郭麗麗，戶雪敏，張升恒，李 穎，伏松平，范三紅，胡小平

(1.西北農(nóng)林科技大學植物保護學院，陜西楊凌 712100；2.農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點實驗室, 陜西楊凌 712100；3.天水市植物保護檢疫站，甘肅天水 741020；4.西北農(nóng)林科技大學生命學院，陜西楊凌 712100)

小麥條銹病是由條形柄銹菌(Pucciniastriiformisf. sp.tritici)引起的重要世界流行性病害，主要由氣傳性病原菌夏孢子隨氣流進行傳播[1]，其發(fā)生范圍廣，為害嚴重，大流行年份可造成小麥絕收[2]。對于氣傳性病害，監(jiān)測空氣中的病原菌孢子動態(tài)對病害的及時防控至關重要。胡同樂等[3]通過對生長季蘋果園空氣中蘋果斑點落葉病菌分生孢子捕捉發(fā)現(xiàn)，6-7月份為整個生長季中孢子飛散的高峰期。傅俊范等[4]對稻曲病病菌分生孢子監(jiān)測始見于7月下旬，飛散期為7-9月。利用孢子捕捉儀捕捉空氣中病原菌孢子的方法也在黃瓜霜霉病、番茄灰霉病及小麥白粉病等禾本科作物及蔬果病害研究中得到廣泛應用[5-7]。對小麥條銹病的流行預測，谷醫(yī)林等[8]只在2013-2015年3-6月運用孢子捕捉儀對甘谷縣小麥條銹菌進行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)空氣中夏孢子的峰值出現(xiàn)在5-6月，但未對整個周年的夏孢子變化情況進行研究。同時，任何病原菌的發(fā)生程度及流行范圍都需要適宜的環(huán)境條件。宋晶晶等[9]發(fā)現(xiàn)，空氣中小麥白粉菌的孢子量與溫度、相對濕度呈負相關，與降雨量呈正相關。谷醫(yī)林等[8]發(fā)現(xiàn)，小麥條銹菌夏孢子密度與溫度呈正相關，而與相對濕度呈負相關。

隴南小麥條銹病流行區(qū)，包括天水地區(qū)渭河流域、嘉陵江上游徽成盆地與四川接壤的白龍江流域，是中國小麥條銹菌的主要越夏地之一，能夠向我國東部麥區(qū)傳播菌源，具有至關重要的戰(zhàn)略地位[1]。因此，本研究通過監(jiān)測隴南小麥條銹菌夏孢子周年動態(tài)，并結合田間溫度、相對濕度及降雨分析影響該地區(qū)2018年3月-2019年3月的夏孢子循環(huán)規(guī)律的關鍵因子，以期為當?shù)匦←溕a(chǎn)制定有效的防治策略，減少隴南夏孢子向東部大部分麥區(qū)的傳播。

1 材料與方法

1.1 田間樣本采集

2018年3月-2019年3月，在甘肅省天水市秦州區(qū)監(jiān)測點(34.2° N，105.4° E，海拔1 710 m)放置Burkard孢子捕捉儀(英國Burkard Manufacturing有限公司)，通過進氣口抽取空氣樣本，自動將樣本儲存至1.5 mL離心管中(進氣量為16.5 L·min-1)，每周更換一次離心管。樣本于-80 ℃中保存，待提取DNA。

1.2 條銹菌夏孢子測定

1.2.1 模擬樣本及DNA的提取

1.2.2 TaqMan RT-qPCR供試引物及體系優(yōu)化

根據(jù)小麥條銹菌延伸因子EF1的擴增長度來設計引物和特異性探針(表1)。以小麥條銹菌和常見病原菌葉銹菌、稈銹菌、赤霉菌和白粉菌的DNA為模板，按下述條件進行TaqMan RT-qPCR(TaqMan Real-Time quantitative Polymerase Chain Reaction)，驗證引物的特異性。TaqMan RT-qPCR體系為：Taqman Environment Master Mix 2.0 (美國Life techonologies有限責任公司) 10 μL，探針和引物(上海英俊生物技術有限公司)各0.5 μL(250 nM)，DNA模板5.9 μL，補ddH2O至20 μL。反應程序為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共40個循環(huán)。在Light Cycler 480實時熒光定量PCR儀(瑞士羅氏診斷有限公司)上進行。

