李崇暉 尹俊梅

（1. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所 農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571101；2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站，海口 571101；3. 海南省熱帶觀賞植物種質(zhì)創(chuàng)新利用工程技術(shù)研究中心，儋州 571737）

花色是觀賞植物最受關(guān)注的性狀，新奇的花色是育種者始終追求的目標(biāo)。長(zhǎng)期以來(lái)雜交育種和突變選種是創(chuàng)造新花色的主要方法?；ㄇ嗨厥腔ò曛衅毡榇嬖诘幕ㄉ?，能使花呈現(xiàn)從紅到紫紅到藍(lán)的變化，花青素在胞質(zhì)中合成，在液泡中積累［1］。在高等植物中花青素的生物合成從查爾酮開始到生成花青素3-葡萄糖苷的途徑非常保守（圖1），且研究得比較透徹［1］。根據(jù)對(duì)不同觀賞植物花青素生物合成途徑的認(rèn)知，每個(gè)物種表達(dá)特定的酶基因，只能積累有限種類的花青素苷，因此一個(gè)物種擁有全部種類的花色幾乎是不可能的。例如，大宗貿(mào)易花卉月季、康乃馨和菊花均因不積累飛燕草素為核心的花青素苷而缺少紫色和藍(lán)色的品種。培育藍(lán)色名貴花卉是幾輩育種者多年的夢(mèng)想，基因工程技術(shù)為花色育種者打開了一扇大門，使突破物種遺傳背景限制，培育新奇的花色成為可能。藍(lán)色花的育種一直是花色研究的熱點(diǎn)，近年來(lái)獲得了大量的研究成果。這期間最突出的成就是月季、菊花、蝴蝶蘭等重要花卉藍(lán)色品種的誕生［2-4］。本文根據(jù)已有研究基礎(chǔ)［5-6］總結(jié)了藍(lán)色花形成的原因以及近15年藍(lán)色花基因工程育種的基本策略及研究進(jìn)展。

圖1 植物花青素苷生物合成途徑簡(jiǎn)圖［2］

1 藍(lán)色花形成的化學(xué)和生理基礎(chǔ)

1.1 藍(lán)色花色素

藍(lán)色花最主要的成因在于花青素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，藍(lán)色花瓣中含有的花青素通常被甲基化、糖苷化和?；揎?，被芳香酸如對(duì)-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、對(duì)-羥基苯甲酸等多重?；撬{(lán)色花中最主要的花青素苷?；揎棧枷闼狨；c花青素形成“三明治”型的分子內(nèi)堆疊，這使得花青素苷藍(lán)化且更加穩(wěn)定［7-8］。酰基化修飾的位置也非常重要，通常在花青素3'-和/或7-位上發(fā)生芳香酸?；?-和/或5-位上的芳香酸?；瘜?duì)于藍(lán)色的形成更為重要［9］。大多數(shù)藍(lán)色花主要含有飛燕草素糖苷及其酰基化衍生物，極少數(shù)的藍(lán)色花以酰基化的矢車菊素糖苷或矮牽牛素糖苷為主。以飛燕草素為主的藍(lán)色花典型代表有鴨跖草（Commelina communis）、飛燕草（Delphiniumspp.）、 龍 膽（Gentianaspp.）、鼠尾草（Salviaspp.）、蝶豆花（Clitoria ternatea）、風(fēng)信子（Hyacinthus orientalis）等［7，10-11］。以?；杠嚲账靥擒諡橹鞯乃{(lán)色花有矢車菊（Centaureacyanus）、圓葉牽牛（Ipomoea purpurea）、 綠絨蒿（Meconopsisspp.）等［7，12-14］。以酰基化矮牽牛素糖苷為主的藍(lán)色花以琉璃唐草（Nemophila menziesii）為代表［7，15］。

