楊洋 孟繁星 王日昕

（寧波大學海洋學院，寧波 315832）

在現(xiàn)階段大規(guī)模集約化養(yǎng)殖過程中，粗放投喂方式導致的餌料殘渣、飼料配比不均衡、飼喂密度大等因素使得養(yǎng)殖水體中氨氮含量超標［1］。氨氮在水體中的存在形式分為兩種：離子態(tài)（NH4+）和非離子態(tài)（NH3），由于非離子氨是半徑較小的親脂性分子，極易擴散進入魚體，導致血氨濃度升高、紅細胞載氧能力下降，離子平衡紊亂，中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到干擾等不良影響，因此相較于NH4+，NH3對魚體的毒害作用更大，常使魚體表現(xiàn)出呼吸困難、反應遲緩、抽搐甚至衰竭而死亡［2］。已有大量研究表明氨氮對魚類的毒性，如氨氮刺激下，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）鰓組織結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴重的組織病理學病變，氧攝取功能嚴重受損［3］；質(zhì)子化的NH4+通過取代K+，干擾Na+/K+-ATPase（NKA）和Na+：K+：2Cl-共轉(zhuǎn)運蛋白（NKCC）的正常運作而阻礙離子調(diào)節(jié)［4］；通過抑制丙酮酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶而干擾三羧酸循環(huán)，進而影響魚體能量代謝［5-6］等。因此，對于氨氮脅迫對魚體的損害機制和魚體對氨氮環(huán)境的耐受機制的研究顯得尤為重要。

目前，已有研究對常見淡水魚［7］和現(xiàn)存氣呼吸型海水魚的氨氮耐受機制進行了研究，其機制主要包括：（1）降低蛋白質(zhì)和氨基酸的分解代謝；（2）降低環(huán)境pH；（3）NH4+連續(xù)排泄 ；（4）NH3持續(xù)排泄；（5）合成無毒的谷氨酰胺；（6）合成尿素等［8-9］。其中降低蛋白質(zhì)和氨基酸分解代謝的策略對于大彈涂魚并不適用，這是由于彈涂魚在陸生環(huán)境中需要利用蛋白質(zhì)和氨基酸分解釋放的能量來維持其跳躍和爬行等生命活動［10-11］；同樣，大彈涂魚也不采用合成尿素的方式排泄氨，相關(guān)研究指出，尿素生成能力存在于軟骨魚類和大多數(shù)陸生脊椎動物中［12］，在硬骨魚中幾乎檢測不到鳥氨酸尿素循環(huán)（Ornithine-urea cycle，OUC）中關(guān)鍵酶的活性［13-14］，已有研究證實，許氏齒彈涂魚（Periophthalmodon schlosseri）是唯一一種具有完整OUC的彈涂魚，但也只有4.6%的外源性氨被合成尿素［15］。近年來，一種疑似具有排氨作用的功能性蛋白逐漸被關(guān)注，2017年，Chen等［16］的一篇報道指出氨氮脅迫會影響攀鱸（Anabas testudineus）鰓中Rh蛋白（Rhesus-type ammonia transporter）mRNA和蛋白水平高表達，隨著研究深入，愈來愈多學者傾向于認為Rh蛋白在排氨過程中起關(guān)鍵性作用，且與碳酸酐酶（Carbonic anhydrase，CA）、鈉氫交換蛋白（Na+/H+exchangers，NHE）等存在聯(lián)合作用［17-18］。

