(黔東南州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心,貴州凱里 556000)

磺胺類藥物(Sulfonamides,SAs)和氟喹諾酮類(Fluoroquinolones,FQs)均為化學(xué)合成類抗菌藥,具有抗菌譜廣、使用方便、性質(zhì)穩(wěn)定且價格低廉等優(yōu)點(diǎn),在獸醫(yī)臨床上和畜牧業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用;如磺胺類可用于大腸桿菌病等的治療;與某些抗菌增效劑聯(lián)用后能夠使其抗菌活性得到明顯增強(qiáng),甚至能夠呈現(xiàn)殺菌作用[1]。氟喹諾酮類也具有良好的抑菌及殺菌作用,目前我國生產(chǎn)并用于禽類疾病防治的這類藥物主要有達(dá)氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星和沙拉沙星等。兩類藥物在體內(nèi)的作用時間和代謝時間較長,長期使用或者過度使用可能導(dǎo)致在人體中蓄積,進(jìn)而對人體機(jī)能產(chǎn)生危害,也會造成一定的生態(tài)環(huán)境污染[2-6]。近年來,動物源食品中磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量超標(biāo)現(xiàn)象十分嚴(yán)重,其殘留問題已經(jīng)引起國際上的高度重視,世界各國對其殘留限量均有嚴(yán)格的規(guī)定。美國及歐盟等國家對動物性食品中磺胺類藥物總量以及單個磺胺藥量規(guī)定的最大殘留限量為100 μg·kg-1[7],歐盟[8-9]規(guī)定在動物肌肉中恩諾沙星(恩諾沙星和環(huán)丙沙星總和)為100 μg/kg,雙氟沙星為300 μg/kg,日本肯定列表[10]規(guī)定雙氟沙星不得檢出、其它幾種限量在10～300 μg/kg;我國農(nóng)業(yè)部235號公告也規(guī)定磺胺類藥物在食品動物中的肌肉和肝臟中最大殘留限量為100 μg·kg-1[11],農(nóng)業(yè)部235公告也規(guī)定在動物肌肉中各類沙星限量為10～300 μg/kg、2292號公告也規(guī)定禁止生產(chǎn)和使用洛美、培氟、氧氟和諾氟沙星。因此加強(qiáng)對動物源性食品中磺胺類和喹諾酮類藥物殘留的檢測監(jiān)控及殘留風(fēng)險評估是非常必要的。

目前,對動物源性食品中磺胺類和喹諾酮類藥物殘留的研究主要集中在檢測方法方面[12-13],大多都局限于對單一類藥物多殘留的檢測方法研究,且諸多檢測標(biāo)準(zhǔn)和方法檢測過程冗繁、耗時;而對于對畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全保障方面的研究則主要集中在追溯體系的建設(shè)及管理技術(shù)[14-15],對于畜禽產(chǎn)品獸藥殘留檢測與風(fēng)險評估的研究也僅停留在4～5種磺胺類或幾種喹諾酮類藥物殘留風(fēng)險分析,兩類指標(biāo)殘留檢測及風(fēng)險評估的綜合分析尚未見報(bào)道。此外三穗鴨產(chǎn)業(yè)作為該縣主要產(chǎn)業(yè),其產(chǎn)品質(zhì)量安全直接關(guān)系著整個產(chǎn)業(yè)發(fā)展,因此,亟待建立一種快速同時檢測磺胺類藥物和喹諾酮藥物的方法,并結(jié)合獸藥殘留檢測結(jié)果對產(chǎn)品進(jìn)行風(fēng)險評估。本研究以貴州省特色家禽三穗鴨為研究對象,在三穗鴨集中養(yǎng)殖區(qū)域三穗縣抽取138份鴨肉樣本,通過檢測樣本中的磺胺類和喹諾酮類藥物的殘留量,采用食品安全指數(shù)法,分析貴州省三穗鴨肉中磺胺類和喹諾酮類藥物的殘留水平和風(fēng)險水平,為引導(dǎo)消費(fèi)、科學(xué)監(jiān)管及三穗鴨產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供數(shù)據(jù)參考和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三穗鴨 2018年6～9月對貴州省三穗縣三穗鴨養(yǎng)殖企業(yè)(大戶、合作社、家庭牧場)作為采樣點(diǎn),現(xiàn)場宰殺現(xiàn)場采集胸脯肉取得樣品,嚴(yán)格按照《動物及動物產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控抽樣規(guī)范》(NY/T1897)執(zhí)行,每份樣品取樣量不少于300 g,采集樣品138份;藥品試劑 磺胺類標(biāo)準(zhǔn)品(磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺多辛、磺胺醋酰、磺胺甲惡唑、磺胺苯吡唑、磺胺異惡唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺喹惡啉),喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品(二氟沙星、恩諾沙星、達(dá)氟沙星、沙拉沙星、環(huán)丙沙星、氟甲喹),含量100 μg/mL,農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所;甲醇、乙腈 為色譜純;水 為超純水;其余試劑 為分析純。