鴨跖草、矢車菊、鼠尾草、琉璃唐草的藍(lán)色色素為金屬絡(luò)合花青素苷（Metalloanthocyanins），即花青素苷、黃酮和金屬離子以6∶6∶2的化學(xué)計(jì)量比自絡(luò)合形成的超分子金屬絡(luò)合色素［7］。在以飛燕草素為發(fā)色團(tuán)的超分子金屬絡(luò)合色素中，Mg2+對(duì)穩(wěn)定藍(lán)色的作用是足夠的；在以矢車菊素或矮牽牛素為發(fā)色團(tuán)的金屬絡(luò)合色素中，除了Mg2+以外，還需要1/6當(dāng)量的Fe3+輔助［7］。然而，自然界中含有金屬絡(luò)合花青素苷的藍(lán)色花卻非常少。通常的藍(lán)色花中以非化學(xué)計(jì)量比存在的金屬離子對(duì)花青素苷起到輔助著色的作用，這些藍(lán)色色素穩(wěn)定性較差，在分離色素或結(jié)晶的過(guò)程中藍(lán)色便消失了［7］。例如，大花綠絨蒿（Meconopsis grandis）的色素組成為1當(dāng)量的矢車菊素糖苷，2或更多當(dāng)量的山奈酚衍生物（黃酮醇），1/6當(dāng)量的Fe離子和過(guò)量的Mg2+［16］。

1.2 藍(lán)色呈現(xiàn)所需要的液泡環(huán)境

許多體外試驗(yàn)表明，有了藍(lán)色花青素如飛燕草素及其衍生物通常不一定呈現(xiàn)藍(lán)色，可見液泡內(nèi)的環(huán)境包括pH值、有機(jī)物和無(wú)機(jī)物的組成和含量等對(duì)藍(lán)色花的形成尤為重要。以繡球花為例，紅色、紫紅色、藍(lán)色等花中均只含有飛燕草素3-葡萄糖苷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)色品種花瓣的pH值、5-O-乙?？鼘幩崤c花青素苷的摩爾比率，以及Al3+的摩爾當(dāng)量都顯著高于紅色細(xì)胞［17-18］。郁金香品種Murasakizuisho內(nèi)層花瓣基部因大量積累鐵離子，與飛燕草素3-蕓香糖苷作用而呈藍(lán)色［19］。牽牛花（Ipomoea tricolorcv. Heavenly Blue）在花蕾期為紫紅色，完全開放為藍(lán)色，其所含色素為紫紅色的咖啡酸?；炙幓ㄋ靥擒?，沒(méi)有金屬離子絡(luò)合。在花蕾期液泡pH值為6.6，完全開放期液泡pH值上升為7.7［20］。

目前藍(lán)色花形成的化學(xué)和生理機(jī)制尚未完全解析，根據(jù)已有研究結(jié)果，藍(lán)色花形成的因素主要有：（1）藍(lán)色花青素的生成；（2）花青素苷的多重芳香酸?；?；（3）黃酮、黃酮醇等輔助色素參與；（4）金屬離子絡(luò)合；（5）較高的液泡pH值等。

2 與藍(lán)色花形成相關(guān)的基因

2.1 與藍(lán)色色素合成相關(guān)的酶基因

在高等植物中，從查爾酮到花青素-3-葡萄糖苷的生物合成途徑非常保守，從花青素-3-葡萄糖苷之后的進(jìn)一步糖苷化、?；揎椃绞皆诓煌参镏凶兓鄻樱虼怂{(lán)色花的花青素苷合成途徑尚未完全闡明。已知的幾種參與藍(lán)色花青素合成的關(guān)鍵酶中，細(xì)胞色素P450氧化酶家族 CYP75A或CYP75B亞家族的類黃酮3'，5'-羥化酶（F3'5'H）催化二氫山奈酚B環(huán)上的3'-和5'-位的羥基化生成二氫楊梅素，是合成飛燕草素的前體。由于單一積累飛燕草素糖苷及其多?；难苌锉挥N者認(rèn)為是培育藍(lán)色花最有效的手段，因此F3'5'H基因最受關(guān)注，并已從多種植物中克隆并鑒定［21］。而抑制藍(lán)色花自身的F3'5'H基因表達(dá)，可導(dǎo)致花色變成紫紅色，如龍膽［22］。

二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）催化二氫黃酮醇生成無(wú)色花青素苷元（Leucoanthocyanidins）。不同植物中DFR的底物專一性影響了花瓣中最終積累的花青素苷元B環(huán)上的羥基化程度。例如，矮牽牛、大花蕙蘭等的DFR只能催化二氫槲皮素和二氫楊梅素，不能催化二氫山奈酚［9］。因此這些植物的DFR對(duì)于專一性地合成飛燕草素是有利的。

