徐婷婷，王永軍，狄佳春，孫蘇陽，蔡士賓，汪巧玲，鄒淑瓊，朱 銀，楊 欣，顏 偉

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所/江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護與利用平臺/江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點實驗室，江蘇南京 210014；2.江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇淮安 223001)

小麥赤霉病主要是由禾谷鐮孢菌引起的一種小麥真菌病害，廣泛發(fā)生在世界潮濕和半潮濕地區(qū)，嚴重影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)，導(dǎo)致嚴重的經(jīng)濟損失。小麥感染赤霉病后表現(xiàn)病癥為小麥根腐、苗枯、莖腐、稈腐和穗腐，除此以外，麥穗和籽粒被病菌侵染后，還會產(chǎn)生真菌毒素，嚴重危害人畜安全[1-3]。我國小麥赤霉病重發(fā)區(qū)域主要集中在長江中下游冬麥區(qū)和東北東部春麥區(qū)。隨著氣候變化和耕作制度的改變，小麥赤霉病的發(fā)病區(qū)域已蔓延到黃淮麥區(qū)、北方麥區(qū)[4]。目前為止，控制赤霉病的主要方式有藥劑防治和依賴抗病品種為基礎(chǔ)的綜合防治技術(shù)，在長江中下游麥區(qū)取得了一定成效。黃淮麥區(qū)長期以來缺少選擇壓力，生產(chǎn)品種基本不抗赤霉病，隨著氣候和耕作栽培方式的變化，黃淮麥區(qū)已經(jīng)逐漸成為小麥赤霉病發(fā)生的主要區(qū)域之一。小麥揚花期的雨水是誘發(fā)小麥赤霉病的主要氣象因子，抽穗揚花期的降水往往使藥物防治喪失最佳的防治時機，而且化學(xué)防治還會對土壤和水體環(huán)境造成污染。因此，篩選抗性資源，挖掘抗性基因，通過品種改良提高品種抗性是控制黃淮麥區(qū)小麥赤霉病危害的最為經(jīng)濟有效的方式。

目前為止，育種家已經(jīng)挖掘并培育了一些優(yōu)良抗性小麥品種，比如蘇麥3號、望水白、揚麥系列、寧麥系列品種等，主要集中在長江中下游麥區(qū)及雨水相對較多的南方地區(qū)，其中對蘇麥3號、望水白、寧7840等抗性資源，研究應(yīng)用最為廣泛。研究表明，寄主對赤霉病的抗性分為：I型抗性(抗侵染)、II型抗性(抗擴展)、III型抗性(抗DON毒素)和對赤霉病的基礎(chǔ)抗性[2,5]。蘇麥3號和望水白均具有抗侵染性和抗擴展性，望水白受侵染后DON毒素積累少。但由于抗源品種農(nóng)藝性狀較差，在育種中作為抗性親本直接利用難度較大[6]。近年來，已有大量的小麥抗赤霉病QTLs被報道，主要是參與II型抗性的位點。位于蘇麥3號3BS染色體上的Fhb1，是一個主效QTL，已得到廣泛利用[7]，既抗擴展又抗毒素積累[8-10]；Fhb2位于6BS染色體上，是一個抗擴展基因，定位在Xgwm133～Xgwm644區(qū)間內(nèi)[11-12]；Fhb5A是一個抗侵染基因，位于5A 染色體上[13]；Fhb7A位于第7染色體上，是一個抗擴展基因[14-15]，隨之又在7DL染色體上檢測到一個新的抗赤霉病基因QFhb.cau～7DL[16]；Fhb4與Fhb5是與抗侵染相關(guān)的QTL，分別在4BL與5AS的近著絲粒處，分別定位于Xhbg226～ Xgwm149與Xgwm304 ～ Xgwm415區(qū)間[17-18]。這些抗性QTLs為小麥抗赤霉病分子育種提供了抗性基因來源。

本研究利用單花滴注對107份小麥資源進行田間赤霉病抗性鑒定，并選取與抗性QTL穩(wěn)定緊密連鎖的分子標記，對供試品種進行抗病基因鑒定，探究其抗性水平與抗性類型，為利用分子標記輔助選擇(MAS)方法培育抗赤霉病小麥新品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選取黃淮麥區(qū)和長江中下游麥區(qū)小麥品種共107份(表1)，其中揚麥16與寧麥13作為中抗對照，淮麥20作為中感對照。蘇麥3號作為SSR分子標記的對照品種。

