康愷 李光輝 孫晨雨 效梅 安立龍 吳江

摘要?環(huán)境熱應(yīng)激是制約我國南方地區(qū)集約化家禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一個重要因素，持續(xù)高溫使蛋雞出現(xiàn)產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)下降等問題，高溫?zé)釕?yīng)激是蛋雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展不能忽視的重要問題。該試驗研究常溫對照組和高溫?zé)釕?yīng)激組成年蛋雞卵巢組織的差異mRNAs表達(dá)譜。60只26周齡成年蛋雞隨機(jī)分為常溫對照組和高溫?zé)釕?yīng)激組，30 d后2組分別隨機(jī)選用3只共6只采集卵巢組織制備HE染色組織切片并利用深度測序技術(shù)分析mRNAs差異表達(dá)譜。相比對照組，高溫組組織切片中卵泡的內(nèi)容物增多，著色加深，卵泡壁增厚。測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激處理后相比常溫對照組有146個mRNAs表達(dá)水平差異顯著（P<0.05），77個上調(diào)表達(dá)、69個下調(diào)表達(dá);對表達(dá)差異基因功能分析發(fā)現(xiàn)，其中顯著性差異（P<0.05）的調(diào)控通路有維生素B6代謝、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、檸檬酸代謝和細(xì)胞周期。以上研究結(jié)果為進(jìn)一步解析蛋雞卵巢熱應(yīng)激、提高蛋雞生產(chǎn)性能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?熱應(yīng)激;卵巢;差異mRNAs;蛋雞

中圖分類號?S831文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）20-0106-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.20.027

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Screening and Analysis of Differentially Expressed mRNAs in Ovarian Tissue of Laying Hens under High Temperature

KANG Kai，LI Guang?hui，SUN Chen?yu et al

（College of Agriculture，Guangdong Ocean University，Zhanjiang， Guangdong 524088）

Abstract?The heat stress caused by continuous high temperature weather has become an important restricting factor in the poultry industry. So， in this study， the differential expression profile of mRNAs in ovarian tissue of laying hens were investigated in normal temperature group and high temperature group. 60 adult laying hens with 26 weeks old were randomly divided into two groups， fed a same diet for 30 days respectively.Then the ovarian tissue of 6 hens from the three groups （3 from one group randomly） was collected to prepare HE stained tissue sections and be analyzed differential expression profiles of mRNAs by deep sequencing. In the section of ovarian tissue， compared with the control group， the contents of follicles were increased， the color was deepened， and the follicular wall was thickened in the high temperature group. The statistical analysis of sequencing data found that there were 146 mRNAs with the significant difference expression level （P<0.05） in high temperature group compared with the normal control group; the function analysis of difference expressed mRNAs found that the regulation pathways related to the heat stress were vitamin B6 metabolism， oocyte meiosis， citrate cycle and cell cycle.This research provided a foundation for further analyzing ovarian heat stress and improving performance of laying hens.

Key words?Heat stress;Ovary;Differentially expressed mRNAs;Laying hens

環(huán)境熱應(yīng)激是我國南方地區(qū)蛋雞集約化飼養(yǎng)面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，每年的高溫梅雨季節(jié)都影響蛋雞群的產(chǎn)蛋率，夏季高溫氣候更是對全國的商品蛋產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響[1]。持續(xù)高溫使蛋雞出現(xiàn)采食量、產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)下降等問題，嚴(yán)重時可引起蛋雞死亡[2]，因此高溫?zé)釕?yīng)激是蛋雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展不能忽視的重要問題。

熱應(yīng)激可改變卵泡動力學(xué)和顆粒細(xì)胞功能，可能導(dǎo)致動物在夏季的生殖效率下降。熱應(yīng)激卵巢的TUNEL陽性顆粒細(xì)胞與HSP70、Bim和cleaved Caspase-3蛋白顯著升高同時存在，而閉鎖卵泡和顆粒細(xì)胞凋亡數(shù)量增加，這可能是熱應(yīng)激動物生育力下降的常見原因[3]。熱應(yīng)激也可抑制卵泡發(fā)育，通過凋亡影響卵泡的發(fā)育和分化[4]。研究表明日循環(huán)高溫顯著抑制蛋雞卵泡發(fā)育，表現(xiàn)為產(chǎn)蛋數(shù)量下降、卵巢重量降低、大卵泡數(shù)量減少，而提高培養(yǎng)溫度可顯著增加顆粒細(xì)胞中活性氧（ROS）的產(chǎn)生量，同時抑制顆粒細(xì)胞的增殖活性[5]，但熱應(yīng)激損傷機(jī)制及其調(diào)控基因仍需進(jìn)一步研究。