花青素的糖苷化和?；揎棇?duì)于維持其顏色的穩(wěn)定非常重要，也是藍(lán)色花色素最常見的結(jié)構(gòu)修飾方式。迄今鑒定出的花青素糖苷化酶有兩類，一類是依賴UDP-糖的糖苷化酶家族1，另一類是依賴?；?葡萄糖的花青素糖苷化酶［9］。已鑒定的花青素苷?；D(zhuǎn)移酶也分為兩類，一類是利用?；?CoA為供體，將?；D(zhuǎn)移至花青素苷糖基部分的特定位置；另一類是類絲氨酸羧肽酶（SCPL）-酰基轉(zhuǎn)移酶，利用酰基葡萄糖作為供體分子，催化花青素苷糖基部分的酰基化［9］。飛燕草的糖基轉(zhuǎn)移酶基因AA7GT或?；D(zhuǎn)移酶基因AA7GT-AT發(fā)生突變，均可產(chǎn)生由于積累中間產(chǎn)物而導(dǎo)致粉色或者紅色的花色表型［23］。

2.2 細(xì)胞pH值調(diào)控基因

矮牽?；ò曛需b定出7個(gè)調(diào)控pH值的基因位點(diǎn)PH1-PH7［24］。其中PH5編碼一種定位于液泡膜的H+P3A-ATPase質(zhì)子泵。當(dāng)PH5基因發(fā)生突變時(shí)，液泡中的pH值升高，花瓣從紫紅色變成藍(lán)紫色［25］。PH1基因突變體的花色與PH5基因突變體顏色相似，PH1編碼的P3B-ATPase可與PH5編碼的H+P3AATPase物理性結(jié)合，促進(jìn)H+轉(zhuǎn)運(yùn)活性，增加液泡的酸化程度［26］。裂葉牽牛（Ipomoea nil）開花過(guò)程中InNHX1和InNHX2基因編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將K+/Na+轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡，提高液泡pH值，使花色變藍(lán)［27-28］。

2.3 金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因

從郁金香中分離鑒定了一種編碼液泡鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因TgVit1，其編碼蛋白具有促進(jìn)液泡中鐵離子的積累，與飛燕草素3-蕓香糖苷作用呈現(xiàn)藍(lán)色的功能［29］。隨后在矢車菊中鑒定了與TgVit1同源的基因CCViT［30］。繡球花中分離鑒定了編碼液泡膜和質(zhì)膜定位的Al離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因VALT和編碼質(zhì)膜Al離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1的基因PALT1，這些基因編碼的Al離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與Al離子參與藍(lán)色繡球花花色的形成有關(guān)［31］。

3 藍(lán)色花卉基因工程育種實(shí)踐與策略

目前，育種者利用基因工程技術(shù)培育藍(lán)色花主要有以下幾方面的實(shí)踐（表1）。

3.1 人工創(chuàng)造飛燕草素合成途徑

盡管矢車菊、綠絨蒿等藍(lán)色花是由矢車菊素糖苷與金屬離子形成絡(luò)合物而呈藍(lán)色，含有芍藥花素糖苷的牽?；ㄓ捎诩?xì)胞內(nèi)pH值升高而產(chǎn)生藍(lán)色，但是，大多數(shù)藍(lán)色花的成因是積累大量的飛燕草素。而許多缺少藍(lán)色花色的植物如康乃馨、月季、菊花、百合、蝴蝶蘭等［21，32］就是因?yàn)楸旧砣狈︼w燕草素合成途徑上的關(guān)鍵基因F3'5'H。因此通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，向不含飛燕草素的花卉植物中，轉(zhuǎn)入外源F3'5'H基因促進(jìn)飛燕草素的生成，是全世界公認(rèn)的最有可能獲得藍(lán)色花的手段。

