汪楷庭，周榆淞，黃上真，蔣 堯，付 璐，孟慶利，馬小軍，丁向東*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，國家畜禽工程實驗室，北京 100193；2.北京中育種豬有限責(zé)任公司，北京 102200）

豬肉是世界第一大肉類消費品，中國是全世界生豬生產(chǎn)量及消費量最大的國家。當(dāng)前我國生豬生產(chǎn)中飼料成本占總成本的60% 以上[1]，豬對飼料的利用情況與生產(chǎn)者的經(jīng)濟效益密不可分。當(dāng)前飼料價格不斷上漲，飼料原料資源日趨緊張，通過提高豬的飼料報酬對降低成本十分重要，同時可減少我國的飼料用糧，緩解人畜爭地、爭糧的困境。飼料報酬評定經(jīng)歷了2 個發(fā)展階段：20 世紀后期常用飼料轉(zhuǎn)化率（Feed Conversion Ratio，F(xiàn)CR）、平均日增重（Average Daily Gain，ADG）、平均日采食量（Average Daily Feed Intake，ADFI）等作為衡量飼料報酬性狀的指標，2000 年以后因電子飼喂設(shè)備的更新和采食量測定技術(shù)的發(fā)展，1963 年Koch 等[2]提出的剩余采食量（Residual Feed Intake，RFI）指標逐漸被廣泛采用。多項研究表明飼料報酬性狀具有遺傳性，大白豬和杜洛克豬的FCR 的遺傳力為0.15～0.41，而RFI 的遺傳力為0.14～0.38[3]。遺傳學(xué)家和育種工作者逐步發(fā)現(xiàn)了與飼料報酬有關(guān)的基因，如黑素皮質(zhì)素受體4[4]、瘦素基因[5]、增食欲素基因[6]、脂肪和肥胖相關(guān)基因[7]等。

PLA2G4A（PhospholipaseA2，Group IVA）又 叫cPLA2、PLA2G4、cPLA2-alpha，屬于胞漿型的磷脂酶A2，是由至少10 組亞型組成的一族膜磷脂選擇性水解酶，是磷脂生成花生四烯酸的關(guān)鍵酶。近年來，作為介導(dǎo)花生四烯酸生成的關(guān)鍵酶基因PLA2G4A，因其在生長性狀方面的重要表現(xiàn)和在早期脂肪細胞分化和肥胖中發(fā)揮重要作用而得到較多學(xué)者關(guān)注。Qiu 等[8]在研究黃姑魚的遺傳連鎖圖譜時，發(fā)現(xiàn)PLA2G4A是生長相關(guān)QTL 區(qū)域的重要生長基因。Harris 等[9]在對獼猴抗肥胖研究中，發(fā)現(xiàn)磷脂酶A2（PLA2G4A）與體重的持續(xù)穩(wěn)定和胰島素敏感性顯著相關(guān)。Hartiala 等[10]在研究PLA2G4A 與心機梗死的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，PLA2G4A 通過飲食中攝入的脂肪酸來影響疾病發(fā)生。Vogel 等[11]在研究肥胖相關(guān)基因時發(fā)現(xiàn)，磷脂酶PLA2G4A 在肥胖受試者的脂肪組織中高表達。鑒于PLA2G4A 在生長性狀方面的重要表現(xiàn)，本實驗小組前期使用豬80K SNP 芯片進行的全基因組關(guān)聯(lián)分析（未發(fā)表），發(fā)現(xiàn)豬PLA2G4A基因與飼料報酬性狀存在相關(guān)，為此本研究選擇豬PLA2G4A基因作為豬飼料報酬性狀的候選基因進行深入分析。

本實驗以166 頭來自北京中育種豬有限責(zé)任公司的大白豬作為實驗材料，通過PCR 擴增PLA2G4A的部分片段，并且使用雙脫氧核苷酸對目的片段進行測序和分子生物學(xué)軟件進行序列比對的方法尋找SNPs，最后分析其與飼料報酬性狀的關(guān)系，旨在為豬飼料報酬性狀的遺傳改良工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本實驗以2016 年出生于北京中育種豬有限責(zé)任公司的166 頭大白豬為材料?；蚪M提取所采用材料均為豬耳組織，耳組織樣保存于70% 乙醇中，-20℃凍存。飼料報酬性狀為ADFI、FCR、RFI、ADG，由奧斯本自動飼喂系統(tǒng)110 kg 左右結(jié)束測定后處理獲得。

