胡燕嫻，孫晉紅，潘瑩，季芳，康濤，郭嘉杰，邵秀穩(wěn)

質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)糖基化研究中的應(yīng)用

胡燕嫻，孫晉紅，潘瑩，季芳，康濤，郭嘉杰，邵秀穩(wěn)

（廣東省藥品監(jiān)督管理局審評(píng)認(rèn)證中心，廣東 深圳 518000）

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)糖基化也越來(lái)越受到人們的廣泛關(guān)注。糖基化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后最主要的修飾方式之一，在生物過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。質(zhì)譜由于操作簡(jiǎn)便并具有極高的靈敏度和準(zhǔn)確度，已成為蛋白質(zhì)組學(xué)中最主要的技術(shù)之一，不同原理的質(zhì)譜在蛋白質(zhì)糖基化研究具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可進(jìn)行定性定量分析，包括相對(duì)分子量的測(cè)定、糖基化位點(diǎn)的鑒定、糖鏈組成的解析及定量分析等方面。

蛋白質(zhì)糖基化；質(zhì)譜技術(shù)；糖鏈；定性定量分析

1 引言

蛋白質(zhì)糖基化指單糖或寡糖與蛋白質(zhì)之間通過(guò)共價(jià)結(jié)合形成糖蛋白的過(guò)程，50%以上的蛋白質(zhì)存在糖基化現(xiàn)象[1]。根據(jù)蛋白質(zhì)被糖類修飾形式的不同可以把蛋白質(zhì)糖基化分為四類：O位糖基化、N位糖基化、C位糖基化及糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定連接。糖基化可改變分子結(jié)構(gòu)的特異性，影響細(xì)胞間的識(shí)別、黏附、代謝及免疫等過(guò)程，從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。例如N-聚糖上的末端殘基、唾液酸參與免疫和細(xì)胞間通訊[2]。粘附蛋白的糖基化可以在很大程度上影響它們的結(jié)合特性，影響細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-基質(zhì)黏附功能[3]。因此檢測(cè)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的變化，可以確定新的靶點(diǎn)，為疾病的治療尋找新方法。

有關(guān)蛋白質(zhì)糖基化修飾現(xiàn)象的研究，一方面研究其中的蛋白表征，即鑒定糖基化氨基酸位點(diǎn)；另一方面研究糖蛋白中的糖鏈表征，即確定糖鏈的組成及相對(duì)分子質(zhì)量。質(zhì)譜具有靈敏度高、可獲得多種結(jié)構(gòu)信息和適于分析混合物等優(yōu)點(diǎn)，是糖蛋白定性定量分析的一種理想手段。在質(zhì)譜中，由于糖蛋白骨架中的糖骨架和蛋白骨架都會(huì)有一定的斷裂規(guī)律，所以根據(jù)質(zhì)譜所得到的圖譜可以進(jìn)行相對(duì)分子量的測(cè)定、糖基化位點(diǎn)的鑒定、糖鏈組成的解析及定量等分析工作。

2 質(zhì)譜（Mass Spectrometry，MS）分析技術(shù)

質(zhì)譜分析技術(shù)是在電場(chǎng)和磁場(chǎng)中分析具有不同質(zhì)量的帶電分子、原子或離子碎片，可了解分子量、分子式或者分子結(jié)構(gòu)等方面的信息。應(yīng)用于蛋白質(zhì)糖基化研究中的質(zhì)譜主要有快原子轟擊質(zhì)譜（FAB-MS）、電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）、基質(zhì)輔助激光解析譜儀（MALDI-MS）等。串聯(lián)質(zhì)譜及多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)是研究和應(yīng)用熱點(diǎn)，其對(duì)糖鏈的解析可獲得更完整的結(jié)構(gòu)[4]。