3.1.1 轉(zhuǎn)基因受體的篩選原則 轉(zhuǎn)基因受體要有合適的遺傳背景和類黃酮組成［4］。轉(zhuǎn)入外源F3'5'H后，能否將F3'5'H酶的產(chǎn)物二氫楊梅素轉(zhuǎn)化成飛燕草素非常關(guān)鍵，即首先要檢測(cè)轉(zhuǎn)基因受體DFR酶是否具有催化二氫楊梅素能力，如沒(méi)有則要轉(zhuǎn)入外源的DFR基因。還要考慮受體植物內(nèi)源的DFR、F3'H和FLS酶對(duì)F3'5'H酶底物的競(jìng)爭(zhēng)。要避免底物競(jìng)爭(zhēng)，最好有這些競(jìng)爭(zhēng)基因功能缺失的天然突變體，或者通過(guò)基因工程手段如RNAi等下調(diào)這些基因的表達(dá)。此外，盡量選擇花瓣pH值較高、黃酮/黃酮醇含量較高的材料［21］。這樣才有可能獲得較理想的藍(lán)色花表型。

3.1.2 單一轉(zhuǎn)入外源F3'5'H基因 國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)轉(zhuǎn)入外源F3'5'H基因做了大量的嘗試。將洋桔梗（Eustoma grandiflorum）F3'5'H基因轉(zhuǎn)入煙草，轉(zhuǎn)基因煙草最多僅積累了23%的3'，5'-羥基化的花青素苷，花色有所加深［33］。Tanaka［21］將三色堇（Violasp. cultivar black pansy）F3'5'H基因轉(zhuǎn)入后使月季最多產(chǎn)生了60%的飛燕草素糖苷，花色變成深紅色。堇菜（Violaspp.）F3'5'H基因在月季品種Lavande中過(guò)表達(dá)，最多可產(chǎn)生44.2%的飛燕草素，然而有三分之二的轉(zhuǎn)基因株系的飛燕草素含量少于20%，花色變化不明顯［4］。蔓長(zhǎng)春花（Vinca major）F3'5'H基因VmFH1在紅色矮牽牛中過(guò)表達(dá)，產(chǎn)生了深紅色帶深紫色扇形區(qū)域的花色表型［34］。風(fēng)鈴草（Campanula medium）F3'5'H基因在煙草中異源表達(dá)可以特異性積累飛燕草素（最多達(dá)99%），花色也變成新奇的紫色［35］。蝶豆花F3'5'H基因轉(zhuǎn)入馬鞭草植株后，比過(guò)表達(dá)馬鞭草F3'5'H基因的植株產(chǎn)生的表型變化更明顯，花色由粉紅色變成紫紅色［36］。將蝴蝶蘭（Phalaenopsis）F3'5'H基因在矮牽牛花中過(guò)表達(dá)，使花色由粉色變成深粉色；蝴蝶蘭F3'5'H基因在東方百合Sorbonne花被片中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)，產(chǎn)生了紫色的細(xì)胞［37］。日本Florigene公司將三色堇（Violasp. cultivar black pansy）F3'5'H基因在非洲菊中過(guò)表達(dá)，能夠積累50%的飛燕草素糖苷，花色也發(fā)生了一定的變化［8］。日本千葉大學(xué)Mii教授等［6］將鴨跖草（Commelina communis）F3'5'H基因轉(zhuǎn)入大麗花，轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生了飛燕草素衍生物，花色呈現(xiàn)藍(lán)紫色［6，32］。Mii教授等還將鴨跖草F3'5'H基因轉(zhuǎn)入了蝴蝶蘭，由于粉色蝴蝶蘭花瓣中主要花青素為7-位和3'-位多重糖苷化和芳香酸?；氖杠嚲账?，因此單獨(dú)過(guò)表達(dá)矢車菊F3'5'H基因的蝴蝶蘭很容易生成多重?；娘w燕草素，呈現(xiàn)出非常接近藍(lán)色的花色［6，32］。

Brugliera等［38］將 三 色 堇（Violasp. cultivar black pansy）F3'5'H基因在菊花中過(guò)表達(dá)，產(chǎn)生40%的飛燕草素糖苷，使花瓣顏色轉(zhuǎn)藍(lán)，然而所產(chǎn)生的花色并不新奇，已有育種者用傳統(tǒng)手段育成類似的花色。Noda等［39］篩選出菊花中高效驅(qū)動(dòng)外源F3'5'H表達(dá)的啟動(dòng)子為菊花F3H（CmF3H）啟動(dòng)子，在此啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，帶有煙草NtADH基因5'UTR序列的風(fēng)鈴草F3'5'H基因過(guò)表達(dá)能產(chǎn)生更多的飛燕草素（達(dá)到95%），花色也呈現(xiàn)出了藍(lán)紫色。