UPLC H-Class/TQ-S Micro 超高效液相色譜/三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Waters公司;氮?dú)獍l(fā)生器 英國Peak公司;RE2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;T18分散機(jī) 德國IKA公司;TDZ5-WS離心機(jī) 湖南邁克爾實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;SCQ-151104E超聲波清洗器 上海聲彥超聲波儀器有限公司;ASE-16固相萃取儀 天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)儲備液:精密量取磺胺類和喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品(100 μg/mL)1 mL置10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,得相應(yīng)單個標(biāo)準(zhǔn)儲備液(10 μg/mL),于4 ℃保存,保質(zhì)期3個月。

混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液:精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液(10 μg/mL)各1 mL置10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(1 μg/mL)于4 ℃保存,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品提取與凈化 樣品制備:取樣品肌肉組織300 g,制成小于或等于2.0 cm×2.0 cm×2.0 cm方塊,攪碎,高速勻漿機(jī)勻漿后裝入樣品瓶中,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品提取:稱取2.5 g(精確至0.01 g)鴨肉樣品,加入10 mL含0.2%甲酸的乙腈/水(80∶20)溶液進(jìn)行提取。將樣品渦旋混1 min、置于搖床上振搖30 min,然后在10000 r/min下離心10 min。

樣品凈化:將Oasis PRiME HLB vac小柱(6 cc,500 mg)安裝在預(yù)先清潔過的真空萃取裝置上,不需要進(jìn)行小柱活化。取5 mL提取液過柱,先流出的約1 mL棄去,取剩下的流出液4 mL在45 ℃條件下用微弱氮?dú)饬鞔蹈?用10%的乙腈水復(fù)溶,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后,上機(jī)測定。

1.2.3 液相色譜-質(zhì)譜條件

1.2.3.1 色譜條件 采用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),柱溫40 ℃,樣品溫度20 ℃;流動相為乙腈-水,梯度洗脫模式;流速0.4 mL/min;進(jìn)樣量2 μL,時長15 min。具體參見表1。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass parameters

表1 洗脫梯度Table 1 Elution gradient of sulfonamides

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源;正離子掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM),分時間段采集,脫溶劑溫度500 ℃,脫溶劑氣氮?dú)饬魉?000 L/h,離子源溫度150 ℃,錐孔氣流量150 L/h,毛細(xì)管電壓3.0 kV,碰撞氣為氬氣。其它質(zhì)譜參數(shù)見表2。

1.2.4 風(fēng)險分析方法 食品安全指數(shù)IFS是用來描述人們對攝入食物中的化學(xué)污染物是否對機(jī)體存在危害,并通過計(jì)算結(jié)果來分析食用該食品后對人體安全狀態(tài)的影響,反映食品受污染程度及消費(fèi)者受污染物質(zhì)的危害程度,通過殘留監(jiān)測和膳食暴露評估,能夠有效評價食品中的某種化學(xué)污染物對人體健康的危害程度,從而指導(dǎo)風(fēng)險管理并采取相應(yīng)的措施以降低風(fēng)險[16-20]。本研究主要采食品安全指數(shù)(index of food safety,IFS)法[21-23]進(jìn)行風(fēng)險分析。

式中:EDIc為化學(xué)物質(zhì)C的實(shí)際日攝入量估算值,等于∑(Ri·Fi·Ei·Pi)[i為不同的食品種類;Ri為食品i中化學(xué)物質(zhì)C的殘留水平,mg/kg;Fi為食品i的估計(jì)日消費(fèi)量,g/(人·天);Ei為食品i的可食用部分因子,取1;Pi為食品i的加工處理因子,取1];SIc為安全攝入量,可采用每日允許攝入量(acceptable daily intake,ADI)等數(shù)據(jù);本研究以我國農(nóng)業(yè)部制定的獸藥每日允許攝入量〔acceptable daily intake,ADI,μg/(kg·bw·d)〕為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價[11]。bw為平均體重,kg(按60 kg計(jì));f為校正因子,如果安全攝入量應(yīng)用ADI、RFD、PTDI等日攝入量數(shù)值,f可采用1;如果安全攝入量應(yīng)用PTWI等周攝入量數(shù)值,f可采用7[21];