該研究利用人工控制環(huán)境模擬蛋雞飼養(yǎng)熱應(yīng)激條件，控制環(huán)境溫濕度，連續(xù)飼養(yǎng)30 d后采集蛋雞卵巢組織，利用二代深度測序技術(shù)分析組織差異mRNAs表達(dá)譜，以期為深入闡述熱應(yīng)激造成蛋雞卵巢組織損傷的機(jī)制和候選調(diào)控基因奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試驗動物

羅曼粉殼蛋雞雞苗購于廣東喜迎珍禽有限公司，飼養(yǎng)于廣東海洋大學(xué)動物醫(yī)院動物房。蛋雞育成及飼養(yǎng)管理參照 Lohmann Tierzucht GmbH 手冊（https：//www.ltz.de/en/downloads/management?guides.）。姜黃素購于西安金綠生物工程技術(shù)有限公司，純度>97%（批號：BW2017010A）。

1.2?儀器和試劑

低溫高速離心機(jī)（Sigma）、普通離心機(jī)（Sigma）、電子分析天平（Shimadzu）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（廣州吉迪）、IX53型倒置顯微鏡（Olympus）、切片機(jī)（Leica）、電動研磨棒（TianGen）。多聚甲醛、乙醇、異丙醇、氯仿等試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3?試驗動物分組與樣品采集

挑選產(chǎn)蛋率、體重相近的26周齡蛋雞60只，隨機(jī)分為2組，對照組（CK）和熱應(yīng)激組（HC）各30只，采用三層階梯式籠養(yǎng)，每籠2只?？刂瞥貙φ战M溫度為（25±1）℃，濕度65%～75%;高溫組每天10：00—16：00控制溫度為（32±1）℃，其余時間溫度與常溫對照組相同。對照組和高溫組飼喂實(shí)驗室通用基礎(chǔ)日糧[6]，定時投料，自由采食和飲水，每天18：00清糞，光照時間為16 h/d，光照強(qiáng)度為10～15 lx，定期免疫。

連續(xù)飼養(yǎng)30 d，每天18：30收集當(dāng)天產(chǎn)雞蛋，分別計算2組蛋雞的平均產(chǎn)蛋率，30 d后2組分別隨機(jī)選用蛋雞3只，共6只，取卵巢組織于2 mL RNase-free離心管中置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4?組織切片HE染色

取樣品切成大小約為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小組織塊放于4%PFA（多聚甲醛）固定液中固定（固定液的體積為組織塊的15～20倍），固定24 h;再經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（5 μm）、展片、烘干、水洗、HE染色，最后用中性樹膠封片，貼上標(biāo)簽并編號，顯微鏡下觀察并拍照。

1.5?樣品測序及數(shù)據(jù)分析

樣品送杭州聯(lián)川生物有限公司測序分析，采用去除rRNA的建庫方式進(jìn)行測序分析，檢測各樣品中不同mRNAs的表達(dá)水平。首先利用Cutadapt[7]軟件剔除測序數(shù)據(jù)中的測序載體、低質(zhì)量和不能識別的堿基信號等干擾信息，獲得可進(jìn)一步分析的高質(zhì)量原始測序數(shù)據(jù)。再用Bowtie2[8]和TopHat2[9]將測序數(shù)據(jù)與雞的基因組序列信息比對后裝配出樣品的轉(zhuǎn)錄組序列信息數(shù)據(jù)，最后利用StringTie[10]和Ballgown[11]軟件計算所有mRNAs的表達(dá)水平。