1.2 方法

1.2.1 豬基因組DNA 的提取及質(zhì)量檢測 豬基因組DNA 通過血液/組織/細胞基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）進行提取，由北京天根生物科技公司提供試劑盒。根據(jù)核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵，能夠吸收紫外光的原理，用紫外分光光度計分別測定OD260nm、OD280nm值。用Nanodrop2000 儀器檢測。根據(jù)測定出的DNA 樣品濃度，取1～2 μL 基因組DNA 于配置好的1% 瓊脂糖凝膠進行電泳以檢測DNA 質(zhì)量，用滅菌水將DNA 濃度統(tǒng)一稀釋至100 ng/μL。最后在70% 乙醇中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計與合成 登陸Ensembl 網(wǎng)站（http://asia.ensembl.org/index.html）Gene 數(shù)據(jù)庫，獲得豬的PLA2G4A基因序列，序列號為ENSSSCG00000023351。利用軟件Primer 5.0 進行自動搜索并用軟件Oligo 7.0 進行分析，共使用24 對引物（表1）。

1.2.3 PCR 反應(yīng)體系和條件 15 μL PCR 擴增反應(yīng)體系（用于酶切反應(yīng)之前的PCR 擴增）：DNA 1 μL，10×Buffer 1.5 μL，25 mmol/L MgCL21.5 mL，10 mmol/L DNTP 0.3 μL，10 μmol/L 上、下游引物分別0.15 μL/條，5 U/μL Taq 酶0.2 μL，H2O 補 至15 μL。20 μL PCR 擴增反應(yīng)體系（混池測序擴增體系）：去離子水1 μL，Taq 酶10 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL。

1.2.4 混池測序 將所提DNA 混合進行PCR 擴增，本實驗采用20 μL PCR 擴增反應(yīng)體系。PLA2G4A基因引物順序號為1、2、3、10、12、17、19、23 的擴增反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性3 min；98℃變性10 s，57.2℃退火15 s，72℃延伸10 s，34 個循環(huán)；72℃延伸5 min，最后4℃保存。PLA2G4A基因引物順序號為4、5、6、7、8、9、11、13、14、15、16、18、20、21、22、24 的擴增的反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性3 min；98℃變性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸10 s，34 個循環(huán)；72℃延伸5 min，最后4℃保存。PCR 產(chǎn)物均用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送交上海生物工程股份有限公司進行測序。

1.2.5 基因型分型 在進行酶切之前首先進行PCR 擴增，采用15 μL 的PCR 擴增反應(yīng)體系。PLA2G4A基因 PCR 擴增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72℃延伸3 min，最后4℃保存。PCR 產(chǎn)物取3 μL 用ExoI和FastAP 純化，主要是用ExoI 去除反應(yīng)產(chǎn)物中的剩余引物，用FastAP 去除反應(yīng)中剩余的DNTP。37℃ 15 min，80℃ 15min，純化好后進行延伸反應(yīng)，預(yù)先混好延伸引物。延伸反應(yīng)條件為96℃預(yù)變性1 min；96℃變性10 s，52℃退火5 s，60℃延伸30 s，30 個循環(huán)；后取1 μL延伸產(chǎn)物，加9 μL 上樣HIDI，95℃變性3 min，立即冰水浴，上測序儀。7 μL PCR 酶切反應(yīng)體系：PCR 產(chǎn)物3 μL，20 U/μL ExoI 0.2 μL，1 U/μL FastAP 0.8 μL，ExoI Buffer 0.7 μL，H2O 補至7 μL。6 μL 延伸反應(yīng)體系：PCR 產(chǎn) 物2 μL，Snapshot Mix 試 劑1 μL，延 伸 引 物（10 μmol）0.1 μL，水補至6 μL。

1.2.6 飼料利用相關(guān)性狀測定 利用奧斯本自動飼喂系統(tǒng)獲得北京中育種豬有限責(zé)任公司166 頭大白公豬采食量和增重及飼料利用信息。初測體重范圍為29.3～35 kg，初測時間在2016 年4 月26 日—2017 年2 月4 日，結(jié)測平均體重為96.98 kg，平均測定飼養(yǎng)天數(shù)為68 d，共計4 個批次。計算ADFI、FCR、RFI 和ADG（表2）。

