盧紅華 許亮掌 覃發(fā)鳳

(廣西南寧市邕寧區(qū)人民醫(yī)院，1 內(nèi)科，2 內(nèi)兒科，3 呼吸內(nèi)科，南寧市 530299，電子郵箱：lhh891@126.com)

腦血管疾病嚴(yán)重威脅著中老年人的身心健康，隨著人口老齡化的加劇，腦血管疾病的危害也日益加重[1]。其中缺血性腦卒中是導(dǎo)致中老年人殘疾甚至死亡的首要原因[2-3]。頸動(dòng)脈粥樣硬化(carotid atherosclerosis，CAS)的發(fā)生以及其斑塊的形成，是老年人發(fā)生缺血性腦卒中、短暫性腦缺血等缺血性腦病的重要危險(xiǎn)因素，其受多種因素影響，如吸煙、飲酒、高血壓、高血脂、高同型半胱氨酸血癥等[4-5]。已有大規(guī)模流行病學(xué)研究證實(shí)，血清同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平升高是缺血性腦血管事件發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其與血管危險(xiǎn)性事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間呈劑量依賴關(guān)系[6]。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是Hcy的代謝酶，C677T點(diǎn)突變是其常見的基因突變類型，可使該酶活性下降，導(dǎo)致血漿Hcy的水平明顯升高。另有研究指出，血漿Hcy水平和MTHFR C667T基因多態(tài)性能增加早期缺血性腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[7]，且MTHFR C667T基因多態(tài)性與民族有關(guān)[8]。但血漿Hcy水平及MTHFR C677T基因多態(tài)性是否與不同民族的CAS的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，目前仍缺乏相關(guān)研究報(bào)道。壯族是我國人口最多的少數(shù)民族，而廣西則是壯族人口最多的省份，其壯族總?cè)丝谶_(dá)1 444.85萬人[9]。本研究選擇在我院就診的漢族及壯族CAS患者作為研究對象，分析兩者Hcy水平、MTHFR C667T基因多態(tài)性的差異，旨在為頸動(dòng)脈硬化粥樣硬化的防治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1月至2019年1月我院內(nèi)科收治的89例CAS患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)直系家屬報(bào)告或自我報(bào)告其三代以內(nèi)均為壯族血緣(或漢族血緣)；(2)年齡20～75歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有心、肝、腎功能不全及精神異常者；(2)既往患糖尿病、腦梗死、出血性腦血管疾病者；(3)既往有血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、自身免疫病者；(4)3個(gè)月內(nèi)服用過影響Hcy水平的藥物者；(5)病歷資料不完整者。其中壯族47例，漢族42例。壯族組和漢族組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 兩組一般資料的比較

注：▲曾經(jīng)吸過100支煙和每月至少飲酒1次。

1.2 觀察指標(biāo)的檢測方法

1.2.1 血清Hcy含量的測定：抽取所有研究對象清晨空腹靜脈血3 mL，采血后不抗凝，于1 h內(nèi)以4 000 r/min離心10 min分離血清，由本院檢驗(yàn)科采用日立HLTACHI-7600全自動(dòng)生化分析儀測定血清Hcy水平。

1.2.2 MTHFR C677T基因多態(tài)性檢測：(1)標(biāo)本采集。抽取所有研究對象清晨空腹靜脈血3 mL，抗凝后充分搖勻，4 000 r/min離心10 min。(2)DNA提取。取中層白細(xì)胞，使用Solarbio公司的全血基因組DNA提取試劑盒(批號：D1850-50)提取基因組DNA。(3)目的基因擴(kuò)增。上游引物為5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′，下游引物為5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′，引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。按照PCR檢測試劑盒(南京諾維贊生物科技有限公司，批號：P102-d1)配制PCR反應(yīng)體系20 μL，包括ddH2O 6.6 μL，2×Phanta Max Buffer 10 μL，dNTP Mix 0.4 μL，上下游混合引物1.6 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.4 μL，DNA模板1 μL。PCR條件為預(yù)變性94℃ 5 min，解鏈94℃ 30 s，退火62℃ 30 s，延伸72℃ 30 s；循環(huán)35次后再以72℃延伸7 min。擴(kuò)增完成后向PCR產(chǎn)物加入2 μL 10×loading buffer混勻備用。(4)PCR產(chǎn)物檢測。取2 μL的PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，將凝膠板放在紫外透射儀的石英玻璃上檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。(5)使用限制性內(nèi)切酶Hinf Ⅰ在37℃水浴下消化擴(kuò)增產(chǎn)物；配制20 μL反應(yīng)體系，將ddH2O 7.5 μL，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，10×緩沖液(美國NEB公司)2 μL，Hinf Ⅰ限制性內(nèi)切酶(美國NEB公司)0.5 μL加入到200 μL離心管，將離心管置于37℃溫浴至少8 h。溫浴后將酶切產(chǎn)物加入3%瓊脂糖凝膠孔中，接通電源并設(shè)置電壓110 V后電泳約90 min，電泳后用凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD，版本號：Gel Doc XRt)在紫外燈下觀察酶切后電泳帶及其位置，以DNA Marker(198 bp)為標(biāo)準(zhǔn)對照，將電泳結(jié)果數(shù)據(jù)保存分析。

