薛楠楠 顏艷 汪超峰

(1南通市第二人民醫(yī)院超聲科，江蘇 南通 226002；2寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院腎內(nèi)科)

隨著體檢的普及和超聲診斷技術(shù)的進步，甲狀腺結(jié)節(jié)的早期檢出率明顯增加，有0.5%～5.0%最終確診為惡性，病理類型以微小乳頭狀癌為主，手術(shù)切除是主要治療方案，5年總生存率高達80%～95%，預(yù)后較好，但仍有0.3%～3.0%患者早期或術(shù)后出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移〔1〕。據(jù)數(shù)據(jù)顯示〔2〕，60歲以上是甲狀腺癌的高發(fā)階段，老年患者缺乏體檢意識，早期發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)而不愿意隨訪，延誤治療發(fā)展至惡性的可能性更大。細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)(FNAC)檢查可進一步判斷腫瘤的病理類型，與手術(shù)切除病理有較好的吻合率〔3〕，缺點是結(jié)節(jié)越小，穿刺陽性率和病理陽性率可能越差。根據(jù)Bethesda細(xì)胞學(xué)診斷可分為Ⅰ～Ⅵ類，其中Ⅲ級為意義不明確的細(xì)胞非典型病變或濾泡性病變，介于良性與惡性之間，總體檢查率2%～28%，經(jīng)最終手術(shù)切除病理證實為惡性率6.0%～42.1%〔4〕，如果早期不能正確判斷其良惡性，將影響臨床隨訪或早期積極手術(shù)的選擇，也可能影響臨床轉(zhuǎn)歸。超聲造影(CEUS)通過增強組織間對比性，反映結(jié)節(jié)內(nèi)細(xì)胞的代謝能力，結(jié)合自帶定量評估軟件測量結(jié)節(jié)峰值強度(PI)客觀評估細(xì)胞內(nèi)微血管的血流灌注情況，有效彌補了常規(guī)彩色多普勒對微血管的顯示不足〔5〕。Galectin-3屬于半乳糖凝聚素家族成員，主要發(fā)揮細(xì)胞間黏附、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移及細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡方向等生物學(xué)功能〔6〕，在多種惡性腫瘤，如乳腺癌、結(jié)腸癌中表達升高與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有密不可分的聯(lián)系〔7〕。部分研究指出〔8,9〕，Galectin-3表達陽性在甲狀腺惡性結(jié)節(jié)中檢查率較高，與腫瘤TNM分期、病理類型和分化級別有較大的聯(lián)系?；诖?，本研究旨在探討FNAC檢查證實為Bethesda Ⅲ類甲狀腺結(jié)節(jié)采用CEUS和組織Galectin-3分子表達鑒別結(jié)節(jié)良惡性質(zhì)的應(yīng)用價值。

1 對象與方法

1.1對象資料 選擇2016年12月至2017年12月入南通市第二人民院行FNAC檢查診斷為Bethesda Ⅲ類甲狀腺結(jié)節(jié)的老年患者共110例(140個結(jié)節(jié))，納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡60～80歲；②至少存在1個可測量直徑的結(jié)節(jié)；③均采用手術(shù)切除獲得病理診斷；④完成結(jié)節(jié)Galectin-3分子檢測和CEUS檢查；⑤取得知情同意，臨床資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：①頸部手術(shù)、外傷史；②超聲圖像顯示不清；③術(shù)前采用131I或其他生物治療。110例患者中男52例，女58例，年齡62～78〔平均(66.8±6.2)〕歲，結(jié)節(jié)個數(shù)1～3〔平均(1.5±0.4)〕個，最大直徑3.5～39.5〔平均(20.5±7.8)〕mm。