1.2 赤霉病抗性田間鑒定與評價

2017-2018年，將供試小麥材料于11月份在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合基地播種，順序排列，每個品種均種植2行，行長2 m，行距25 cm，每行60株。

赤霉病接種：于小麥揚花期，在穗中部小穗的第1朵小花內(nèi)，用微量進樣器注射10 μL分生孢子懸浮液(1×105個·L-1)接種赤霉病菌，每個株系接種20～30個穗子，然后用透明塑料袋將整個麥穗套住保濕，并掛上紙牌標明接種日期，保濕72 h后去掉塑料袋。

病情記載：單花滴注21 d后，調(diào)查接種穗子的病情嚴重度，計算病情指數(shù)。小麥赤霉病嚴重度分級按《小麥抗赤霉病評價技術(shù)規(guī)范》(NY/T 1443.4-2007)進行。

1.3 DNA提取

小麥種子在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)芽一周，每個品種隨機取10株幼苗，采用CTAB法[19]混合提取植物葉片總DNA，溶解于200 μL TE中，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SSR標記與PCR擴增

根據(jù)前人的研究結(jié)果，選取與小麥抗赤霉病QTL(Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5)相關(guān)的8個分子標記(Xumn10、XSTS3B～142；Xgwm133、Xgwm644；Xhbg226、Xgwm149；Xgwm304、Xgwm415)。上述引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

PCR反應(yīng)在Tong96G上進行，總體積為 10 μL，包括2.0 μL DNA模板(10 ng·μL-1)、2 pmol·μL-1引物1.0 μL，2×Taq PCR Master Mix(0.05 U·μL-1DNA Taq聚合酶，4 mM MgCl2和0.4 mM dNTPs)5 μL和2 μL ddH2O。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35次循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃恒溫保存。

1.5 指紋記錄

擴增后的PCR產(chǎn)物中加入TE緩沖液至 24 μL。將待檢測的進樣板置于離心機，1 000 r·min-1離心15 s，然后放入ABI 3130 XL DNA 測序儀中進行毛細管電泳。上機、參數(shù)設(shè)計、電泳等按儀器操作指南進行。用軟件PRO SIZE 2.0 收集原始數(shù)據(jù)，分析擴增片段峰型，讀取片段數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試小麥品種田間對赤霉病的抗性

接種21 d后調(diào)查結(jié)果顯示，小麥品種間具有不同的赤霉病抗性水平(表1)。對照中抗品種寧麥13和揚麥16的赤霉病嚴重度為0.70和 0.93，病情指數(shù)分別為17.39和23.15，對照中感品種淮麥20的赤霉病嚴重度為1.68，病情指數(shù)為41.96。供試品種嚴重度范圍為0.34～ 3.21，病情指數(shù)范圍為8.62～82.89，呈近正態(tài)分布(圖1)。病情指數(shù)最低為揚富麥101(8.62)，最高為機麥211(82.89)。

根據(jù)病情指數(shù)對供試小麥品種進行抗赤霉病分級結(jié)果(表2)顯示，供試品種中病情指數(shù)低于17.39(寧麥13的病情指數(shù))，大田表現(xiàn)抗病(R)的品種只有1份，占全部供試小麥的0.93%；病情指數(shù)高于17.39且低于32.00的中抗(MR)品種有12份，占全部供試品種的11.21%；中感(MS)品種21份，占全部供試品種的19.63%；大多數(shù)為感病品種，占供試品種68.22%。