表1 已有的培育藍(lán)色花轉(zhuǎn)基因育種策略及獲得的花色表型

以上結(jié)果表明，F(xiàn)3'5'H基因的來(lái)源以及其轉(zhuǎn)化的受體對(duì)改變花色的結(jié)果都非常重要，因此需要篩選適合受體植物的外源基因和啟動(dòng)子。然而通常僅轉(zhuǎn)入外源F3'5'H基因雖然能在目標(biāo)植物花瓣中產(chǎn)生飛燕草素，卻往往并不能達(dá)到令人滿意的藍(lán)色效果。

3.1.3 外源F3'5'H基因與其它關(guān)鍵酶基因同時(shí)轉(zhuǎn)入

3.1.3.1 與DFR基因同時(shí)轉(zhuǎn)入 將外源F3'5'H基因和DFR基因同時(shí)轉(zhuǎn)入創(chuàng)造藍(lán)色花最經(jīng)典的實(shí)例就是藍(lán)紫色的“Moon”系列康乃馨的誕生。以散枝型DFR和F3'H突變體白花品種White Unesco為轉(zhuǎn)基因受體，轉(zhuǎn)入矮牽牛F3'5'H基因和DFR基因，獲得了完全積累飛燕草素的淺紫色品種FLORIGENE Moondust，這是世界上首個(gè)商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因觀賞植物［21］。隨后發(fā)現(xiàn)三色堇（Violasp. cultivar black pansy）的F3'5'H基因在康乃馨中表現(xiàn)更好，將其與矮牽牛DFR-A基因同時(shí)轉(zhuǎn)化DFR突變體品種Unesco，產(chǎn)生了比Moondust積累更多飛燕草素的深紫色品種FLORIGENE Moonshadow，其花瓣中含有一種芹菜素C-苷作為輔助色素，且花瓣的pH值更高，使花色看起來(lái)更藍(lán)［40］。采用同樣的策略育出了 FLORIGENE Moonvista、FLORIGENE Moonshade、FLORIGENE Moonlite、FLORIGENE Moonaqua等 眾多商業(yè)品種［21］。

月季品種Lavande中，同時(shí)過(guò)表達(dá)堇菜（Violaspp.）F3'5'H基因和鳶尾（Iris×hollandica）DFR基因比單獨(dú)過(guò)表達(dá)堇菜F3'5'H基因積累了更多的飛燕草素，最高可達(dá)75%［4］。蝴蝶蘭F3'5'H基因與風(fēng)信子（Hyacinthus orientalis'Sky Jacket'）DFR基因同時(shí)在矮牽牛中過(guò)表達(dá)比蝴蝶蘭F3'5'H基因單獨(dú)過(guò)表達(dá)能積累更多的飛燕草素糖苷，在東方百合花被片中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)這兩個(gè)基因比單獨(dú)過(guò)表達(dá)F3'5'H基因產(chǎn)生顏色更紫的細(xì)胞［37］。

3.1.3.2 與花青素苷修飾酶基因同時(shí)轉(zhuǎn)入 除了改變受體植物的花青素苷元結(jié)構(gòu)生成飛燕草素外，學(xué)者們也對(duì)飛燕草素糖苷的芳香?；揎椷M(jìn)行了嘗試。將堇菜（Violaspp.）F3'5'H基因和夏堇（Torenia hybridcultivar Summer Wave Blue）5AT（花青素苷5-羥基肉桂酸酰基轉(zhuǎn)移酶）基因共同轉(zhuǎn)化不同花色的月季品種，結(jié)果顯示各品種轉(zhuǎn)基因株系都不同程度地積累了飛燕草素糖苷，花色也發(fā)生了不同程度的藍(lán)化。只有一些（不超過(guò)44%）花青素苷被夏堇的5AT酶?；?-位?；荒苁够ㄇ嗨剀盏淖畲笪詹ㄩL(zhǎng)紅移4 nm，因此很難觀察到由?；a(chǎn)生的花色變化［4］。