作為古老的氣呼吸型魚類，大彈涂魚（Boleophthalmus pectinirostris）能夠沿著潮汐帶在軟泥中建造洞穴，對于繁殖季節(jié)洞穴水中高氨的水環(huán)境具有極強的耐受性［19-20］，是研究魚類氨氮環(huán)境耐受性的重要生物學材料，對于研究魚類如何提高逆境環(huán)境生存能力也具有重要價值?；谝延袌蟮溃狙芯總?cè)重于探究大彈涂魚在氨氮脅迫下是否采用合成無毒谷氨酰胺這一策略以及是否利用Rh蛋白及其協(xié)同蛋白共同完成持續(xù)排氨，測定了急性氨氮脅迫條件下大彈涂魚血氨濃度的變化，檢測了氨代謝關(guān)鍵酶——谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）在肝臟中的活性及GS基因mRNA表達量情況；同時檢測鰓組織中CA，NHE3蛋白量及氨代謝相關(guān)基因CA15、NHE和Rhcg1的mRNA表達量情況，旨為魚類氨解毒代謝機制的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大彈涂魚購自浙江省寧波慈溪市龍山鎮(zhèn)，實驗開始前在寧波大學校內(nèi)實驗基地暫養(yǎng)7 d，暫養(yǎng)期間每天投喂飼料，并及時清理糞便和殘餌，配置鹽度為10的海水作為暫養(yǎng)用水，水溫22.2±0.3℃，pH 為 7.61±0.08，溶氧量為 6.38±0.8 mg/L，24 h連續(xù)充氣增氧。7 d后，挑選體質(zhì)健康、大小均勻19.2±0.3 g的大彈涂魚隨機分配到6個塑料養(yǎng)殖桶（93 cm×60 cm×25 cm）內(nèi)，每桶40尾。

1.2 方法

1.2.1 急性氨氮脅迫 參考大彈涂魚的氨氮脅迫亞致死濃度［21］和預實驗結(jié)果，通過直接向固定體積的海水中添加NH4Cl（分析純，RG≥99.5%，M=53.49）配置出8 mmol/L的NH4Cl鹽溶液為氨氮組實驗用水，以不添加NH4Cl的海水作為對照組，每組設3個重復桶，每桶40尾魚，實驗用水體積固定為8 L使魚浸沒在水中，每24 h徹底更換用水，實驗期間不投喂。

1.2.2 樣品采集 在氨氮脅迫后0 h、12 h、24 h、48 h和72 h分別采樣，每個時間點從每桶取3尾魚。用MS222麻醉后將魚置于冰面，用無菌注射器從尾靜脈取血并加入1.5 mL的EP管中，于4℃冰箱中靜置12 h后離心（5000 r/min，4℃，10 min），取上層血清移至新的離心管， 保存于-20℃冰箱備用。抽血后，在冰面上快速解剖取肝、鰓、腎等組織放在1.5mL的EP管并迅速投入液氮中暫存，后儲存于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 血氨濃度測定 血氨測定試劑盒購自南京建成生物公司，以血清為實驗樣本測定氨氮組和對照組的血氨含量，具體操作流程參照說明書，采用美谷分子儀器（上海）有限公司的Molecular Devices SpectraMax-i3x酶標儀測定630 nm吸光值后，利用如下公式計算血氨含量：血氨含量（μmol/L）=（（測定OD-空白OD）/（標準OD-空白OD））×標準濃度（350 μmol/L）×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

1.2.4 GS 酶活測定 取肝組織樣，按組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1∶9的比例加入提取液，冰浴勻漿。離心（8000×g，4℃，10 min）取上清，置于冰上用于GS酶活的測定。GS活性采用索萊寶生物科技有限公司的GS活性檢測試劑盒測定，Molecular Devices SpectraMax-i3x酶標儀測定540 nm吸光值，計算求得酶活力值。

1.2.5 CA，NHE3酶聯(lián)免疫（ELISA）分析測定 取鰓組織樣，磷酸緩沖液（Phosphatic buffer solution，PBS）沖洗后，按組織質(zhì)量（g）：PBS（mL）為1∶9的比例加上預冷的PBS（50 mmol/L，pH7.4），冰浴勻漿。離心（5000×g，4℃，20 min）收集上清，分裝一份待測，其余冷凍備用。CA，NHE3活性采用上海研謹生物公司的酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測試劑盒測定。Molecular Devices SpectraMax-i3x酶標儀測定450 nm吸光值，繪制標準曲線，計算含量。

