樊武哲，武懿茂，趙文京，陳 強(qiáng)，俞飛越，李雪垠

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

谷子（Setaria italica） 起源于我國北方黃河流域，至今已有7 000 余年的栽培歷史，是我國北方重要的雜糧作物[1-3]。近年來，隨著對植物的深入研究，越來越多與逆境相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)。轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF），也稱反式作用因子，能有序地結(jié)合在目標(biāo)基因啟動子序列中的特殊位點，啟動基因的轉(zhuǎn)錄和控制基因的轉(zhuǎn)錄效率，在植物的逆境適應(yīng)過程中，發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[4-5]。

核轉(zhuǎn)錄因子Y 是一個與CCAAT- box 順式作用元件結(jié)合進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，普遍存在于酵母、動植物等真核生物中,也被稱為CCAAT 盒結(jié)合因子（CCAAT- binding factor，CBF）或亞鐵血紅素激活蛋白（heme activator protein，HAP）[6-8]。它是由3 個（NF- YA、NF- YB 和NF- YC）不同的亞家族組裝成的異源三聚體，結(jié)合到啟動子CCAAT 盒上，調(diào)控眾多基因的表達(dá)，在植物胚胎發(fā)育、個體生長及逆境脅迫響應(yīng)等方面發(fā)揮重要的作用[9-11]。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥和小麥中，NF- YA 家族均包含10 個成員，NF- YB 家族分別包含13，11 個成員，NF- YC家族分別包含13，14 個成員[12-13]，它們在調(diào)控胚發(fā)育、胚成熟、花發(fā)育過程以及非生物脅迫應(yīng)答中起著重要的作用[14-16]。

NF- YB 家族包含一個與核心組蛋白H2B 中的組蛋白折疊基序保守域極其相似的中心結(jié)構(gòu)域，在蛋白質(zhì)—DNA，蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)的相互作用中發(fā)揮著重要的作用[17]。已有研究表明，NF- YB 基因家族能調(diào)控非生物脅迫，如干旱、高鹽、冷害、熱害等方面。鑒于NF- YB 基因家族在植物抗逆方面的重要作用，且并未發(fā)現(xiàn)谷子NF- YB 基因家族的詳細(xì)報道。

本研究利用生物信息學(xué)手段鑒定和分析谷子NF- YB 基因家族，預(yù)測并統(tǒng)計谷子NF- YB 基因家族各蛋白的理化性質(zhì)、保守基序、保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化等，旨在為進(jìn)一步探索NF- YB 基因家族的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

利用植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB 在線搜索并下載谷子NF- YB 基因家族的氨基酸序列；選用Phytozome 數(shù)據(jù)庫下載谷子NF- YB 基因家族成員的基因組序列和CDS 序列。

1.2 谷子NF-YB 基因家族的定位

利用Perl 編程語言，將谷子NF- YB 基因家族成員在染色體上的位置進(jìn)行整理，通過MapInspect程序顯示每個基因在染色體上的位置，得到各個基因在染色體上的分布情況，并繪制谷子NF- YB 基因家族成員在染色體上的物理分布圖，對谷子NF- YB 家族基因進(jìn)行可視化分析。

1.3 谷子NF-YB 基因家族基本信息和理化性質(zhì)分析

利用谷子基因組Phytozome 數(shù)據(jù)庫查找NF- YB 基因家族基本信息，并利用EXPASY- Prot-Param 在線工具（https：//web.expasy.org/protparam/）分析谷子NF- YB 基因家族等電點和相對分子質(zhì)量。

1.4 谷子NF-YB 基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建和基因結(jié)構(gòu)分析

為了明確谷子基因組中鑒定出的NF- YB 基因家族成員的進(jìn)化關(guān)系，利用Clustal X2.1 和MEGA 4.0 軟件進(jìn)行氨基酸序列聚類和進(jìn)化分析，采用鄰接法（Neighbor- Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行1 000 次Bootstrap 抽樣自檢，其他參數(shù)選擇默認(rèn)。并利用在線軟件Gene Structure Display Server（GSDS，http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析谷子NF- YB 基因家族基因的外顯子- 內(nèi)含子（exon- intron）結(jié)構(gòu)。

1.5 谷子NF-YB 基因家族保守基序及保守結(jié)構(gòu)域分析

利用MEME 軟件（http：//meme- suite.org/tools/meme） 對谷子NF- YB 基因家族進(jìn)行保守基序分析，并利用TBtools 工具繪制谷子NF-YB 基因的Motif示意圖，分析谷子NF-YB 氨基酸序列的保守性。

將谷子抗旱相關(guān)蛋白激酶基因的氨基酸序列提交至NCBI- CDD 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi），并利用TBtools工具繪制谷子NF-YB 基因保守結(jié)構(gòu)域。