IFSc可以指出食品中的污染物C對消費(fèi)者健康是否存在危害以及危害的程度:IFSc?1,表示所檢測的藥物對人們的健康不會造成危害效應(yīng),安全狀態(tài)可以接受;IFSc≤1,表示所檢測的藥物對人們的健康造成的危害效應(yīng)并不明顯,所檢測的藥物對人們健康的風(fēng)險是可以接受的;IFSc>1,表示所檢測的藥物對人們健康的風(fēng)險超出了可接受的限度,所檢測的藥物對人們的健康造成的危害效應(yīng)是明顯的,出現(xiàn)這種情況就應(yīng)該進(jìn)入風(fēng)險管理程序[21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有測試重復(fù)平行實(shí)驗(yàn)6次,數(shù)據(jù)在Waters公司的MassLynx V4.1軟件下采集,采用MassLynx V4.1SCN945處理方法對檢測結(jié)果進(jìn)行定性定量處理分析,采用1.2.4方法對定量分析結(jié)果進(jìn)行計(jì)算IFSc值。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線消除基質(zhì)效應(yīng),采用經(jīng)檢測不含目標(biāo)物的鴨肉樣品作為空白基質(zhì)樣品,稱取2.5 g(精確至0.01 g)空白基質(zhì)樣品共7份,置于50 mL離心管中,按1.2.2項(xiàng)樣品提取進(jìn)行操作制備得到空白基質(zhì)(氮吹后所得的空白基質(zhì)),用10%的乙腈水配制5、10、50、100、150、200 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液溶解空白基質(zhì)得到系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表3)。21種藥物的濃度在5～200 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,R2均大于0.995。

表3 21種化合物的加標(biāo)回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和檢出限(n=6)Table 3 Recovery rates,relative standard deviations(RSDs)and limits of detection(LOD)of 16 kinds of compounds(n=6)

2.2 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)

采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液-外標(biāo)法定量,取2.5 g(精確至0.01 g)空白基質(zhì)樣品,分別添加3個不同濃度的磺胺類和喹諾酮類化合物,加標(biāo)水平5、10、50 μg/kg,按照1.2.2項(xiàng)下的方法進(jìn)行操作,每個加標(biāo)水平重復(fù)6次,并計(jì)算6次平行結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。

從表3可以看出,鴨肉空白基質(zhì)樣品在1、10、50 μg/kg 3個不同濃度進(jìn)行添加回收加標(biāo)試驗(yàn),21種化合物回收率為70.3%～113.2%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為2.1%～11.5%(n=6);說明該方法對鴨肉中磺胺類和喹諾酮類多殘留的測定均有良好的準(zhǔn)確度和精密度,符合殘留分析的要求。

2.3 檢出限和定量限

以信噪比S/N=3確定21種藥物的檢出限,以信噪比S/N≥10確定其定量限。選擇符合一定的準(zhǔn)確度和精密度要求的最低濃度,采用加標(biāo)回收進(jìn)行驗(yàn)證。15種藥物的檢出限為0.5 μg/kg,6種喹諾酮類藥物的檢出限為1.0～2.5 μg/kg,15種磺胺類藥物的定量限2.0 μg/kg,6種喹諾酮藥物的定量限為5.0 μg/kg。具體結(jié)果見表3。

2.4 鴨肉中藥物殘留檢測結(jié)果

對所采集的138個三穗鴨肉樣品,檢測指標(biāo)21項(xiàng),檢出指標(biāo)1個為磺胺氯噠嗪,占總指標(biāo)的4.76%,檢出樣品3個,檢出率2.17%,檢出值為2.37～3.68 μg/kg;其余均未檢出。所檢出指標(biāo)磺胺氯噠嗪的殘留濃度為平均值為3.33 μg/kg,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國家規(guī)定的最高殘留限量100 μg/kg。所檢測的138個樣品所檢指標(biāo)均合格。

2.5 鴨肉中磺胺類獸藥殘留風(fēng)險分析

該縣為三穗鴨主產(chǎn)區(qū),三穗鴨也作為當(dāng)?shù)刂饕萑庀M(fèi)來源,根據(jù)實(shí)際調(diào)研,其鴨肉攝入量與2016版《中國居民膳食指南》統(tǒng)計(jì)的禽肉消費(fèi)量基本一致,因此采用2016版《中國居民膳食指南》資料顯示中國人均禽肉消費(fèi)量14.7 g/人·日計(jì)算,以標(biāo)準(zhǔn)體重60 kg來計(jì)各項(xiàng)指標(biāo)的IFSc值。