其中，RFI 為實際采食量與預(yù)測采食量之差[12]。預(yù)測采食量通過多元線性回歸的方法得到：在飼養(yǎng)期間準確記錄每只豬的干物質(zhì)采食量（DMI）和ADG，飼養(yǎng)試驗結(jié)束后利用得到的DMI、試驗期中間階段的代謝體重和ADG 結(jié)果進行線性回歸分析，計算出豬的預(yù)期采食量。根據(jù)預(yù)期采食量模型，若模型方程的截距顯著，則可根據(jù)此模型計算出預(yù)期采食量[13]。

1.3 統(tǒng)計分析

1.3.1 基因頻率（Gene Frequency）和基因型頻率（Genotype Frequency）根據(jù)基因型判定結(jié)果，計算第i 個基因頻率：

其中，Di為第i 個基因的純合子頻率，Hij為第i 個基因與第j 個基因組成的雜合子頻率。

檢驗位點是否處于Hardy-Weinberg 平衡，采用卡方適合性檢驗：

其中，Oi是第i 種基因型的實際觀察數(shù)，Ei為第i 種基因型的理論頻數(shù)。

表1 PLA2G4A 基因擴增的引物序列

1.3.2 關(guān)聯(lián)分析 使用Rstudio 程序?qū)LA2G4A基因外顯子和內(nèi)含子的多態(tài)性與豬的飼料報酬性狀進行關(guān)聯(lián)分析。模型：表型=批次+基因型+殘差。

由于166 頭豬都在北京中育種豬有限責(zé)任公司采用奧斯本自動飼喂系統(tǒng)測定，其他因素幾乎一致，在分析中不再考慮。

2 結(jié)果與分析

2.1PLA2G4A基因多態(tài)性檢測 DNA 樣本進行混池測序后用DNAMAN 軟件對經(jīng)PCR 擴增的PLA2G4A基因各段擴增序列進行比對分析尋找SNP 位點。通過對本研究中24 對引物的擴增片段進行逐個分析，共發(fā)現(xiàn)9 個SNP 位點，依次記為SNP1、SNP2、SNP3SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8、SNP9（表3）。

基因型頻率和基因頻率及Hardy-Weinberg 平衡檢驗結(jié)果見表4。在SNP1 位點檢測到CC、CT、TT 3 種基因型，且CC 型為優(yōu)勢基因型；在SNP2 位點檢測到AA、AC、CC 3 種基因型，AC 為優(yōu)勢基因型；在SNP3 位點檢測到AA、AT、TT 3 種基因型，AT 為優(yōu)勢基因型；在SNP4 位點檢測到GG、GT、TT 3 種基因型，GG 為優(yōu)勢基因型；在SNP5 位點檢測到CC、TC、TT 3 種基因型，且CC 為優(yōu)勢基因型；SNP6 位點檢測到AA、AG、GG 3 種基因型，且GG 為優(yōu)勢基因型；在SNP7 位點檢測到AA、AG、GG 3 種基因型，且AG 為優(yōu)勢基因型；在SNP8 位點檢測到CC、TC、TT 3 種基因型，且TC 為優(yōu)勢基因型；在SNP9 位點檢測到AA、AC、CC 3 種基因型，且AA 為優(yōu)勢基因型。SNP1～9 多態(tài)位點分別以C、C、A、G、C、G、A、C、A 為優(yōu)勢基因。哈代溫伯格平衡檢驗表明，SNP 1、4、5、6、8、9 嚴重偏離哈代溫伯格平衡，表明該群體可能受到了選擇等影響。

2.2 豬PLA2G4A基因多態(tài)性與飼料報酬性狀的關(guān)聯(lián)分析如表5 所示，SNP3 對ADG 有極顯著影響（P=0.000 3），而其他SNP 對這4 種性狀均沒有顯著影響。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，豬PLA2G4A基因與ADG 顯著相關(guān)，與飼料報酬的性狀關(guān)聯(lián)不密切。這與Qiu 等[8]在研究黃姑魚的遺傳連鎖圖譜時發(fā)現(xiàn)PLA2G4A是生長相關(guān)QTL 區(qū)域的重要生長基因相一致。與Harris 等[9]在對獼猴抗肥胖的研究中發(fā)現(xiàn)，磷脂酶A2（PLA2G4A）與體重的持續(xù)穩(wěn)定和胰島素敏感性顯著相關(guān)等研究結(jié)果一致，說明PLA2G4A基因在生長增重方面的作用。