2.1 快原子轟擊質(zhì)譜（FAB-MS）

快原子轟擊質(zhì)譜是最早被引入到糖鏈分析領(lǐng)域的質(zhì)譜技術(shù)，它使用氬或氙等高能粒子照射液態(tài)基質(zhì)中的待測(cè)物質(zhì)分子，分子吸收能量被激發(fā)從而碎裂成離子。一般情況下，用快原子轟擊得到的主要是分子離子或準(zhǔn)分子離子，而碎片離子很少。分析樣品無(wú)需經(jīng)過(guò)氣化而直接電離，操作簡(jiǎn)便，信號(hào)穩(wěn)定?？煸愚Z擊質(zhì)譜已被證明是分析糖蛋白結(jié)構(gòu)的一種有力的方法，它不僅可以測(cè)定寡糖及其衍生物的相對(duì)分子質(zhì)量（Mr），而且可以測(cè)聚合度高于30的糖鏈的Mr。衍生化可以提高質(zhì)譜對(duì)糖鏈檢測(cè)的靈敏度。Okamoto在陰離子和陽(yáng)離子FAB-MS2兩種模式下，分別對(duì)天然及2-氨基吡啶（PA）衍生化的唾液酸寡糖進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)構(gòu)分析，研究表明，經(jīng)2-PA衍生化唾液酸寡糖的檢測(cè)靈敏度明顯高于未衍生化的寡糖[5]。

2.2 電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）

電噴霧電離質(zhì)譜是一種通過(guò)電噴霧，將溶液中的離子轉(zhuǎn)變?yōu)闅庀嚯x子而進(jìn)行質(zhì)譜分析的方法。電噴霧在離化時(shí)能量更低，具有較高的離子化效率及靈敏度，分子質(zhì)量范圍更寬，適合各種微量糖鏈或其衍生物樣品的分析。在電噴霧電離質(zhì)譜中，高分子量的分子通常會(huì)帶有多個(gè)電荷，電荷狀態(tài)的分布可以精確對(duì)分子量定量，同時(shí)提供精確的分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息。電噴霧電離質(zhì)譜能檢測(cè)非衍生化的糖，可區(qū)分非衍生化寡糖的連接方式（O-或N-），確定寡糖的結(jié)構(gòu)、聚合度及組成。對(duì)于衍生化糖的測(cè)定，電噴霧電離質(zhì)譜能精確糖蛋白的Mr及結(jié)構(gòu)不均一性，同時(shí)確定糖蛋白中寡糖序列和連接方式。

2.3 基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜（MALDI-MS）

基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜的檢測(cè)原理是將待測(cè)物的溶液和某種基質(zhì)溶液混合，蒸發(fā)溶劑，使待測(cè)物與基質(zhì)成為晶體或者半晶體，再用一定波長(zhǎng)的激光進(jìn)行照射，基質(zhì)吸收能量后傳遞給待測(cè)物，使被分析物氣化從而實(shí)現(xiàn)離子化。目前基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜儀是一種簡(jiǎn)單檢測(cè)癌癥和各種組織（包括血液，血清和肌肉）疾病中糖基化改變的常用工具[6]。它是第一個(gè)用于檢測(cè)全血清聚糖譜分析的方法，如用于N-糖鏈?；|(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜除了用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物外，還有助于進(jìn)一步闡明復(fù)雜生物樣品中蛋白質(zhì)糖基化的特點(diǎn)。不同腫瘤組織具有不同的聚糖譜，基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜可在福爾馬林固定石蠟包埋組織中定位成像N-聚糖[7]。若基質(zhì)輔助激光解析譜儀能與飛行時(shí)間檢測(cè)器或其他高性能檢測(cè)器聯(lián)合，則能獲得更多精準(zhǔn)信息。

2.4 串聯(lián)質(zhì)譜

2.4.1 液相色譜-電噴霧質(zhì)譜（LC-MS）

在糖組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，液相色譜-電噴霧質(zhì)譜是一種理想有效的研究方法，其可提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性及提供豐富的糖鏈信息。液相色譜-電噴霧質(zhì)譜可分析單糖組成及結(jié)構(gòu)信息，進(jìn)一步增加了寡糖分析的深度。這種方法是目前用于異構(gòu)體分離和MS檢測(cè)的最穩(wěn)定可靠的方法。親水相互作用液相色譜（HILIC）已用于分離和標(biāo)記的聚糖。SONG等人研究顯示通過(guò)使用液相色譜-電噴霧質(zhì)譜可檢測(cè)血清中聚合度超過(guò)170的聚糖結(jié)構(gòu)[8]。