1.2研究方法 經(jīng)手術(shù)切除病理確診良性結(jié)節(jié)100個(患者80例)，惡性結(jié)節(jié)40個(患者30例)；所有結(jié)節(jié)同時進行組織Galectin-3分子免疫組化染色和CEUS檢查。術(shù)前采用TI-RADS進行分級，共分5級，1～3級為良性，4～5級為惡性；CEUS分析增強模式、定量評估軟件測量結(jié)節(jié)PI值；FNAC檢查診斷結(jié)節(jié)細(xì)胞學(xué)分類，進行組織Galectin-3分子免疫組化染色，Bethesda細(xì)胞學(xué)診斷分為Ⅰ～Ⅵ級，Ⅰ級為標(biāo)本不滿意，Ⅱ級為良性病變，Ⅲ級為意義不明確的細(xì)胞非典型性病變或濾泡性病變，Ⅳ級為濾泡性腫瘤；Ⅴ級為可疑惡性腫瘤，Ⅵ級為惡性腫瘤。

1.3CEUS檢查 釆用日立HITACHI HIVISION VISION Preirus(大二郎神)Eup-L74M彩色超聲診斷儀和高頻線陣探頭，頻率為6～13 MHz，造影機械指數(shù)0.06～0.08；聚焦點位于甲狀腺結(jié)節(jié)的下緣，提高圖像質(zhì)量，增益調(diào)至僅顯示甲狀腺被膜，固定參數(shù)不變，釆用雙幅對比模式。進入造影模式，縱切清晰顯示結(jié)節(jié)及周圍甲狀腺組織，采用Bracco Sono Vue造影劑混勻后經(jīng)肘靜脈快速團注，醫(yī)生同步按下計時鍵及動態(tài)存儲鍵，連續(xù)動態(tài)觀察2 min；第1次注射造影劑后點擊Flash爆破微泡，10 min后開始第二次操作。用QLAB定量分析軟件進行脫機分析，手動勾畫感興趣區(qū)甲狀腺結(jié)節(jié)及周圍組織，獲得峰值強度(PI)擬合曲線參數(shù)。

1.4組織Galectin-3免疫組化染色的主要步驟 常規(guī)制作組織切片，厚度5 μm，經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)后，滴加大鼠抗人Galectin-3一抗(江蘇碧云天科技有限公司，工作濃度1∶2 000)，置于濕盒內(nèi) 4℃孵育過夜，以正常大鼠IgG代替一抗作為陰性對照；洗滌后滴加羊抗大鼠二抗(江蘇碧云天科技有限公司，工作濃度1∶500)，置于濕盒中27℃孵育 20 min；洗滌后滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(江蘇碧云天科技有限公司)，置于濕盒中27℃孵育 20 min，洗滌、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、封片、觀察。結(jié)果采用半定量法，依據(jù)染色強度和染色細(xì)胞所占比率；以胞質(zhì)或胞核黃染至深棕色為陽性，染色強度中無陽性染色為0分，弱染色為1分，中等強度染色為2分，強染色為3分；陽性細(xì)胞數(shù)比率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；兩項乘積0～3分為陰性，4～12分為陽性。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 以SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行t及χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1結(jié)節(jié)惡性組與良性組患者基本資料比較 惡性組與良性組患者的性別、年齡、結(jié)節(jié)TI-RADS分級、結(jié)節(jié)最大直徑比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2兩組結(jié)節(jié)Galectin-3表達和CEUS檢查的比較 惡性組結(jié)節(jié)Galectin-3表達陽性率顯著高于良性組(P<0.05)，CEUS增強模式以早期低增強為主，結(jié)節(jié)PI值顯著低于良性組(P<0.05)。見表2。

2.3結(jié)節(jié)Galectin-3表達與患者臨床資料的關(guān)系 結(jié)節(jié)Galectin-3陽性表達與患者性別、年齡、結(jié)節(jié)最大直徑大小無關(guān)(P>0.05)。見表3。