1.3 CAS判斷 所有入組患者均使用日本日立HI VISION Avius L型四維彩色多普勒超聲儀進(jìn)行檢查?；颊咂脚P，暴露頸部，將中心頻率7.5 MHz的探頭置于頸部，分別檢查左右頸總動(dòng)脈(約為頸總動(dòng)脈分叉前1 cm處)、頸總動(dòng)脈分叉處、頸內(nèi)動(dòng)脈(約為頸總動(dòng)脈分叉后1 cm處)等3個(gè)位置血管后壁的內(nèi)-中膜厚度(intima-media thickness,IMT)；IMT值表示血管內(nèi)膜面至中層外表面的厚度；局部放大所測量部位，調(diào)節(jié)聲束方向，與管壁垂直后方可測量；取6個(gè)部位的IMT平均值作為最終結(jié)果。根據(jù)頸動(dòng)脈IMT值來判斷患者是否存在CAS，IMT≤1.0 mm為正常，1.0 mm

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用擬合χ2檢驗(yàn)對各組的基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因型的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 47例壯族組患者中檢出CC基因型6例，CT基因型28例，TT基因型13例，T等位基因頻率為57.45%，C等位基因頻率為42.55%；在42例漢族組患者中檢出CC基因型15例，CT基因型21例，TT基因型6例，T等位基因頻率為39.29%，C等位基因頻率為60.71%。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩組觀察值與理論值之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，表明本研究人群MTHFR C677T基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡，研究對象是同一群體。見表2。

表2 MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因型的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

2.2 兩組MTHFR C677T基因多態(tài)性的比較 壯族組MTHFR C677T基因T等位基因頻率及TT基因型頻率均高于漢族組(均P<0.05)。見表3。

表3 壯族與漢族患者M(jìn)THFR C677T基因多態(tài)性的比較[n(%)]

2.3 兩組血清Hcy水平的比較 壯族組血清Hcy水平為(26.41±6.82)mol/L，高于漢族組的(23.34±8.21)mol/L，但是兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.625,P=0.089)。

3 討 論

Hcy是一種含硫氨基酸，體內(nèi)的Hcy是飲食攝取的蛋氨酸經(jīng)代謝后產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物。血清Hcy水平上升會(huì)影響血管平滑肌細(xì)胞、損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，激活炎癥介質(zhì)和活化炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，并可影響體內(nèi)轉(zhuǎn)甲基化反應(yīng)，從而導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生CAS病變，進(jìn)而造成血管受損，最終出現(xiàn)心腦血管事件[10-12]。有研究表明MTHFR基因多態(tài)性與血清Hcy水平有關(guān)[13]，但不同的研究報(bào)道結(jié)果仍存在較大差異[14]。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)MTHFR基因多態(tài)性與地域、民族等因素有關(guān)[8，15]。本研究結(jié)果顯示，壯族患者的TT基因型及T等位基因頻率均高于漢族(均P<0.05)，但兩者血清Hcy水平差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)，提示動(dòng)脈粥樣硬化患者中壯族與漢族人群MTHFR基因多態(tài)性存在差異，但MTHFR基因多態(tài)性的差異或許并不影響漢族與壯族人群的血清Hcy水平，這可能與血清Hcy代謝途徑有關(guān)。血清Hcy主要的代謝途徑有3種：在輔酶維生素B6催化下轉(zhuǎn)化為半胱氨酸，被甜菜堿甲基化成蛋氨酸，在輔酶維生素B12催化下被甲基四氫葉酸甲基化生成蛋氨酸。葉酸是甲基化途徑的甲基間接供體，也是維生素B6、維生素B12催化Hcy代謝的關(guān)鍵輔酶，而MTHFR是甲基直接供體甲基四氫葉酸的關(guān)鍵酶，可見，維生素B6、維生素B12、甜菜堿、葉酸攝入不足，或MTHFR發(fā)生基因突變使甲基四氫葉酸合成不足等因素均可導(dǎo)致Hcy代謝出現(xiàn)異常，而MTHFR基因多態(tài)性只是影響血清Hcy水平眾多因素中的一種[16]。

本研究中，雖然兩組Hcy水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但壯族組血清Hcy水平稍高于漢族，這可能與壯族人群高鈉飲食、喜食糯米與糯米制品、腌制食品、不健康的生活方式，教育程度低有關(guān)，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。目前仍沒有足夠的證據(jù)證實(shí)CAS患者的血清Hcy水平與民族存在的較高相關(guān)性，可能是由于本研究納入的樣本數(shù)較少，對研究結(jié)果產(chǎn)生一定的偏倚。

綜上所述，CAS患者中，壯族與漢族人群的MTHFR C667T基因多態(tài)性存在差異，但Hcy水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其或不受代謝酶基因多態(tài)性的影響。