1.2.6GS、CA15、NHE和Rhcg1基因mRNA表達參照NCBI，GenBank中大彈涂魚GS（XM_020921461），CA15（XM_020925341），NHE（XM_020941797），Rhcg1（KU229861.1） 基 因 cDNA序 列，Primer Premier 6.0軟件設計特異擴增引物（表1），分別測定肝臟中GS基因及鰓組織中CA15，NHE，Rhcg1基因mRNA表達量。取肝、鰓組織在液氮中研磨成粉末，Trizol試劑提取組織總RNA，沉淀用DEPC溶解，檢測RNA濃度和A260/A280值，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，TransScript All-in-one First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，凝膠電泳圖像呈單一明亮條帶。實時熒光定量PCR采用SYBR Premix ExTaq試劑于羅氏LightCycler 480上進行分析，PCR體系為：95℃ 3 min；95℃ 10 s，57-61℃（不同引物退火溫度不同）30 s，40個循環(huán)；95℃ 5 s。以β-actin作為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

表1 實驗所用熒光定量PCR引物序列

1.2.7 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)分析工作運用統(tǒng)計學軟件SPSS 18.0 做單因素方差分析（one-way ANOVA），對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，并根據(jù)方差齊性檢驗結(jié)果分別進行LSD或Duncan 多重比較，分析組內(nèi)差異顯著性，用ORIGIN軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 氨氮脅迫對血氨濃度的影響

對照組中大彈涂魚血清中血氨含量穩(wěn)定在300 μmol/L左右，組內(nèi)不同時間點的血氨含量無顯著性差異（P＞0.05）；對于氨氮組，血氨含量隨氨氮脅迫時間的推移，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在12 h顯著升高并達到最大值（P＜0.05），隨后在24 h顯著下降并回落到基線附近后，血氨水平再無顯著性變化（P＞0.05）。對照組與氨氮組的血氨含量在各個時間點均有顯著性差異（P＜0.05），都表現(xiàn)為氨氮組的血氨含量顯著高于對照組的血氨含量，尤其在12 h氨氮組的血氨含量為對照組的4倍，差異極顯著（P＜0.01）（圖1）。

圖1 氨氮脅迫下大彈涂魚血氨含量的變化

2.2 氨氮脅迫對肝組織中GS酶活性的影響

在對照組中，肝臟GS活性在各時間點之間無顯著性差異（P＞0.05）；在氨氮組中，肝臟GS活性在12 h開始出現(xiàn)上調(diào)趨勢，并在24 h顯著上升達到最大值（P＜0.05），隨后GS活性在48 h顯著降低到基準值附近，直至72 h時GS活性再無顯著性變化（圖 2）。

2.3 氨氮脅迫對鰓中CA，NHE3蛋白含量的影響（ELISA）

2.3.1 對鰓中CA蛋白含量的影響 在對照組中，鰓中CA蛋白含量隨時間變化而波動，但無顯著性差異（P＞0.05）；在氨氮組中，鰓中CA蛋白含量隨時間推移呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，12 h和24 h時較0 h的CA蛋白含量顯著升高（P＜0.05），但二者之間并無明顯差異（P＞0.05），隨后在48 h時CA蛋白含量進一步顯著上升并達到最大值（P＜0.05），而后CA蛋白含量顯著下降（圖3）

圖2 氨氮脅迫下大彈涂魚肝組織中谷氨酰胺合成酶活性變化

圖3 氨氮脅迫下大彈涂魚鰓組織中碳酸酐酶蛋白含量變化

2.3.2 對鰓中NHE3蛋白含量的影響 在對照組中，鰓中NHE3蛋白含量隨時間變化而波動，但無顯著性差異（P＞0.05）；在氨氮組中，鰓中NHE3蛋白含量在12 h時有下降趨勢，但不顯著（P＞0.05），隨著氨氮脅迫時間的推移NHE3蛋白含量在24 h顯著上升并達到最大值（P＜0.05），隨后顯著降低并在72 h恢復到初始蛋白含量附近（圖4）。