2.4.2 毛細(xì)管電泳質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）

毛細(xì)管電泳質(zhì)譜聯(lián)用方法可以獲得樣本中多種信息，如遷移時(shí)間、分子質(zhì)量及離子碎片信息等[9]。它具有高通量和高分辨率的特點(diǎn)，因而可將其提高樣本檢測(cè)的準(zhǔn)確率和效率，基于以上優(yōu)勢(shì)可將其用于糖組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析中。SUN等將一種新型電動(dòng)壓力的接口技術(shù)用于毛細(xì)管電泳質(zhì)譜中，該方法用于鑒定肝素寡糖的結(jié)構(gòu)[10]。

3 應(yīng)用

3.1 相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

電噴霧電離質(zhì)譜或基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜可對(duì)富集純化的各種糖鏈進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量檢測(cè)，從而得到糖鏈混合物的相對(duì)分子質(zhì)量指紋譜，以獲得樣品中糖鏈群體的總體分布特征。毛文君等采用電噴霧質(zhì)譜準(zhǔn)確判斷出6種瓊膠寡糖的分子量[11]。

3.2 糖鏈組成的解析

直接進(jìn)行MSn分析，或者將糖鏈全甲基化之后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析，可鑒定糖鏈內(nèi)部單糖或寡糖的連接方式。GC-MS配置的電子轟擊或化學(xué)離子化等離子源可以使GC分離后的各種糖鏈衍生物分別得到充分裂解，依據(jù)糖鏈分子裂解規(guī)律對(duì)碎片離子產(chǎn)生的質(zhì)譜信號(hào)進(jìn)行分析，則可以確定糖苷鍵的類型。

ESI串聯(lián)質(zhì)譜可以對(duì)MS和MS/MS譜圖進(jìn)行解析，另外，離子肼和傅立葉變換離子回旋共振（FTICR）在分析糖鏈結(jié)構(gòu)方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。采用酶法將所有N-糖鏈從人血漿蛋白上切割下來(lái)，然后通過(guò)純化、富集和回收，得到糖鏈再經(jīng)過(guò)常規(guī)的還原和甲基化，最終用于電噴霧電離質(zhì)譜及MSn分析，從而確定了人血漿106種N-連接糖鏈的單糖組成[12]。

3.3 糖基化位點(diǎn)的鑒定

確定糖基化位點(diǎn)的途徑主要有兩種：①通過(guò)尋找糖基特征離子，進(jìn)而確定糖肽，比如NacGlc特征離子為m/z 204；②通過(guò)比對(duì)酶處理前后酶解肽圖，在總離子流色譜圖（TIC）上，酶解前的糖肽峰酶解后消失，出現(xiàn)去糖肽，根據(jù)去糖肽的相對(duì)分子量及MS/MS圖確定糖基化位點(diǎn)。TSARBOPOULOS等分析了重組人白細(xì)胞介素-4的糖基化位點(diǎn)及部分糖鏈結(jié)構(gòu)[13]。

3.4 定量分析

每個(gè)物質(zhì)都有固定的質(zhì)量，根據(jù)質(zhì)譜圖中的峰強(qiáng)可以進(jìn)行定量分析?；谫|(zhì)譜的糖鏈定量分析方法主要有絕對(duì)定量和相對(duì)定量?jī)煞N，絕對(duì)定量需要選待測(cè)糖鏈的標(biāo)準(zhǔn)品，但對(duì)于生物樣品中復(fù)雜的糖鏈，獲得標(biāo)準(zhǔn)品非常困難。目前主要采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行相對(duì)定量研究，即向樣品中加入一定量的內(nèi)標(biāo)物，通過(guò)測(cè)量與被分析物的相關(guān)響應(yīng)值進(jìn)行定量。薛向東等建立了一種基于電噴霧電離質(zhì)譜的苯胺穩(wěn)定同位素標(biāo)記對(duì)還性寡糖鏈進(jìn)行相對(duì)定量分析的研究方法，將其應(yīng)用于人奶中游離寡糖和牛奶中游離寡糖的分析，結(jié)果表明，人奶中的乳糖含量高于牛奶[14]。

4 結(jié)束語(yǔ)