差異mRNAs表達(dá)的數(shù)據(jù)篩選，首先利用StringTie[10]軟件計算各mRNAs的FPKM值，再利用R軟件包Ballgown[11]篩選差異mRNAs，篩選條件為log2（fold change）>1或者log2（fold change）<-1并且統(tǒng)計學(xué)差異顯著（P<0.05）。

2?結(jié)果與分析

2.1?高溫飼養(yǎng)條件對蛋雞產(chǎn)蛋率和卵巢組織結(jié)構(gòu)的影響

連續(xù)飼養(yǎng)30 d，每天收集當(dāng)天產(chǎn)雞蛋，分別計算2組蛋雞的平均產(chǎn)蛋率，對照組平均產(chǎn)蛋率為88.91%，高溫組平均產(chǎn)蛋率為81.34%，2組數(shù)據(jù)比較差異顯著（P<0.05），高溫飼養(yǎng)條件下蛋雞產(chǎn)蛋率顯著下降。

采集對照組和高溫組蛋雞卵巢組織，制備石蠟切片進(jìn)行HE染色后光學(xué)顯微鏡觀察。在對照組卵巢切片中，卵泡內(nèi)容物著色淺（圖1A）;而在高溫組卵巢切片中，卵泡內(nèi)容物著色點(diǎn)增多、著色加深，卵泡壁增厚明顯，同樣處理程序制備的切片中高溫組的中小卵泡多呈不規(guī)則環(huán)形（圖1B）。高溫飼養(yǎng)條件下蛋雞卵巢中卵泡組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常。

2.2?mRNAs差異表達(dá)譜分析

由mRNAs在2組樣品中的差異表達(dá)分析可知，在高溫應(yīng)激組中表達(dá)差異顯著（P<0.05）的基因數(shù)目分別是77個上調(diào)表達(dá)、69個下調(diào)表達(dá)。對差異表達(dá)的mRNAs表達(dá)量分析，上調(diào)和下調(diào)的前20個基因如表1、2所示。

2.3?差異表達(dá)mRNAs基因功能注釋與分析

對差異表達(dá)mRNAs進(jìn)行功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，在GO數(shù)據(jù)庫中可以極顯著（P<0.01）富集的功能群，分子功能群（molecular_function，MF）有8個，生物學(xué)過程群（biological_process，BP）有16個，細(xì)胞組分群（cellular_component，CC）有4個，相關(guān)的差異表達(dá)mRNAs有63個（表3）。

在KEGG數(shù)據(jù)庫中可以富集（P<0.05）的通路（表4）有維生素B6代謝、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、檸檬酸代謝（三羧酸循環(huán)）和細(xì)胞周期（編號分別是ko00750、ko04114、ko00020和ko04110），相關(guān)的差異表達(dá)mRNAs有11個。

3?討論

3.1?高溫飼養(yǎng)條件影響蛋雞的產(chǎn)蛋率和卵巢組織結(jié)構(gòu)

全球變暖是一種主要的壓力環(huán)境狀況，體溫升高到生理恒溫點(diǎn)以上（熱應(yīng)激），從而影響動物的繁殖效率，熱應(yīng)激對生殖功能的損傷涉及受精過程以及胚胎到胎兒發(fā)育的早晚期等階段，這種情況對牲畜造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[12]。試驗中可見高溫飼養(yǎng)條件下蛋雞產(chǎn)蛋率顯著下降。由于家禽具有羽毛豐厚、皮膚無汗腺、代謝旺盛、體溫高等特點(diǎn)，其生產(chǎn)性能極易受到環(huán)境溫度的影響，高溫一直是影響家禽養(yǎng)殖的一個重要因素[13]。在高溫組卵巢切片中可見卵泡內(nèi)容物著色點(diǎn)增多，著色加深，卵泡壁增厚明顯，同樣處理程序制備的切片中高溫組的中小卵泡多呈不規(guī)則環(huán)形。高溫飼養(yǎng)條件下蛋