2.4 氨氮脅迫對基因表達的影響

2.4.1 對肝中GS基因表達的影響 在對照組中，肝臟GS基因的表達量在12 h顯著上升（P＜0.05）而后趨于平緩的趨勢，除0 h外，其他時間點GS基因表達量均無顯著性差異（P＞0.05），且均高于0 h 表達量3倍左右（P＜0.05）；在氨氮組中，肝臟GS基因的表達量呈先上升后下降的趨勢，在12 h顯著上升并在48 h進一步上升達到最大值（P＜0.05），隨后呈現(xiàn)下降趨勢（圖5）。

圖4 氨氮脅迫下大彈涂魚鰓組織中鈉氫交換體蛋白含量變化

圖5 氨氮脅迫下大彈涂魚肝中GS基因的相對表達水平變化

2.4.2 對鰓中CA15基因mRNA的相對表達變化 在對照組中，鰓中CA15基因的相對表達量呈現(xiàn)緩慢上升而后下降的波動趨勢，但總體并無顯著性差異（P＞0.05）；在氨氮組中，鰓中CA15基因的相對表達量在24 h內(nèi)有所波動，但無顯著性差異（P＞0.05），在48 h時表達量顯著上升并達到最大值（P＜0.05），高出0 h基因表達量2.5倍，隨后呈現(xiàn)下降趨勢（圖6）。

圖6 氨氮脅迫下大彈涂魚鰓中CA15基因的相對表達水平變化

2.4.3 對鰓中NHE基因表達的影響 在對照組中，鰓中NHE基因的表達量對隨時間變化而波動但無顯著性差異（P＞0.05）；在氨氮組中，鰓中NHE基因的相對表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在24 h顯著升高并達到最大值（P＜0.05），隨后，鰓中NHE基因的相對表達量在48 h有下降趨勢，但相對表達量與24 h無顯著性差異（P＞0.05），最終在72 h顯著降低到初始表達量（P＞0.05）（圖7）。

2.4.4 對鰓中Rhcg1基因表達的影響 在對照組中，鰓中Rhcg1基因的相對表達量隨時間變化而波動但無顯著性差異（P＞0.05），在氨氮組中，鰓中Rhcg1基因的相對表達量呈先上升后下降的趨勢，在48 h顯著上升并達到最大值（P＜0.05），隨后呈下降趨勢（圖 8）。

圖7 氨氮脅迫下大彈涂魚鰓中NHE基因的相對表達水平變化

圖8 氨氮脅迫下大彈涂魚鰓中Rhcg1基因的相對表達水平變化

3 討論

3.1 氨氮脅迫對GS酶活性及其編碼基因表達量變化的影響

本研究表明，與對照組相比，急性氨氮脅迫下的大彈涂魚血清中血氨濃度均有顯著性升高，其中在12 h極顯著升高，為對照組血清中血氨濃度的4倍。本脅迫實驗主要通過添加NH4Cl至8 mmol/L的亞致死濃度［21］而使水體中的氨氮含量提高，高濃度的氨氮會對魚體滲透壓平衡、代謝活動造成影響，導致魚體總氨氮排放量降低，多余氨氮的積累首先影響血氨含量［22］。因此本研究主要探究在亞致死濃度的NH4Cl脅迫下大彈涂魚的氨氮耐受機制。檢測發(fā)現(xiàn)，血氨濃度在氨氮脅迫12 h內(nèi)急速升高，隨后在24 h顯著下降并回落到基準值，直至72 h血氨濃度均無顯著性差異，表明大彈涂魚具有一定的氨氮耐受能力，可以通過某種體內(nèi)調(diào)節(jié)機制降低因受氨氮脅迫而升高的血氨濃度。