在生命活動(dòng)中，蛋白質(zhì)作為新陳代謝的承擔(dān)者，糖基化可改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能。在一些熱門(mén)研究領(lǐng)域，如發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞表面糖基化的改變?cè)谀[瘤發(fā)生，甚至發(fā)展轉(zhuǎn)移中起著重要作用。臨床中常用的腫瘤標(biāo)記物，如CA125、CA199等是腫瘤中異常糖基化的結(jié)果。糖蛋白的合成是在多種多樣的酶作用下形成，在同種分子的同一糖基化位點(diǎn)，糖鏈的結(jié)構(gòu)也會(huì)存在差異。質(zhì)譜作為發(fā)展新技術(shù)，被認(rèn)為對(duì)糖基化分析具有明確的優(yōu)勢(shì)，可對(duì)各種糖鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。相信隨著質(zhì)譜分析技術(shù)的不斷發(fā)展，其在糖蛋白糖基化研究中的應(yīng)用將極大地拓展對(duì)糖蛋白的生物學(xué)功能認(rèn)識(shí)。

［1］APWEILER R，HERMJAKOB H，SHARON N.On the frequency of protein glycosylation，as deduced from analysis of the SWISS-PROT database［J］.Biochimica et Biophysica Acta，1999，1473（1）：4-8.

［2］GAURANG P B，KAREN J C.Sialylation of N-glycans：mechanism，cellular compartmentalization and function［J］.Histochemistry and Cell Biology，2017，147（2）：149-174.

［3］SONIA B，CARVALHO S，DIAS A M ， et al.Pancreatic cancer cell glycosylation regulates cell adhesion and invasion through the modulation of α2β1 integrin and e-cadherin function［J］.PLOS ONE，2014，9（5）：85.

［4］ZHANG H T，ZHANG S，TAO G J，et al.Typing of blood-group antigens on neutral oligosaccharides by negative-ion electrospray ionization tandem mass spectrometry［J］.Analytical chemistry，2013，85（12）：9.

［5］OKAMOTO M.A comparative study on structural elucidation of sialyl oligosaccharides by mass spectrometry with fast atom bombardment，electrospray ionization，and matrix assisted laser desorption/ionization［J］. Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2002，65（11）：27.

［6］MUCHENA J K，DAYOUNG P，CARLITO B L.Glycans and glycoproteins as specific biomarkers for cancer［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2017，409（2）：395-410.

［7］POWERS T W ，NEELY B A，YUAN S，et al.MALDI imaging mass spectrometry profiling of n-glycans in formalin-fixed paraffin embedded clinical tissue blocks and tissue microarrays［J］.PLoS ONE，2014，9（9）：106255.

［8］SONG T，ALDREDGE D，LEBRILLA C B.A method for in-depth structural annotation of human serum glycans that yields biological variations［J］.Analytical chemistry，2015，87（15）：62.

［9］MANTOVANI V ，GALEOTTI F，MACCARI F，et al.Recent advances on separation and characterization of human milk oligosaccharides［J］.ELECTROPHORESIS，2016，37（11）：24.

［10］SUN X J，LIN L，LIU X Y，et al.Capillary electrophoresis-mass spectrometry for the analysis of heparin oligosaccharides and low molecular weight heparin［J］.Analytical chemistry，2016，88（3）：43.

［11］毛文君，林洪，管華詩(shī).瓊膠寡糖的ESI-MS分析研究［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2001（3）：69-72.

［12］STUMPO K A，REINHOLD V N.The N-glycome of human plasma［J］.Journal of proteome research，2010，9（9）：4823-4830.

［13］TSARBOPOULOS A，PRAMANIK B N ，NAGABHUSHAN T L，et al.Structural analysis of the CHO-derived interleukin-4 by liquid-chromatography/electrospray ionization mass spectrometry［J］.Journal of Mass Spectrometry，1995，30（12）：1752-1763.

［14］薛向東，張萍，王仲孚，等.基于電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）的苯胺穩(wěn)定同位素標(biāo)記對(duì)還原性寡糖（鏈）的定性定量分析方法［J］.高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2010，31（11）：2173-2180.

O657.63

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2019.15.063

2095－6835（2019）15－0151－03

〔編輯：嚴(yán)麗琴〕