不同物種的PLA2G4A基因結(jié)構(gòu)和位置并不相同。豬PLA2G4A基因[14]定位在第9 號染色體上，由29個外顯子28 個內(nèi)含子構(gòu)成，長約311 kb，共轉(zhuǎn)錄9 條mRNA，轉(zhuǎn)錄區(qū)域的相對位置為1～108、410～493、1249～1430、1858～2001、3337～3480、3600～3716、5115～5286。而人PLA2G4A基因[15]位于1 號染色體，長度約160 kb，包含19 個外顯子和18 個內(nèi)含子，編碼689 個氨基酸，在腎上腺和膀胱中表達較多，在肝臟中表達較少，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)1 298 個多態(tài)性位點。從信號通路來看，PLA2G4A基因產(chǎn)物在磷脂代謝通路Phospholipid→Arachidonic acid→PGH2的第一步起磷脂酶的作用，該通路第二步由PTGS2/COX-2基因產(chǎn)物催化，COX-2 產(chǎn)物可作為評價機體能量代謝的重要指標，可反映棕色脂肪組織的功能狀態(tài)，與降低體脂率也有密切關(guān)系[16]。COX-2基因在能量代謝方面的重要作用在一定程度上也可以證明PLA2G4A可能與ADG性狀相關(guān)。

表2 166 頭大白豬測定期間飼料報酬性狀描述

表3 豬PLA2G4A 基因中的SNP 位點

本研究結(jié)果顯示，與ADG 極顯著相關(guān)的SNP 位于內(nèi)含子16，可為近些年來對內(nèi)含子功能的研究提供材料。從位置上可以看到，該內(nèi)含子16 的SNP 位點與外顯子16 距離很近，該SNP 突變可能因為影響了轉(zhuǎn)錄后的剪切而發(fā)揮作用；這與目前一些疾病突變集中在內(nèi)含子與外顯子的交界致使外顯子缺失或內(nèi)含子未被剪切而引發(fā)突變，最終導(dǎo)致疾病的研究結(jié)果相似[17]，需要后續(xù)進一步研究。

除了與增重有關(guān)，PLA2G4A基因在疾病方面的研究也比較充分。Brooke 等[18]在研究人狹窄性腸炎潰爛的遺傳因素時，發(fā)現(xiàn)與PLA2G4A純合子4 bp（g.155574_77delGTAA）的缺失相關(guān)。張志瑁等[19]研究發(fā)現(xiàn)，PLA2G4A基因AA 基因型可能是印度人精神分裂癥發(fā)病的危險因素；Wei 等[20]報道，在英國人中PLA2G4A基因與精神分裂癥相關(guān)聯(lián)。Gosenca 等[21]認為，HERV-Ec1 的轉(zhuǎn)錄會有效促進cPLA2 表達，從而促進腫瘤發(fā)生。Mcgowen 等[22]發(fā)現(xiàn)，鼠中PLA2G4A的單獨缺失與妊娠后期的并發(fā)癥顯著相關(guān)。這些研究結(jié)果說明PLA2G4A基因功能比較復(fù)雜，值得深入研究。

綜上，本文的研究結(jié)果可為PLA2G4A 在飼料報酬方面的作用以及內(nèi)含子功能的研究提供依據(jù)，但本實驗也存在樣本數(shù)量較小、結(jié)果受批次影響較大的問題，導(dǎo)致PLA2G4A 與FCR、RFI 等性狀不存在顯著關(guān)聯(lián)。后續(xù)研究將擴大測定數(shù)量，并采集疾病數(shù)據(jù)，綜合生長、飼料報酬和疾病，進一步研究PLA2G4A 的代謝過程和分子機理，為養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)和人畜疾病治療做出貢獻。

4 結(jié) 論

本實驗發(fā)現(xiàn)，豬PLA2G4A基因位于內(nèi)含子16，具體位置為豬9 號染色體128126157 的SNP 位點與豬的ADG 有極顯著相關(guān)，而其他8 個SNP 位點與這4 種飼料報酬性狀均無顯著相關(guān)。

表4 PLA2G4A 基因SNP 突變位點的哈代溫伯格平衡檢驗

表5 豬PLA2G4A 基因多態(tài)性與飼料性狀的關(guān)聯(lián)分析