1.6 谷子NF-YB 基因家族啟動子分析

利用PlantCARE 軟件在線分析谷子NF- YB 基因家族啟動子區(qū)順式作用元件，選取鑒定出的谷子NF-YB 基因起始密碼子上游1 500 bp 序列作為啟動子區(qū)域，將序列提交到PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.gent.e/eboolslantcare/html）數(shù)據(jù)庫，分析啟動子順式作用元件。

1.7 谷子NF-YB 基因家族表達(dá)分析

從Phytozome 數(shù)據(jù)庫下載谷子NF- YB 基因家族的表達(dá)數(shù)據(jù)，分析其組織表達(dá)特異性，并利用R語言函數(shù)繪制基因表達(dá)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子NF-YB 基因家族成員的鑒定及染色體定位

谷子共有9 條染色體，根據(jù)谷子NF- YB 基因家族成員所在染色體的信息，對獲得的16 個谷子NF- YB 基因家族成員命名，分別命名為SiNFYB1～SiNF-YB16。基因的染色體分布情況如圖1所示。由圖1 可知，谷子NF- YB 基因家族成員分布在7 條不同染色體上，4 號染色體上最多，9 號染色體上最少，7，8 號染色體上沒有分布。

2.2 谷子NF-YB 基因家族成員的基本信息和理化性質(zhì)分析

16 個谷子NF- YB 基因家族成員的基本信息及理化性質(zhì)列于表1。從表1 可以看出，谷子NF- YB 基因家族成員序列長度在516～3 967 bp，其中，SiNF-YB15 的CDS 序列最長，SiNF-YB7 的CDS 序列最短；蛋白最長有300 個氨基酸，最短的有115 個氨基酸；SiNF-YB11、SiNF-YB15 的外顯子數(shù)目較多，而SiNF-YB4、SiNF-YB12、SiNF-YB13、SiNF-YB14、SiNF-YB16 的外顯子數(shù)目較少；蛋白質(zhì)等電點介于5.00（SiNF-YB3）～8.38（SiNF-YB10），其中有3 個基因編碼的蛋白質(zhì)呈堿性，13 個基因編碼的蛋白質(zhì)顯酸性；蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量在12 589.38～33 890.02 u。

表1 谷子NF-YB 家族基因的基本信息

2.3 谷子NF-YB 基因家族成員系統(tǒng)進(jìn)化及基因結(jié)構(gòu)分析

基于谷子NF- YB 基因家族成員的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹和基因結(jié)構(gòu)如圖2 所示，谷子16個NF- YB 基因家族成員可以劃分為3 個亞族，同一亞族內(nèi)成員親緣關(guān)系較近。不同的亞族之間進(jìn)化關(guān)系差距較大，推測谷子NF- YB 基因家族在演化過程中發(fā)生了變化，在谷子的生長發(fā)育及抗逆過程中起著不同的調(diào)控作用。

谷子NF- YB 基因家族成員的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果如圖3 所示，多數(shù)基因包含有外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)斷裂基因特征，其中，以SiNF-YB11 和SiNFYB15 基因最為明顯，含有5 個外顯子；而SiNFYB4、SiNF-YB12、SiNF-YB13、SiNF-YB14 和SiNFYB16 基因結(jié)構(gòu)比較簡單，外顯子數(shù)目最少，只含有1 個外顯子。

2.4 谷子NF-YB 基因家族成員保守基序及保守結(jié)構(gòu)域分析

對谷子NF- YB 基因家族成員的氨基酸序列進(jìn)行保守基序分析，結(jié)果如圖4 所示。谷子NF- YB 基因家族共包含5 種保守基序，將其分別命名為Motif 1～5，結(jié)果顯示，谷子NF- YB 基因家族都含有Motif1這種保守基序，說明Motif 1 是核心基序。而對于Motif 4、Motif 5 這2 種保守基序來說，分別僅分布于3，2 個家族基因中，說明這2 種基序在進(jìn)化中分化程度很低。

從圖5 可以看出，谷子NF- YB 基因家族成員共包含2 個保守結(jié)構(gòu)域（CBFD_NFYB_HMF 和H4 superfamily）。每個谷子NF- YB 基因家族成員都含有1 個結(jié)構(gòu)域。SiNF-YB4、SiNF-YB5 和SiNF-YB8、SiNF-YB9 含有相同的保守域，即都含有1 個CBFD_NFYB_HMF 保守結(jié)構(gòu)域，且其位置相似，所以，推測它們可能具有相似的生物學(xué)功能。