較早研究認為氨氮脅迫下GS活性提高導致的谷氨酰胺積累是造成魚類死亡的關(guān)鍵因素之一，氨氮脅迫下魚類腦組織中的谷氨酰胺積累造成星狀膠質(zhì)細胞腫脹，使得顱內(nèi)壓升高，最終導致魚死亡［23］；但Vander等［24］對魚類額骨構(gòu)造的分析表明，魚類不同于哺乳動物，魚類額骨有較多間隙，能夠耐受較強顱內(nèi)壓。因此，谷氨酰胺的積累并不是造成魚類在氨氮脅迫下死亡的原因，這使得有關(guān)氨氮脅迫為何會引起谷氨酰胺的積累以及谷氨酰胺的積累在魚體中發(fā)揮了怎樣的作用等問題又重新被重視起來。本研究結(jié)果表明，對照組GS基因表達量在12 h上調(diào)后再無顯著性變化，而與其相對應的對照組GS酶活性卻沒有檢測到顯著性差異，考慮到由基因表達到蛋白合成是一個復雜的修飾與加工的過程，其中蛋白活化會受到磷酸化等多種不定因素的影響［25］，酶的活性也會受到激活因子濃度及活性位點識別等多方面的影響，因此表現(xiàn)出基因表達量與酶活性不一致的現(xiàn)象，這也說明基因的mRNA豐度與其翻譯產(chǎn)物的表達量不具有線性關(guān)系［26］；在氨氮脅迫組中大彈涂魚肝臟GS酶活性呈先上升后下降的趨勢，且在24 h達到最大值，與其對應的GS基因表達量在12 h顯著上升并在48 h進一步上升達到最大值，推測GS基因表達量在12 h顯著上升促進了GS酶的合成，其酶活性顯著提高并于24 h達到最大值，而后GS基因在48 h進一步上調(diào)卻沒有引起GS酶活性的上調(diào)，這一現(xiàn)象也可以用mRNA豐度與其翻譯產(chǎn)物的表達量不具有線性關(guān)系來解釋，

但氨氮脅迫導致的GS活性及其基因表達量的一系列變化似乎與大彈涂魚血氨濃度變化存在一定的關(guān)聯(lián)，可能存在當血氨濃度急速上升，GS酶活性提高將NH3和谷氨酸合成了中性、無毒的谷氨酰胺，從而降低血氨濃度緩解氨對魚體的危害，提高了魚體的氨氮耐受能力。近期研究指出，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）不具備功能性尿素循環(huán)和尿素排泄能力，其在面對氨氮脅迫時主要通過GS將氨和谷氨酸轉(zhuǎn)化成谷氨酰胺，再將谷氨酰胺存儲起來，待恢復正常環(huán)境后作為能量來源調(diào)動使用［27］。與其結(jié)果類似，

大彈涂魚同樣不具備功能性尿素排泄能力，推測大彈涂魚在受到高氨氮脅迫后，同樣采用合成谷氨酰胺的方式降低內(nèi)源性氨的積累。相關(guān)研究還見于中華烏塘鱧（Bostrichthys sinensis）［28］、金頭鯛（Sparus aurata）［29］等，在導致魚體氨中毒的不良環(huán)境脅迫下，

