李文娟，王李陽

（陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119）

1 前言

將器官或組織工程學(xué)應(yīng)用于人體以解決器官組織的再生問題，是現(xiàn)今生物工程領(lǐng)域一個重要的研究方向。首先在體外構(gòu)建器官或組織，而后將其移植到體內(nèi)替代因疾病衰竭或意外損壞而導(dǎo)致壞死的器官，整個過程大多具有非侵入性，即在不對生物體實施侵犯性策略時，就可實施替代。這種技術(shù)很大程度上克服了供體不足的局限性，極有可能在根本上解決器官移植的重大問題。自干細胞應(yīng)用于生物工程領(lǐng)域以來，組織工程已取得了很大的突破，比如再生皮膚、人造骨骼、氣管等的出現(xiàn)。

器官移植供體的傳統(tǒng)來源為自體移植或者近親在血型匹配下供給，供體數(shù)量嚴(yán)重不足。20世紀(jì)90年代初，英國劍橋大學(xué)首次嘗試豬-人異種器官移植。豬器官與人器官在尺寸大小、生理特性和代謝功能上均相似，但豬器官作為移植器官仍有免疫排斥性，人體將其作為異物加以識別、確認(rèn)和排斥。2016年，哈佛大學(xué)計劃使用CRISPER-CAS9技術(shù)將豬和人免疫不匹配的45個相關(guān)基因進行改造，以得到不被人類免疫系統(tǒng)排斥的體外器官。然而，該過程復(fù)雜且不可預(yù)見性強，到目前為止尚未徹底解決異種移植免疫相斥性的問題。

受體對移植物的免疫排斥性問題不僅是器官和組織移植醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要問題，同時也是器官或組織工程學(xué)的重要問題。2018年，動物植物跨界交叉應(yīng)用于組織工程學(xué)研究。該研究進展基于植物對動物和人體的低免疫源性，其運用使生物工程獲得了突破，這種極強的組織兼容性使器官或組織生物工程進入一個實用性時期。本文對近年來動植物跨界交叉應(yīng)用于組織工程學(xué)領(lǐng)域的研究進展、工程模式和應(yīng)用優(yōu)勢進行了較為詳盡的歸納，對該跨界交叉應(yīng)用過程亟待解決的問題進行了總結(jié)，并對未來生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的可能性進行了闡述。

2 器官組織工程的特點

器官組織工程學(xué)是一門緊密結(jié)合諸如干細胞再生生物學(xué)、納米技術(shù)的極具生命力的新興學(xué)科，學(xué)科初建顯示了強有力的發(fā)展趨勢。學(xué)科目標(biāo)明確，基本原理簡明，具體原理為：①建立器官或組織（organ/tissue，O/T）構(gòu)架（Scaffold）；②在此構(gòu)架上種植細胞，最終形成再生器官或組織。種植的細胞的種類有體細胞和干細胞兩類，由于體細胞來源于已經(jīng)成熟的組織，其逐漸被多功能干細胞所替代。干細胞在這個O/T構(gòu)架提供的3D環(huán)境和其生長和分化信號誘導(dǎo)下，粘附、增殖、遷移和分化，形成再生的器官或組織。O/T構(gòu)架用于提供未來組織的機械支持和傳遞細胞信息能量，控制再生組織的形狀和大小以及呈現(xiàn)具有時空準(zhǔn)確性的物理和化學(xué)分子信號，最終促進干細胞增殖和分化。