1.2.3 TaqMan RT-qPCR重復性評價及標準曲線的建立

分別取上述5×105～5×100個· μL-1梯度模擬樣本的DNA模板，同時以Nuclease free water為陰性對照，按上述反應體系和程序進行TaqMan RT-qPCR。每個稀釋度重復3次，計算變異系數(shù)，評價重復性。根據(jù)5×105～5×100個· μL-16個梯度的夏孢子濃度對數(shù)(x)和對應的Ct(cycle threshold)值(y)繪制標準曲線。

表1 TaqMan RT-qPCR設計的特異性引物和探針Table 1 Specific primers and probes designed by TaqMan RT-qPCR

1.3 氣象數(shù)據(jù)獲取及相關性分析

計算全自動小型氣象監(jiān)測儀(西安黃氏生物工程有限公司)記錄的相應采樣時間段的日平均溫度、日平均相對濕度和累積降雨量。采用Pearson相關分析法分析氣象因素與田間捕捉的夏孢子濃度相關性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016繪制TaqMan RT-qPCR標準曲線；采用SAS計算標準差和變異系數(shù)；運用SPSS軟件的Pearson分析法進行相關性分析；使用Light Cycler 480實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)自帶軟件生成擴增曲線。

2 結果與分析

2.1 TaqMan RT-qPCR引物及體系評價

提取小麥葉銹菌、稈銹菌、赤霉菌、白粉菌及條銹菌的DNA，用TaqMan RT-qPCR方法檢測引物特異性，結果顯示，所有反應中僅有小麥條銹菌在14～35個循環(huán)時檢測到熒光擴增曲線，而葉銹菌、稈銹菌、赤霉菌、白粉菌及水對照在循環(huán)數(shù)40時都未檢測到熒光擴增曲線。結果表明，所建立的條銹菌TaqMan RT-qPCR檢測方法具有特異性(圖1)。

將濃度為5×105～5×100個· μL-1的夏孢子模擬樣品在同一條件下進行TaqMan RT-qPCR，每個濃度重復3次，Ct值的平均值分別為20.40、23.30、26.81、29.21、31.44和34.84；變異系數(shù)依次為0.52%、0.33%、0.11%、0.37%、 0.50%和0.28%，均小于1%(表 2)，說明該檢測方法具有良好的重復性。

2.2 標準曲線

運用TaqMan RT-qPCR方法對濃度為5×105～5×100個· μL-16個梯度夏孢子模擬樣品進行定量，以不同梯度的夏孢子濃度對數(shù)為橫坐標，對應的Ct值為縱坐標繪制標準曲線(圖 2)。標準曲線方程為y=-2.830 6x+37.572，決定系數(shù)(R2)為0.995 8。Ct平均值范圍為20.40～34.84，最低可檢測到5個夏孢子。

2.3 田間捕捉的夏孢子濃度變化動態(tài)

從隴南空氣中小麥條銹菌夏孢子的周年動態(tài)監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)，隨著時間的推移，夏孢子在4月11日、5月16日和6月6日出現(xiàn)了3個數(shù)量高峰，其中4月11日孢子密度達到最大值，為145 個·m-3(圖3)。但在小麥收割(7月初)后至10月底，空氣中只能檢測到零星的夏孢子。11月初到翌年2月末，沒有捕捉到夏孢子。翌年3月，隨著氣溫的回升，在3月6日初次檢測到少量夏孢子，之后夏孢子數(shù)量呈明顯增加趨勢，3月13日達45個·m-3。

圖1 小麥條銹菌特異性引物TaqMan RT-qPCR擴增曲線

表2 夏孢子濃度梯度的TaqMan RT-qPCR結果及重復性分析Table 2 Repeatability analysis of TaqMan RT-qPCR at different urediniospores concentration