均檢測到GS活性不同程度的上調(diào)。表明大彈涂魚在氨氮脅迫下通過GS將氨合成中性、無毒的谷氨酰胺是其重要的氨代謝途徑之一。

3.2 CA，NHE協(xié)助Rh蛋白進行氨的持續(xù)排泄作用

除了被轉(zhuǎn)化成無毒的谷氨酰胺這一途徑之外，氨廢物還可以通過鰓組織上的氨轉(zhuǎn)運蛋白排出體外。You等［20］對大彈涂魚72 h氨氮脅迫后進行了鰓部轉(zhuǎn)錄組組學分析發(fā)現(xiàn)，脅迫后調(diào)控H+-ATPase酶的mRNA表達量顯著升高，這一結(jié)果顯示了大彈涂魚酸排泄與氨氮排泄之間的正相關(guān)關(guān)系。CA是一種含鋅金屬酶，主要催化CO2+H2O?HCO3-+H+這一可逆反應［30］。本研究中對急性氨氮脅迫后的大彈涂魚鰓組織中CA的蛋白表達量及其編碼基因CA15的相對表達量進行檢測，結(jié)果表明，在48 h時CA蛋白表達量及其編碼基因CA15的相對表達量均達到最大值，推測在CA作用下提供H+形成酸化層，使NH3質(zhì)子化，協(xié)助Rh蛋白間接參與大彈涂魚氨排泄過程。已有研究證實了作為模式動物的斑馬魚（Brachydanio rerio）鰓部H+-ATPase富集細胞（HR細胞）中存在CA特異性表達位點，表明CA參與了斑馬魚HR細胞的酸堿調(diào)節(jié)和Na+攝取這一過程［31］。盡管已有對海水魚鰓部氨排泄功能的研究指出，酸化的邊界層在高度緩沖的海水中的作用是微乎其微的［32］，但對于離水后在灘涂上進行活動的大彈涂魚來說，海水緩沖度降低，通過CA提供H+可能更有利于將Rh蛋白排出的NH3快速轉(zhuǎn)化形成NH4+，降低氨氮以非離子氨的形式存在而對魚體造成強毒性。

相關(guān)研究表明，H+分泌和Na+攝取機制與Rh蛋白排氨作用的實現(xiàn)具有功能性相關(guān)［33］。NHE是水環(huán)境和魚體之間進行Na+/H+交換的載體，已經(jīng)在多種魚鰓組織中檢測到其交換活性，幾乎所有魚體外的鈉離子凈流入和體內(nèi)酸根離子的凈流出（H+/NH4+）都是通過鰓組織中的NHE完成的［34］。本研究發(fā)現(xiàn)，急性氨氮脅迫下的大彈涂魚鰓組織中NHE3的蛋白水平在脅迫后24 h顯著升高并達到最大值，并且直至48 h蛋白表達量依舊顯著高于初始狀態(tài)，與之相對應的NHE基因mRNA的相對表達量也呈現(xiàn)出相似的變化趨勢，推測鈉氫交換蛋白可能行使了NH+4的排泄作用。這是由于在正常情況下NHE3行使Na+和H+的交換功能，但當魚體內(nèi)NH4+含量增多時，推測可能存在NH4+優(yōu)先于H+通過NHE3排出體外的趨勢以增強氨代謝這一功能性。之所以如此推測是由于在運輸生理學領(lǐng)域通常認為小分子質(zhì)量的分子如NH3，CO2是相對可滲透的，無需專門的運輸工具或蛋白通道。但Wright等［35］在大彈涂魚鰓組織中檢測到了NH4+的活躍排泄位點，提出可能存在一種新的排氨模式，即在Na+/NH4+交換復合物的作用下進行離子氨的排泄，尤其檢測到NHE2/NHE3表達量升高，如此更加印證了本研究的推論。而大彈涂魚體內(nèi)增多的NH4+可能是由于CA作用下提供的H+與NH3結(jié)合形成的，以降低魚體內(nèi)非離子氨的強氨毒性，因此推測大彈涂魚在氨氮脅迫下能通過NHE3將NH4+排出體外以降低氨毒性。