器官組織工程O/T構(gòu)架主要為多糖/糖蛋白的材料或脫細胞的天然生物材料，其中細胞外基質(zhì)為其主要成分。O/T構(gòu)架主要分為兩類：①基于多糖/糖蛋白的天然材料與合成聚合材料的混合材料。通常，天然材料機械性較差，合成聚合物生物材料有著優(yōu)良的可加工性和結(jié)構(gòu)力學(xué)特征，但有潛在毒性，易引起炎癥反應(yīng)，混合材料有效地將兩者的優(yōu)點結(jié)合起來。②脫細胞的天然生物材料。這種O/T構(gòu)架由于一定程度上保持了細胞外基質(zhì)構(gòu)架的完整性，因而不需要額外處理或修飾便可提供干細胞生長分化需要的營養(yǎng)成分和時空調(diào)控因子，這從結(jié)構(gòu)上有效地解決了構(gòu)架供血不足的問題，因而脫細胞O/T構(gòu)架也是一種預(yù)血管化生物活性構(gòu)架（Scaffold）。

3 器官組織工程的重要突破和亟待解決的問題

器官組織構(gòu)建主要有兩種方式，即在體（in vivo）器官組織的和體外（in vitro）器官組織的再生體系，然而這兩種體系都面臨組織兼容性的問題，組織兼容性是目前器官組織構(gòu)建不可回避的科學(xué)問題。

3.1 在體器官組織的再生體系

目前，我國在在體器官組織的再生領(lǐng)域已取得引人注目的成就。2016年，曹誼林課題組成功在哺乳動物體內(nèi)植入抗骨癌構(gòu)架。將阿霉素（ADM）混到多孔納米羥基磷灰石/膠原蛋白構(gòu)架中（ADM-PLGA-NHAC）后，對其在大鼠中進行免疫應(yīng)答測試，在兔中評估骨修復(fù)能力和在裸鼠內(nèi)檢測抗腫瘤功效。實驗證明，該構(gòu)架有著優(yōu)秀的生物兼容性，ADM的存在并未影響NHAC突出的骨修復(fù)能力。

ADM-PLGA-NHAC在腫瘤中的植入相較于直接往腹膜內(nèi)注射ADM，改善了抗腫瘤效果并減少了不良副作用。構(gòu)架具有優(yōu)異的緩釋藥性、骨修復(fù)和抗腫瘤功效，這使其成為有前景的抑制骨瘤的骨傳導(dǎo)性材料。在國際同行中，2018年，MIT的Langer課題組首次在靈長類綠猴中測試了一種多孔可降解生物兼容性構(gòu)架對脊髓損傷的修復(fù)作用，其植入明顯改善了脊髓受損綠猴的運動能力。實驗證實此構(gòu)架在靈長類脊椎損傷治療中具有安全性和功效性，為進一步用于臨床治療急性脊髓損傷提供實驗基礎(chǔ)。

3.2 體外組織的再生體系

2012年，干細胞研究成果獲得了諾貝爾醫(yī)學(xué)獎，隨后多功能干細胞的引入使得器官組織工程進入到發(fā)展的重要階段。干細胞可在構(gòu)架提供的合適的體外環(huán)境下，誘導(dǎo)分化形成各類細胞，最終構(gòu)建出器官。體外組織的再生體系具有重現(xiàn)器官發(fā)育的潛力，而且可以互作于細胞微環(huán)境，因而在疾病體外模擬、藥物測試和組織工程等領(lǐng)域有極大的發(fā)展前景。在最佳的構(gòu)架環(huán)境下，人多能干細胞可衍生出幾乎所有器官的類器官，如腸道、腎臟等，甚至包括大腦和視網(wǎng)膜，而且整個過程與體內(nèi)器官的發(fā)生過程相似。體外器官發(fā)生方法對每個器官都是特定的，通常是使用特定的生長因子或者不同的營養(yǎng)組合來驅(qū)動獲得器官前體，而后體外培養(yǎng)的干細胞會經(jīng)過細胞分選和干細胞的譜系提交和調(diào)控產(chǎn)生出器官內(nèi)的各類細胞。2016年，日本RIKEN中心在體外將人類胚胎干細胞誘導(dǎo)形成hESC視網(wǎng)膜組織，經(jīng)檢測該移植物可以在體內(nèi)存活并成熟，且移植物與宿主細胞之間有突觸連接形成，說明這種體外誘導(dǎo)的hESC視網(wǎng)膜具有一定的臨床效用。植物細胞也可在構(gòu)架上生長，模擬出天然的生長狀態(tài)。2015年，劍橋大學(xué)研究小組將擬南芥和百葉草等細胞，種植于人體組織工程中使用的生物兼容性Shear-spun納米微纖維構(gòu)架上，開發(fā)出一種植物細胞3D培養(yǎng)方法，可以模擬植物組織環(huán)境。這種在微觀尺度下探索植物細胞與環(huán)境相互作用的新技術(shù)，將為以后研究提供一種新的植物細胞培育方案。