篩選到的抗赤霉病(R)品種為揚富麥101(揚麥158//鎮(zhèn)麥7853/蘇肯1號)，可以作為抗性親本用于赤霉病抗性育種。12個中抗(MR)品種分別為寧麥13、寧麥資119、濮麥1165、揚麥16、寧麥資68、淮陰2016J025、淮陰2016J050、淮陰2016J068、淮陰2016J087、鄭品麥25、綠雨918、‘08-65’，表現(xiàn)為赤霉病病程進展緩慢，赤霉病抗性水平較高(圖2，A-B)；相比較而言，寧麥13、寧麥資119、揚麥16等來自淮南地區(qū)的品種抗性明顯優(yōu)于淮北品種，主要原因可能是長期育種選擇和抗病資源應(yīng)用的結(jié)果。從整體上看，中抗以上品種僅占12.15%，中感及感病材料占87.85%，安麥1350、洛麥27、懷川365、機麥211等來自淮北地區(qū)的品種病情指數(shù)極高，表現(xiàn)出嚴重的感病性(圖2，C-E)?；搓?016J025、淮陰2016J050、淮陰2016J068等沿淮地區(qū)新品系抗性得到一定程度改善。總體上，淮北地區(qū)小麥品種赤霉病抗性不強，需要加以改良。

2.2 供試小麥品種的抗赤霉病QTL位點鑒定

為了探究抗赤霉病的QTL位點是否存在于供試小麥品種，利用與赤霉病抗性位點連鎖的8個標記，對107份供試品種進行檢測，結(jié)果如圖3A、表3所示。

檢測到攜帶單個或多個赤霉病抗性基因的小麥品種共有52份，其中，攜帶單個抗性基因Fhb4或Fhb5的小麥品種數(shù)目最多，分別為15份和12份，分別占供試品種的14.02%和11.21%，表明這些小麥品種擁有位于4B或5A染色體的抗侵染性主效QTL位點；而攜帶單個抗擴展基因Fhb1或Fhb2的小麥品種分別有2份和7份；攜帶2個抗性基因(Fhb1+Fhb2、Fhb1+Fhb4、Fhb1+Fhb5、Fhb2+Fhb4、Fhb2+Fhb5、Fhb4+Fhb5)的小麥品種共有14份，占總供試小麥品種的13.08%；只有2份小麥品種攜帶3個抗性基因(Fhb2+Fhb4+Fhb5)，為淮陰2016J110、淮陰2016J106。

2.3 分子標記輔助選擇小麥抗性品種

為了解與抗性QTL位點緊密連鎖的分子標記與小麥赤霉病抗性關(guān)系，對攜帶不同抗性基因及其組合的小麥品種的田間抗病級別進行統(tǒng)計分析，結(jié)果如圖3B、表3所示。

表1 供試小麥品種(系)及赤霉病抗性鑒定結(jié)果

R：抗；MR：中抗；MS：中感；S：感。

R:Resistance; MR:Moderate resistance; MS:Moderate sensibility; S:Susceptibility.

圖1 供試小麥品種抗赤霉病病情指數(shù)分布

與不攜帶抗性基因的小麥品種相比，攜有單個或多個抗性基因的小麥品種的病情指數(shù)大多較低(圖3B)，降低的病情指數(shù)值范圍為0.61～ 24.53。其中攜有Fhb1、Fhb2及與Fhb1組合(Fhb1+Fhb2、Fhb1+Fhb4、Fhb1+Fhb5)的小麥品種，其病情指數(shù)均降低，降低值分別為 19.79、23.41、15.83、24.53和0.88，抗性基因效應(yīng)分別為36.08%、42.70%、28.87%、44.73%和1.61%；攜有單個抗侵染基因Fhb4的小麥品種病情指數(shù)降低了11.33，抗性基因效應(yīng)為20.66%。表明攜有赤霉病抗性基因的品種大多數(shù)對赤霉病有抗性。部分含抗性基因的小麥品種的病情指數(shù)下降不多，甚至還有所升高，如：Fhb5、Fhb2+Fhb4、Fhb2+Fhb5、Fhb2+Fhb4+Fhb5等組合(表3)。綜上所述，攜帶抗性基因Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb1+Fhb2、Fhb1+Fhb4、Fhb1+Fhb5的小麥品種可以作為抗性育種材料。

對抗性品種的抗譜研究發(fā)現(xiàn)，赤霉病抗性表現(xiàn)為R、MR和MS級別的品種都或多或少攜有抗性位點(表3)。如小麥品種揚富麥101病情指數(shù)為8.62，對赤霉病表現(xiàn)為抗病，其攜有Fhb1和Fhb4基因；對赤霉病抗性表現(xiàn)為中抗的品種，其嚴重度范圍0.70～1.28，病情指數(shù)范圍17.39～32.00，且這些中抗小麥品種均攜有單個或多個抗性基因，如淮陰2016J087 攜有Fhb1基因，寧麥13、寧麥資68攜有基因Fhb1+Fhb4等。表明揚富麥101、寧麥13、淮陰2016J087、寧麥資68 等抗性種質(zhì)可以作為抗性親本加以利用，并可利用與上述抗性QTL緊密連鎖的SSR標記進行分子標記輔助選擇。