盡管在眾多研究中表明CA和NHE都與氨代謝功能性相關(guān)，本研究也得到了相似的結(jié)論，但其主要發(fā)揮促進NH4+的排泄功能，并不是魚類主要的氨代謝方式。相關(guān)研究指出，魚類主要氨代謝途徑是通過鰓上皮細胞將氨氮廢物以NH3的形式排出，而NH3的排出則涉及到氨轉(zhuǎn)運蛋白的作用［36］，隨著氨轉(zhuǎn)運蛋白（Rhesus-type ammonia transporter）具有運輸氨的功能被發(fā)現(xiàn)［37］，陸續(xù)在眾多淡水魚中發(fā)現(xiàn)具有類似編碼Rh蛋白的核苷酸序列，如紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）［38］、青斑河豚（Tetraodon nigroviridis）［39］、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［40］和紅樹林鳉魚（Kryptolebias marmoratus）［41］等。同樣也獲取到了定位在大彈涂魚鰓上皮細胞基底側(cè)編碼Rh蛋白的Rhcg1基因的cDNA序列，經(jīng)檢測，急性氨氮脅迫下的大彈涂魚鰓組織中Rhcg1基因相對表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在48 h達到最大值，推測其促進了Rh蛋白的加速合成，促進氨廢物以NH3的形式通過氨轉(zhuǎn)運蛋白持續(xù)排出，從而阻止了血氨濃度的持續(xù)升高。Rh基因以多種形式存在編碼合成Rh蛋白，如Rhag、Rhbg、Rhcg1和Rhcg2等，其中Rhcg1定位于鰓上皮細胞基底側(cè)，是參與NH3排泄的關(guān)鍵基因，通過基因敲除技術(shù)獲取無Rhcg1基因的斑馬魚，檢測發(fā)現(xiàn)其Rh蛋白表達量顯著下調(diào)且對排氨有顯著抑制作用［42］。對虹鱒鰓組織中Rhag、Rhbg、Rhcg1和Rhcg2活性位點鑒定分析，提出虹鱒鰓中的Rh蛋白利用酸化的邊界層形成有利的pH梯度，在血氨濃度升高時促進氨的快速代謝，進一步明確了Rh蛋白具有NH3氣體排泄通道的作用且酸化層的形成對氨代謝至關(guān)重要［43］。對此，本研究推測大彈涂魚通過鰓上皮細胞基底側(cè)Rhcg1基因的高表達合成更多的Rh蛋白加快NH3排出，并在CA的作用下，釋放H+協(xié)助Rh蛋白實現(xiàn)NH3排泄后的質(zhì)子化，降低離子氨對鰓上皮細胞的損傷和以NH3形式存在的氨進一步擴散進入魚體的可能性。同時，在鰓上皮細胞內(nèi)，CA釋放H+將膜內(nèi)NH3質(zhì)子化形成NH4+再通過NHE完成Na+/ NH4+的交換，最終實現(xiàn)在CA和NHE的共同作用下促進Rh蛋白高效排氨。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，急性氨氮脅迫會導致大彈涂魚血氨含量顯著升高，但其能迅速降低血氨水平，突出其具有重要的氨代謝途徑以應對不良環(huán)境而做出適應性調(diào)節(jié)的能力?；诎钡{迫下血氨濃度、相關(guān)蛋白活性及表達量、氨代謝相關(guān)基因mRNA在不同組織中表達量的變化，推測大彈涂魚主要通過兩種主要方式進行氨代謝：一方面是加強氨的排泄，如在鰓上皮細胞基底外側(cè)膜CA的作用下，釋放H+協(xié)助Rh蛋白實現(xiàn)NH3排泄后的質(zhì)子化降低氨氮毒性，同時在鰓上皮細胞內(nèi)，CA提供H+將NH3質(zhì)子化形成NH4+再通過NHE完成Na+/ NH4+的轉(zhuǎn)運，最終實現(xiàn)在CA和NHE的共同作用下促進Rh蛋白高效排氨；另一方面是加強氨的轉(zhuǎn)化作用，如通過肝臟中GS活性的提高加速合成無毒的中間產(chǎn)物（谷氨酰胺），避免氨在魚體內(nèi)過量積累。