3.3 解決器官移植受體對植入組織排斥性的現(xiàn)行對應(yīng)方案

無論是在體器官組織的再生體系還是體外組織的再生體系，器官組織工程現(xiàn)行的研究階段還是未來的臨床應(yīng)用，面臨最重大的問題都是受體對移植物的組織排斥性。哈佛大學(xué)的Church團隊使用CRISPR-cas9編輯技術(shù)破壞了豬源上皮細胞系中所有的PERV，該技術(shù)為異種器官移植中免疫排斥性和PERV的感染問題提供了解決途徑，從而克服人類器官移植供體不足的問題，但使用CRISPR-cas9技術(shù)將豬的基因改造成類似于人類的基因，不僅技術(shù)上相當(dāng)煩瑣，且仍不能完全解決異源移植中組織排斥性的問題。

4 植物構(gòu)架應(yīng)用于動物器官組織再建的特色

4.1 植物構(gòu)架與動物性構(gòu)架的特性比較

植物構(gòu)架應(yīng)用于動物器官組織工程在保持了傳統(tǒng)構(gòu)架特點的同時，凸現(xiàn)出許多動物性構(gòu)架不具備的優(yōu)點。從共同特性上來看，主要有：①植物構(gòu)架保持了一些動物蛋白材料和多糖材料以及脫細胞材料的特點，植物蛋白或多糖材料不僅保持了與動物材料相類似的物理化學(xué)特性，易于構(gòu)建成各種形狀和大小的構(gòu)架，并可提供3D環(huán)境供干細胞生長和分化；②植物脫細胞構(gòu)架中的葉脈系統(tǒng)與動物組織中的脈管系統(tǒng)類似可進行營養(yǎng)物質(zhì)的輸送，與動物脫細胞構(gòu)架類似；③植物的基因修飾的可操作性，使得植物構(gòu)架與最新的科研成果如納米3D熱點技術(shù)、干細胞、CRISPR基因編輯、藥物篩選等有效地結(jié)合起來。

從獨特性質(zhì)的優(yōu)點來看，植物構(gòu)架確實具有動物構(gòu)架不具有的特點：①植物構(gòu)架對器官組織的移植受體沒有或有明顯較低免疫排斥性，與構(gòu)建細胞組織兼容性強，從而有可能徹底解決器官移植的免疫排斥性；②植物構(gòu)架低成本，供體數(shù)量無局限，無時間限制；③植物構(gòu)架有更高的極性，其親水性更優(yōu)，更利于種子細胞的粘附生長；④植物構(gòu)架操作簡單，易于投入大規(guī)模的研究，特別在基礎(chǔ)研究階段，有利于獲取具有臨床適用性的研究成果；⑤現(xiàn)代基因修飾技術(shù)暫無社會倫理的阻礙。使用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)人類蛋白用于構(gòu)建更加利于細胞生長的構(gòu)架，植物源人重組膠原蛋白在組織工程中應(yīng)用，可在保持構(gòu)架優(yōu)異性能的前提下降低過敏和疾病傳播的風(fēng)險。

