中帶有的雜質(zhì)導(dǎo)致峰形較差并且出峰不明顯。吳慧玉[20]使用乙酸乙酯萃取大腸桿菌發(fā)酵液中的SCFAs，建立了氣相色譜分析方法，各SCFAs之間分離度較好，但由于前處理采用有機(jī)溶劑萃取法，在前處理過(guò)程中無(wú)法避免SCFAs的損失，線性相關(guān)系數(shù)未能大于0.999，同時(shí)由于采用乙酸乙酯作為萃取劑，氣相色譜分析過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)較強(qiáng)的溶劑峰，在干擾色譜分析準(zhǔn)確性的同時(shí)，也產(chǎn)生一定的基質(zhì)效應(yīng)。本研究中使用的頂空-氣相色譜分析簡(jiǎn)化了前處理過(guò)程，減少了樣品中SCFAs在前處理過(guò)程中的損失，最大程度地保留了原始組分，檢測(cè)結(jié)果更加接近樣品中的真實(shí)成分，相比于普通進(jìn)樣分析準(zhǔn)確度有所提升，頂空進(jìn)樣器在避免溶劑峰對(duì)分析干擾的同時(shí)，也有效減少了有機(jī)溶劑對(duì)氣相色譜系統(tǒng)的污染，降低了維護(hù)成本。檢測(cè)結(jié)果也顯示各標(biāo)品曲線的線性關(guān)系良好，相應(yīng)濃度范圍相關(guān)系數(shù)均大于0.999。方法學(xué)驗(yàn)證顯示本研究建立的方法重復(fù)性好、穩(wěn)定度高。此外，李夢(mèng)嬌等[21]在對(duì)植物油中SCFAs含量分析時(shí)所用時(shí)間為26 min，Umar[22]對(duì)益生菌發(fā)酵產(chǎn)物中SCFAs含量分析所用時(shí)間為20.5 min，而使用頂空進(jìn)樣器進(jìn)行SCFAs含量的測(cè)定，分析時(shí)間為16 min，明顯縮短了分析測(cè)定總時(shí)間，且無(wú)需樣品前處理，在大批量、快速檢測(cè)應(yīng)用方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，適用于發(fā)酵液中SCFAs快速測(cè)定。

3 結(jié) 論

采用頂空-氣相色譜法分析丁酸梭菌發(fā)酵液中SCFAs的含量變化，該方法前處理簡(jiǎn)單，避免了有機(jī)溶劑萃取過(guò)程對(duì)環(huán)境的污染和對(duì)操作人員的危害，色譜峰分離效果好，重復(fù)性好，具有快速、準(zhǔn)確和穩(wěn)定性高的特點(diǎn)。所建立的方法適用于丁酸梭菌發(fā)酵過(guò)程中SCFAs含量的快速測(cè)定。