根據(jù)檢測情況,按照檢測結(jié)果平均值、最大值和最小值計(jì)算人體對各種污染物的實(shí)際攝入量并與其安全攝入量相比較,并計(jì)算各種獸藥殘留的IFSc值,因我國及JECFA等均無磺胺氯噠嗪的ADI值規(guī)定,因此按照國際上其它的一些ADI值規(guī)定,磺胺間甲氧嘧啶規(guī)定的ADI值最低,為6 μg/(kg·d),因此以磺胺間甲氧嘧啶為基準(zhǔn)計(jì)算食品安全指數(shù),具體見表4。

根據(jù)表4可知,三穗鴨中磺胺氯噠嗪的平均每日暴露量為0.0008 μg/kg bw/d,最大值為0.0009 μg/kg bw/d,最小值為0.0006 μg/kg bw/d,雖然我國及JECFA等均無磺胺氯噠嗪的ADI值規(guī)定,但是仍然可與我國規(guī)定的一些磺胺類ADI值作比較(我國規(guī)定的磺胺類ADI值分別為 10、20、50 μg/(kg·d);部分國家如澳大利亞規(guī)定磺胺間甲氧嘧啶ADI值為6 μg/(kg·d)[24],可以看出其每日暴露量值遠(yuǎn)小于與我國所規(guī)定的磺胺類ADI最小值10 μg/(kg·d),與部分國家規(guī)定的6 μg/(kg·d)相比較,也遠(yuǎn)小于該值,表明其中的磺胺氯噠嗪殘留對人體的潛在危害水平是可以接受的。

此外,以國際上規(guī)定的磺胺間甲氧嘧啶ADI值為基準(zhǔn)計(jì)算IFSc值,其IFSc值平均值為0.00014,最小值為0.00010,最大值為0.00016,均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于1;這表明三穗鴨中磺胺類藥物的殘留對人健康無直接危險,其潛在危害水平是可以接受的。

表4 檢出指標(biāo)膳食暴露及食品安全指數(shù)Table 4 The EDI and IFS of detection index in duck

注:我國及JECFA等均無磺胺氯噠嗪的ADI值規(guī)定,其ADI值參照磺胺間甲氧嘧啶的規(guī)定6 μg/(kg·d)。

4 結(jié)論

本研究采用0.1%甲酸乙腈提取樣品中的磺胺類和喹諾酮類藥物,經(jīng)Oasis PRiME HLB vac小柱凈化,用超高效液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法測定鴨肉中的15種磺胺類藥物和6種喹諾酮類藥物殘留,采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。在添加濃度5～50 μg/kg的范圍內(nèi),回收率為70.3%～113.2%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～11.5%(n=6);均符合獸藥殘留測定允許范圍,方法提取效率高、凈化效果好,能提高工作效率。該方法能對鴨肉中的獸藥殘留進(jìn)行快速定性和定量分析,具有較高的回收率、良好的精密度、較高準(zhǔn)確度,選擇性好,操作快速、簡便,適用于禽肉中上述15種磺胺類藥物和6種喹諾酮類藥物殘留的快速檢測分析。

本研究中三穗鴨肉中氟喹諾酮類均未檢出,磺胺類僅檢出磺胺氯噠嗪,其值也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國家對磺胺類藥物的限量規(guī)定,這說明三穗鴨肉磺胺類和喹諾酮類藥物殘留水平較低;此外其IFS遠(yuǎn)小于1,表明三穗鴨肉產(chǎn)品中磺胺類和喹諾酮類藥物獸藥殘留對人體的健康不會造成危害,風(fēng)險是可以接受的。這21種藥物在三穗鴨肉中殘留不會對消費(fèi)者身體健康產(chǎn)生危害,不必進(jìn)入風(fēng)險管理程序。

雖然三穗鴨中檢出的磺胺類藥物均未超過國家最大殘留限量規(guī)定,也不會對人體健康造成直接危害,但是其仍然影響三穗鴨肉產(chǎn)品質(zhì)量,仍是影響其質(zhì)量安全的風(fēng)險隱患因子,各相關(guān)部門須引起重視;因此需加強(qiáng)監(jiān)管力度和抽檢力度,確保產(chǎn)品質(zhì)量安全和產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。