2.5 谷子NF-YB 基因家族成員啟動子序列分析

基于PlantCARE 軟件工具在線分析谷子NFYB 基因啟動子順式作用元件，結(jié)果表明，谷子16個NF-YB 基因啟動子中與抗逆相關(guān)的順式作用調(diào)控元件主要有：ABA 響應(yīng)元件（ABRE）、低溫誘導(dǎo)響應(yīng)元件（LTR）、MeJA 響應(yīng)元件（CGTCA- motif、TGACG- motif） 以及生物與非生物脅迫響應(yīng)元件（TC- rich repeats）等（表2）。多數(shù)谷子NF-YB 基因啟動子區(qū)域都含有干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件，這表明NFYB 基因參與谷子干旱脅迫響應(yīng)的調(diào)控。此外，研究發(fā)現(xiàn)不同基因的調(diào)控元件種類、數(shù)目也不同，另外一些NF-YB 基因還具有水楊酸、生長素、赤霉素、低溫等非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件，這也進(jìn)一步表明了NF- YB 基因家族成員在抵抗逆境過程中的重要作用。

表2 谷子NF-YB 基因家族成員啟動子順式作用元件功能

2.6 谷子NF-YB 基因家族成員表達(dá)分析

基于Phytozome 數(shù)據(jù)庫檢索并鑒定出的16 個谷子NF- YB 基因家族成員，通過Phytozome 數(shù)據(jù)庫，統(tǒng)計整理出NF- YB 基因家族成員在各個組織中的表達(dá)量，并利用R 語言內(nèi)部的Heatmap 函數(shù)繪制熱圖，組織表達(dá)情況如圖6 所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SiNF-YB11 基因在根中的表達(dá)量最高，在穗中的表達(dá)量較高；SiNF-YB15 在根中也有較高的表達(dá)量。此外，SiNF-YB1、SiNF-YB2、SiNF-YB7、SiNF-YB8、SiNF-YB9、SiNF-YB10 基因不參與谷子根、莖、葉和穗等組織表達(dá)。NF- YB 基因家族不同成員在谷子不同組織中的表達(dá)量存在顯著差異。

3 結(jié)論與討論

植物NF- YB 基因家族是植物抗逆境脅迫的關(guān)鍵基因，通過生物信息學(xué)手段對谷子NF- YB 基因家族進(jìn)行分析，可為深入研究谷子NF- YB 基因家族抗逆境脅迫奠定基礎(chǔ)。

本研究鑒定了16 個谷子NF-YB 基因，它們分布于除7，8 號染色體外的其余7 條染色體上。聚類分析顯示，它們可以分為3 個亞家族，這與將水稻、擬南芥和大豆中的NF- YB 基因家族分成I、II、III等3 類類似?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示，多數(shù)基因包含有外顯子，卻沒有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，這是由于NF- YB 基因家族在進(jìn)化過程中承受較強(qiáng)的選擇壓力，許多基因的內(nèi)含子丟失[18]。保守基序分析顯示，谷子NF- YB基因家族成員共有5 個保守基序，其中，Motif 1 是核心基序，分布于每一個谷子NF- YB 基因家族內(nèi)。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，谷子NF- YB 基因家族共包含2 個保守結(jié)構(gòu)域。NF- YB 基因家族成員的保守域大多數(shù)位于NF-YB 基因的內(nèi)部，這種位置保守性是依賴于核轉(zhuǎn)錄因子異源三聚體蛋白空間構(gòu)象決定的。NF- YB 蛋白與NF- YC 蛋白通過彼此的保守域，采用頭尾相接的方式形成異源二聚體互作平臺，吸引NF- YA 蛋白與其結(jié)合形成具有活性的異源三聚體核轉(zhuǎn)錄因子。核轉(zhuǎn)錄因子通過NF- YA 亞基上的DNA 結(jié)合域結(jié)合到靶基因啟動子部分CCAAT 盒，激活或抑制轉(zhuǎn)錄[19-20]。基因表達(dá)分析顯示，SiNF-YB 基因在谷子根、莖、葉和穗中表達(dá)量有較大差異，說明不同的NF- YB 基因家族成員在植物的生長發(fā)育過程中有各自獨特的作用。上述結(jié)果表明，多數(shù)親緣關(guān)系較近的基因的外顯子- 內(nèi)含子結(jié)構(gòu)、保守基序、保守結(jié)構(gòu)域較為相似，它們可能具有功能上的相似性，如SiNF-YB8、SiNF-YB9 親緣關(guān)系較近，在基因結(jié)構(gòu)、保守基序、保守結(jié)構(gòu)域都表現(xiàn)出較強(qiáng)的相似性，所以，推測它們可能具有相似的生物學(xué)功能。

綜上，對谷子NF- YB 基因家族成員的研究將加深對谷子NF- YB 基因家族調(diào)控轉(zhuǎn)錄機(jī)制的理解，深入探索NF- YB 基因家族在非生物逆境時發(fā)揮的重要作用，可為后續(xù)進(jìn)一步探索NF- YB 基因家族的功能提供理論基礎(chǔ)。