4.2 植物構(gòu)架和動物性構(gòu)架的制備方法

將來源不同的器官充分有效地脫細胞化，再種植細胞或干細胞，進而用作器官移植物，是生物醫(yī)學(xué)界的一個挑戰(zhàn)，鑒于干細胞的全能性，社會對這一領(lǐng)域充滿希望。脫細胞構(gòu)架的制備原理主要是通過物理方法或化學(xué)方法將組織或器官中的細胞去掉，以降低構(gòu)架的免疫源性并保留細胞外基質(zhì)成分，最后使用干細胞將構(gòu)架再細胞化。由于脫細胞的不同方法會對細胞外基質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)、構(gòu)架力學(xué)均有影響，因而評估脫細胞方法的標(biāo)準(zhǔn)是細胞的去除率以及細胞外基質(zhì)的保留率。

4.2.1 動物組織去細胞化——動物性構(gòu)架的獲得

由于動物性構(gòu)架的使用一直是器官組織工程的經(jīng)典范例，動物組織構(gòu)架脫細胞化較植物組織更為成熟。2016年，哈佛醫(yī)學(xué)院Ott團隊采用SDS和內(nèi)切核酸酶灌注-脫細胞化的方法將人類心臟脫細胞化，得到微血管保存完整的無細胞人類心臟。脫細胞后的心臟蛋白量減少了89%，細胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白顯著保留，不溶性脂肪組織基質(zhì)和脂質(zhì)分子仍保留在心外膜表面。將其在大鼠中進行免疫生物兼容性測試發(fā)現(xiàn)，不同于原心臟和豬脫細胞心臟引起的M1巨噬細胞促炎反應(yīng)，人脫細胞構(gòu)架心臟引起的是M2巨噬細胞反應(yīng)。再細胞化后，人工心臟展現(xiàn)了能產(chǎn)生力的有代謝功能的心肌組織。2017年Vranckx等使用洗滌劑-酶促脫細胞化兔氣管。

4.2.2 植物組織去細胞化——植物構(gòu)架的獲得

植物組織去細胞化通常以兩種方法獲取植物構(gòu)架，即使用類似清洗哺乳動物組織的去污劑方法和使用漂白劑簡單的非去污劑方法。2018年Adamski團隊證明，這兩種方法均產(chǎn)生了機械性質(zhì)好、對細胞代謝影響小的植物葉脈網(wǎng)絡(luò)構(gòu)架，并保留了植物葉脈天然的運輸系統(tǒng)，營養(yǎng)運輸能力和保水能力好，具有高表面積體積比。

植物構(gòu)架具有優(yōu)良的免疫相容性，已被再生生物工程研究者基本認(rèn)可。2016年，Pelling團隊將制備的紅蘋果果肉脫細胞纖維素構(gòu)架植入免疫活性小鼠中，在鼠體中1周內(nèi)該構(gòu)架產(chǎn)生免疫應(yīng)答，4周后構(gòu)架周圍的表皮組織免疫應(yīng)答降低，8周后這些免疫應(yīng)答完全消失，纖維素構(gòu)架被宿主接受，所有小鼠均沒有明顯免疫性反應(yīng)的癥狀。

5 結(jié)論與展望

近年來，器官組織工程的應(yīng)用優(yōu)勢及與多種前沿科學(xué)如納米技術(shù)、干細胞等領(lǐng)域的結(jié)合使其成為生物工程領(lǐng)域的一大熱點。無論是在體器官或組織再生還是體外器官或組織培養(yǎng)，構(gòu)架的特性都是組織工程中的關(guān)鍵問題。具有優(yōu)異的力學(xué)特征的各類構(gòu)架能否應(yīng)用于臨床決定于它的生物兼容性。合成聚合材料生物活性差、有低毒性，而動物組織材料易于引起人體的免疫反應(yīng)，因而，植物組織的低免疫源性及其制備的簡易性和易獲得性使其成為組織工程中解決這一關(guān)鍵問題的重要選擇。植物構(gòu)架應(yīng)用于動物器官組織工程在保持了傳統(tǒng)構(gòu)架特點的同時，凸顯出許多動物性構(gòu)架所不具備的優(yōu)點。