雞卵巢中卵泡組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，可見在高溫應(yīng)激組中，原始卵泡的比例下降，這提示在熱應(yīng)激條件下飼養(yǎng)蛋雞，影響卵巢功能，抑制卵泡發(fā)育。熱應(yīng)激影響蛋雞的生長速度、產(chǎn)蛋量和生育力，環(huán)境溫度過高是影響熱帶和亞熱帶國家家禽生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)和生物效率的一個嚴(yán)重問題，隨著全球氣候變化，這一問題預(yù)計將變得更加突出，這些負(fù)面影響造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[14]。

3.2?高溫飼養(yǎng)條件下蛋雞卵巢組織差異mRNAs的通路分析

差異mRNAs在KEGG數(shù)據(jù)庫中可以富集（P<0.05）的通路有維生素B6代謝、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、檸檬酸代謝（三羧酸循環(huán)）和細(xì)胞周期。以上4個通路與卵子發(fā)生、卵泡發(fā)育均有密切關(guān)系。

減數(shù)分裂過程需要與周期蛋白依賴激酶（CDKs）相關(guān)的特定周期蛋白參與，以確保DNA復(fù)制的保真度，不同細(xì)胞周期蛋白在減數(shù)分裂中具有不同的特異性調(diào)控[15]。在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂周期的不同階段，有幾種直接或間接誘導(dǎo)凋亡的分子[16]。熱應(yīng)激破壞牛卵母細(xì)胞的縫隙連接和卵丘功能，卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間以及卵母細(xì)胞之間的密切聯(lián)系對卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的停止和恢復(fù)起著重要的調(diào)節(jié)作用，熱應(yīng)激影響卵丘細(xì)胞通訊和功能，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的進(jìn)程[17]。卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊對正常卵泡分化和卵母細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要，卵母細(xì)胞調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞內(nèi)糖酵解和TCA循環(huán)的方式與顆粒細(xì)胞的數(shù)量和卵母細(xì)胞的生長發(fā)育階段有關(guān)，卵母細(xì)胞通過調(diào)節(jié)編碼糖酵解酶的基因表達(dá)水平來控制顆粒細(xì)胞的糖酵解，卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的代謝協(xié)同性是顆粒細(xì)胞產(chǎn)生能量、卵母細(xì)胞與卵泡發(fā)育所必需的[18]。研究表明能量分子通過線粒體代謝產(chǎn)生足夠的ATP與卵母細(xì)胞質(zhì)量之間存在聯(lián)系，其中脂肪酸一旦進(jìn)入線粒體基質(zhì)就被分解成乙酰輔酶a分子，乙酰輔酶a分子通過TCA循環(huán)和電子傳遞鏈進(jìn)一步代謝產(chǎn)生ATP[19]。

母體B族維生素水平可影響生育和妊娠的建立，并可以直接影響卵泡和卵母細(xì)胞的發(fā)育，研究發(fā)現(xiàn)在卵泡刺激素（FSH）作用下限制成年母羊日糧中維生素B12的供應(yīng)影響卵泡的發(fā)育[20]。吡啶是維生素B6的催化活性形式，在多種細(xì)胞過程中起著至關(guān)重要的作用，吡哆醇提高了囊胚率和孵化率，體外受精過程中，吡哆醇通過增加胚胎總細(xì)胞數(shù)、降低CTSB mRNA表達(dá)和凋亡率，也顯著提高了胚胎的質(zhì)量，可見體外受精過程中添加吡啶是提高牛卵母細(xì)胞發(fā)育能力和胚胎質(zhì)量的有效手段[21]。

可見，熱應(yīng)激有多種可能的作用機(jī)制，通過影響以上4種通路進(jìn)而造成蛋雞卵巢損傷、降低產(chǎn)蛋率。

4?結(jié)論

熱應(yīng)激造成蛋雞卵巢損傷，常溫組和高溫組蛋雞卵巢組織mRNAs表達(dá)譜組間差異表達(dá)的共有146個，差異mRNAs基因功能分析與熱應(yīng)激過程密切相關(guān)的調(diào)控通路有維生素B6代謝、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、檸檬酸代謝（三羧酸循環(huán)）和細(xì)胞周期共4個。該研究篩選的一批候選基因為進(jìn)一步解析蛋雞卵巢熱應(yīng)激的損傷機(jī)制提供了重要參考。

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