由于單獨(dú)轉(zhuǎn)化風(fēng)鈴草F3'5'H基因得到的菊花花色并不是純正的藍(lán)色［39］，為了讓菊花能像蝶豆花一樣積累3'-位和5'-位被糖苷化的飛燕草素糖苷，研究者進(jìn)一步將蝶豆花的UDP-葡萄糖：花青素苷3'，5'-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因（CtA3'5'GT）與風(fēng)鈴草F3'5'H基因同時(shí)轉(zhuǎn)入菊花，成功生成了飛燕草素3'，5'-雙糖苷化的衍生物，在木犀草素7-丙二酰葡萄糖苷輔助著色作用下，使花瓣呈現(xiàn)了純正的藍(lán)色［5］。應(yīng)用這種方法實(shí)現(xiàn)了各種花型藍(lán)色菊花的培育［32］。

3.1.3.3 與輔助基因同時(shí)轉(zhuǎn)入 矮牽牛的一種在花中特異表達(dá)的基因difF，因其編碼一種細(xì)胞色素b5蛋白能夠增強(qiáng)F3'5'H酶活性［41］，在藍(lán)色花育種中可作為F3'5'H基因的輔助基因，同時(shí)轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物。FLORIGENE公司向缺少F3'H酶活性積累天竺葵素的紅色康乃馨品種Cerise Westpearl中，同時(shí)轉(zhuǎn)入矮牽牛F3'5'H基因（Hf1）和difF，獲得了深紫色的品種FLORIGENE Moonvelvet在美國(guó)上市［21］。在東方百合中同時(shí)瞬時(shí)表達(dá)蝴蝶蘭F3'5'H基因和矮牽牛difF基因，然而被轉(zhuǎn)化細(xì)胞顏色沒(méi)有發(fā)生變化［37］。

3.1.4 轉(zhuǎn)入外源基因同時(shí)抑制內(nèi)源關(guān)鍵酶基因 FLORIGENE公司利用RNAi技術(shù)抑制康乃馨紅色品種Cerise Westpearl內(nèi)源DFR基因表達(dá)，并轉(zhuǎn)入三色堇（Violasp. cultivar black pansy）F3'5'H基因和矮牽牛DFR基因，產(chǎn)生了紫色品種FLORIGENE Moonberry和淺紫色品種FLORIGENE Moonpearl，均已上市［21］。

抑制月季品種Lavande的DFR基因，同時(shí)轉(zhuǎn)入堇菜（Violaspp.）F3'5'H基因和鳶尾（Iris×hollandica）DFR基因，2/3的轉(zhuǎn)基因株系中積累超過(guò)80%的飛燕草素，最高可達(dá)98%，成功地使月季中花青素代謝流從矢車菊素合成途徑轉(zhuǎn)向了飛燕草素合成途徑，花色由淺紫紅色變成了藍(lán)紫色［4］。至此藍(lán)色月季Applause誕生了，并于2009年上市［21］。然而Applause花色還是偏向紫色，接下來(lái)將從增加輔助色素和調(diào)節(jié)液泡pH值等方向進(jìn)一步改良［21］。不久前完成的月季基因組測(cè)序獲得了當(dāng)前植物基因組中質(zhì)量最高的基因組信息，通過(guò)重建次生代謝及其調(diào)控通路，提出了月季花色和花香關(guān)聯(lián)的調(diào)控模型，為進(jìn)一步闡明月季花色分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)，能夠加速月季、薔薇科物種及其他觀賞植物的花色改良育種［42］。

菊花中F3'H基因是矢車菊素合成途徑的關(guān)鍵因，為了使花青素向飛燕草素合成途徑轉(zhuǎn)變，Huang等［43］采用RNAi技術(shù)抑制菊花CmF3'H的表達(dá)，且過(guò)表達(dá)瓜葉菊（Senecio cruentus）F3'5'H基因（PCFH），然而瓜葉菊F3'5'H酶在菊花中僅表現(xiàn)出3'-羥基化的功能，使轉(zhuǎn)基因菊花中的矢車菊素含量顯著增加。Brugliera 等［38］嘗試了利用 hairpin RNAi（hp RNAi）干擾菊花CmF3'H的表達(dá)，同時(shí)轉(zhuǎn)入三色堇（Violasp. cultivar black pansy）F3'5'H，使轉(zhuǎn)基因菊花中積累達(dá)80%的飛燕草素糖苷，花色由粉色變?yōu)樽仙?/p>