表1 結(jié)節(jié)惡性組與良性組患者的基本資料比較

表2 兩組結(jié)節(jié)Galectin-3表達和CEUS檢查的比較〔n(%)〕

表3 結(jié)節(jié)Galectin-3表達與患者臨床資料的關(guān)系〔n(%)〕

3 討 論

超聲或CT引導(dǎo)FNAC檢查進行細(xì)胞學(xué)診斷已成為手術(shù)病理的重要輔助方法，具有穿刺成功率高、適應(yīng)范圍廣、結(jié)果可靠準(zhǔn)確性高的優(yōu)點〔10〕。FNAC檢查結(jié)果根據(jù)Bethesda細(xì)胞學(xué)診斷Ⅲ級介于良性與惡性之間，惡性率6%～42.1%，變化幅度較大，一旦漏診將影響手術(shù)機會和時機，延誤治療導(dǎo)致臨床預(yù)后不佳〔11〕。如果不進行下一步確診檢查，多數(shù)建議定期隨訪或復(fù)查FNAC檢查，導(dǎo)致漏診或誤診率增加，增加醫(yī)學(xué)過度檢查和患者痛苦〔12〕。因此，針對BethesdaⅢ類甲狀腺結(jié)節(jié)有必要確定良惡性，但是一味強調(diào)手術(shù)切除無疑增加良性結(jié)節(jié)的手術(shù)治療，不符合指南推薦，也增加了患者創(chuàng)傷〔13〕。

本研究結(jié)果提示，手術(shù)病理最終確診惡性結(jié)節(jié)40個，惡性率28.57%，TI-RADS分級對BethesdaⅢ類甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性可能無法做出準(zhǔn)確判斷。此類結(jié)節(jié)因缺乏典型的形態(tài)學(xué)改變而不能被二維超聲診斷〔14〕，但CEUS檢查通過增強組織間對比性，反映結(jié)節(jié)內(nèi)細(xì)胞的代謝能力，結(jié)合自帶定量評估軟件測量結(jié)節(jié)PI客觀評估細(xì)胞內(nèi)微血管的血流灌注情況，有效彌補了常規(guī)彩色多普勒對微血管的顯示不足。實時CEUS檢查檢出甲狀腺微小結(jié)節(jié)惡性陽性率與手術(shù)結(jié)果符合率達93.33%，主要征象有結(jié)節(jié)呈極低回聲，邊界模糊，無包膜，形態(tài)多樣化，不規(guī)則，砂礫樣鈣化，后方回聲較弱，部分結(jié)節(jié)內(nèi)血流差；不均勻增強，正常甲狀腺組織低增強；有助于鑒別惡性結(jié)節(jié)〔15，16〕。本研究結(jié)果也提示，惡性組結(jié)節(jié)CEUS檢查增強模式以早期低增強為主，結(jié)節(jié)PI值低于良性組。

此外，本研究中惡性組結(jié)節(jié)Galectin-3表達陽性率顯著高于良性組，Galectin-3與細(xì)胞間黏附、惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡等行為密切相關(guān)，在乳腺癌、結(jié)腸癌中表達升高與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有直接聯(lián)系。有學(xué)者指出，Galectin-3表達陽性在甲狀腺惡性結(jié)節(jié)中檢查率較高，與腫瘤TNM分期、病理類型和分化級別有較大的聯(lián)系〔16〕。研究發(fā)現(xiàn)〔17〕，Galectin-3可與β-半乳糖特異性結(jié)合，在惡性腫瘤患者體內(nèi)濃度是健康者30多倍，發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者濃度遠高于原位腫瘤。Galectin-3可促進腫瘤細(xì)胞的惡性增殖，表達腫瘤干細(xì)胞特性，與Wnt/β-catenin信號通路激活密切相關(guān)〔18〕。Galectin-3可抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，誘導(dǎo)抗凋亡基因Bcl-2表達，可能與抑制了MAPK信號通路活性有關(guān)〔19〕。Galectin-3可誘導(dǎo)上皮性和腺體性腫瘤發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，如甲狀腺結(jié)節(jié)〔20〕。Galectin-3還可以刺激表達多種細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)〔21〕和炎癥因子如IL-6〔22〕共同參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。陸偉輝等〔23〕指出，甲狀腺微小乳頭狀癌組織中Galectin-3高表達與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

綜上所述，CEUS聯(lián)合結(jié)節(jié)Galectin-3分子表達檢測能夠為FNAC檢查診斷老年Bethesda Ⅲ類甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性質(zhì)提供更加豐富的生物學(xué)信息，其中CEUS檢查增強模式以早期低增強為主，Galectin-3陽性表達有助于結(jié)節(jié)惡性的判斷。