圖2 小麥條銹病夏孢子數(shù)量與Ct值之間的關系

2.4 氣象因素對空氣中夏孢子密度的影響

相關性分析表明，隴南空氣中冬小麥銹菌夏孢子密度與空氣相對濕度呈極顯著負相關 (r=-0.449，P=0.009)，且夏孢子的密度高峰值集中在空氣相對濕度50%～80%范圍內(圖4)，而夏孢子密度與平均溫度和累積降雨量無顯著相關性(r分別為-0.003和0.107，P值分別為0.494和0.298)，說明相對濕度對條銹菌夏孢子的擴散影響較大。降雨減少會降低空氣中的夏孢子數(shù)量，如4月11日前的累積降雨量為23.0 mm，5月16日的累積降雨量為12.6 mm，夏孢子密度從145個·m-3減少到13個·m-3；降雨量過大時，空氣中的夏孢子數(shù)量會隨雨水沖刷而減少，如6月下旬到7月上旬，出現(xiàn)2次暴雨，捕捉到的夏孢子數(shù)明顯減少。12月至翌年2月，沒有捕捉到夏孢子(圖4)。

圖3 2018年隴南小麥條銹菌夏孢子動態(tài)變化規(guī)律

圖4 氣象因子對條銹菌夏孢子濃度的影響

3 討 論

隴南地區(qū)是我國條銹病的“常發(fā)易變區(qū)”，明確隴南地區(qū)條銹菌夏孢子的周年流行動態(tài)，對病害的防控有一定的指導作用?？茖W有效的預測田間小麥條銹病的流行動態(tài)，需要以準確的初始菌源量為前提。已有利用孢子捕捉儀與實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)方法監(jiān)測病原菌數(shù)量動態(tài)變化來預測田間病害發(fā)生情況的報道，如桃褐腐病、大豆銹病、甜菜霜霉病、菠菜霜霉病、小麥赤霉病等[10-14]。李勇等[15]開發(fā)了TaqMan RT-qPCR檢測小麥條銹病菌的方法，檢測靈敏度達10個夏孢子。本研究應用TaqMan RT-qPCR方法建立了小麥條銹菌夏孢子數(shù)量與Ct值之間的關系，檢測靈敏度為5個夏孢子。

隴南地區(qū)有復雜的自然環(huán)境和生態(tài)條件，且小麥在800～2 400 m高度范圍呈垂直分布，條銹菌在該區(qū)既能越夏、又能越冬，可就地完成周年循環(huán)，有利于菌源積累[16]。本研究對隴南小麥條銹菌夏孢子進行周年監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)11月至翌年2月未檢測到條銹菌夏孢子，推測是因為該地區(qū)周圍的冬小麥種植時間為9月26日，較往年播期晚10天；天水市植保站工作人員在11月13日調查15塊田地(約20畝)秋苗發(fā)病情況時，僅有2塊麥田各有1片病葉，發(fā)病程度為近幾年最輕；2018年12月至翌年2月雨雪少，積雪覆蓋時間短。賈明貴等[17]研究結果表明，1989年在天水地區(qū)降雪遲，雨雪少(16.5 mm)，在高山區(qū)(海拔為1 700 m以上)未發(fā)現(xiàn)有條銹菌越冬。2019年3月6日初次捕捉到夏孢子，3月13日夏孢子數(shù)量明顯增加，推測夏孢子可能來源于1 300 m～1 600 m半山區(qū)越冬菌源基地向高山區(qū)擴展的夏孢子[16]，或隨東風或東南風自冬麥區(qū)傳向此地[18]。

病害的發(fā)生和流行不僅需要合適的寄主和病原，環(huán)境因素也發(fā)揮著關鍵性作用[19]。前人研究證明，春季降雨是影響小麥條銹病發(fā)生和流行的重要因素，對條銹菌夏孢子的擴散有潛在的促進作用，夏季降雨是限制越夏菌源的重要因素[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，降雨與孢子密度呈正相關。谷醫(yī)林[8]證明空氣中孢子密度與相對濕度呈負相關，且在濕度處于60%左右的水平時，孢子密度出現(xiàn)最大值。本研究中，2018年天水市秦州區(qū)監(jiān)測點的夏孢子密度高峰值集中在空氣相對濕度的50%～80%范圍內，且與相對濕度呈極顯著負 相關。

綜上所述，本研究基于孢子捕捉儀和TaqMan-qPCR定量方法，明確了隴南條銹菌夏孢子的周年變化規(guī)律，同時分析了溫度、相對濕度和降雨對隴南小麥條銹菌夏孢子動態(tài)的影響，為后期構建基于條銹菌夏孢子數(shù)量和氣象因子的預測模型奠定基礎，同時也為我國小麥條銹病的早期防治提供理論依據(jù)和參考價值。