3.2 增加輔助色素含量

Aida等［44］研究一系列夏堇的轉(zhuǎn)基因植株發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入反義DFR基因的花色比轉(zhuǎn)入反義CHS基因的花色更藍(lán)。原因是DFR基因功能受抑制導(dǎo)致輔助色素黃酮的含量顯著增加，因而使花色更藍(lán)。這一方法可應(yīng)用于其它植物藍(lán)色花的育種。

3.3 提高液泡pH值

盡管已育成的藍(lán)色月季中積累了足夠多的飛燕草素，但是由于花瓣細(xì)胞液泡酸度過(guò)高，花色仍然呈現(xiàn)出一定程度的紅色色調(diào)［4］。因此要使花瓣呈現(xiàn)藍(lán)色，轉(zhuǎn)入基因創(chuàng)造一個(gè)pH值5.6-6.2微酸性的液泡環(huán)境，或者選擇天然具有較高pH值的受體材料尤為重要［32］。例如，由細(xì)胞培養(yǎng)得到的突變體培育而成的紫色仙客來(lái)主要含有錦葵素3，5-二葡萄糖苷，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)隱性突變提高花瓣細(xì)胞pH值有望獲得藍(lán)色仙客來(lái)［32］。

3.4 增加金屬離子含量

在紫色郁金香花被片細(xì)胞中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)液泡鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TgVit1，使鐵蛋白合成基因TgFER受抑制，阻止鐵蛋白積累并結(jié)合鐵離子，使細(xì)胞變藍(lán)［29，45］。進(jìn)而 Shoji等［46］又利用花瓣特異表達(dá)的TgMYB1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)TgVit1基因的表達(dá)，期望獲得藍(lán)色郁金香。此外，Kurihara等［47］將TgVit1在積累飛燕草素3，5-二葡萄糖苷的突變體仙客來(lái)中瞬時(shí)表達(dá)，獲得了藍(lán)色細(xì)胞，有望通過(guò)穩(wěn)定表達(dá)得到藍(lán)色仙客來(lái)。

3.5 藍(lán)色花卉基因工程育種策略

綜合上述藍(lán)色花育種實(shí)踐，如要成功地利用基因工程創(chuàng)造有商業(yè)價(jià)值的花卉需要具備以下條件：（1）分離到有效的基因；（2）建立高效的目標(biāo)植物遺傳轉(zhuǎn)化體系；（3）通過(guò)啟動(dòng)子序列、目標(biāo)基因的來(lái)源和終止子序列等方面來(lái)優(yōu)化目標(biāo)基因的表達(dá)；（4）選擇遺傳背景合適的受體品種［21］。根據(jù)藍(lán)色花形成的因素，創(chuàng)造藍(lán)色花應(yīng)從以下方面入手：積累飛燕草素糖苷，其糖基被芳香有機(jī)酸酰化，或者加強(qiáng)花青素苷與輔助色素、和/或金屬離子之間的相互作用。

4 小結(jié)

盡管眾多育種實(shí)踐證實(shí)了通過(guò)基因工程的手段創(chuàng)造藍(lán)色花的可行性，然而讓目標(biāo)植物特異地大量積累某一類色素并呈現(xiàn)藍(lán)色非常困難。首先需要考慮藍(lán)色花青素苷通常有復(fù)雜的糖苷化和?；揎?，這些修飾酶在異源植物中的活性是否能夠正常發(fā)揮，還需要考慮調(diào)節(jié)液泡pH值以及有輔助色素和金屬離子共存，這就需要對(duì)目標(biāo)植物的花色形成機(jī)制有全面的認(rèn)識(shí)。近年來(lái)日趨普及的全基因組測(cè)序工作將為全面解析植物花色形成的機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。此外，對(duì)于非模式植物來(lái)說(shuō)，很多觀賞植物普遍存在遺傳轉(zhuǎn)化效率低、童期長(zhǎng)、轉(zhuǎn)入基因表達(dá)變異大等問(wèn)題，攻克這些難題才有希望獲得更多新奇的商品化的藍(lán)色花卉。