表2 供試小麥品種的抗赤霉病分類

A：揚麥16；B:揚富麥101；C：淮核13068；D：安麥1350；E：機麥211。

A:Yangmai 16; B:Yangfumai 101; C:Huaihe13068; D:Anmai 1350; E:Jimai 211.

圖2 單花滴注接種后21 d穗子

Fig.2 Spikes of wheat on the 21st day after infection

抗性基因效應(yīng)=(攜帶抗性基因的品種的病性指數(shù)-不含抗性基因品種的病情指數(shù))/不含抗性基因品種的病情指數(shù)×100%

Effect of resistance genes=(DI of variety carrying resistance genes-DI of variety without resistance genes)/DI of variety without resistance genes×100%

圖3 攜帶單個或多個赤霉病抗性基因的小麥品種數(shù)目(A)和抗性基因效應(yīng)(B)

Fig.3 Number of wheat germplasm(A)and effect of resistance genes(B)corresponding to resistance genes

表3 小麥資源的赤霉病抗性QTL統(tǒng)計

3 討 論

隨著氣候和耕作栽培方式的變化，小麥赤霉病逐漸上升為黃淮麥區(qū)的主要病害。黃淮麥區(qū)目前育成和推廣的品種絕大多數(shù)沒有達到中抗水平，如在黃淮南片區(qū)域進行試驗的品種中，中抗品種僅有徐農(nóng)0029、西農(nóng)511和保麥6號，其余品種均為中感或高感品種[20-21]。因此在黃淮麥區(qū)篩選抗赤霉病資源，強化小麥抗病品種選育具有重要的現(xiàn)實意義。

至今為止，位于3B染色體上Fhb1基因是公認的用于赤霉病改良的優(yōu)異基因，在小麥抗赤霉病分子標記輔助選擇育種中得到了廣泛應(yīng)用[14,22-24]。張 鵬等[25]利用與Fhb1緊密連鎖的SSR標記Xgwm493、Xgwm533篩選到含有目標基因的品系。張 旭等[26]利用與抗擴展性、抗侵染性和控制低毒素積累的QTL位點緊密連鎖的分子標記，檢測到中抗品種寧麥9號擁有抗擴展性主效QTL位點Fhb1和Fhb2。張宏軍等[27]利用Fhb1基因的 KASP 標記對攜帶Fhb1基因的寧麥9號等抗性品種與高感品種周麥16矮敗小麥近等基因系構(gòu)建的回交群體進行基因型分析，發(fā)現(xiàn)回交后代中攜帶Fhb1的家系整體平均病小穗數(shù)低，平均病情指數(shù)低。本研究中，揚富麥101對赤霉病抗性最強，系譜追溯發(fā)現(xiàn)其抗性基因可能來自蘇麥3號和揚麥158。蘇麥3號高抗赤霉病，以其為抗性親本雖然創(chuàng)制了一批抗性較好的材料，但是其農(nóng)藝性狀較差，如植株過高、豐產(chǎn)性差，未能得到大面積使用。揚富麥101攜帶與蘇麥3號相同的抗性基因組合Fhb1+Fhb4，卻沒有蘇麥3號綜合農(nóng)藝性狀不佳的缺陷，可以作為新的抗性親本加以利用。

本研究發(fā)現(xiàn)，攜有Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb1+Fhb2、Fhb1+Fhb4、Fhb1+Fhb5、Fhb4+Fhb5抗性基因的小麥品種的病情指數(shù)較不攜帶抗性基因的品種分別降低36.08%、42.07%、20.66%、28.87%、44.73%、1.61%、1.11%，特別是攜有Fhb1及與Fhb1組合的小麥品種(Fhb1+Fhb2、Fhb1+Fhb4)的病情指數(shù)較低，如抗性品種揚富麥101(Fhb1+Fhb4)和中抗品種寧麥13、寧麥資68、淮陰2016J087均攜帶Fhb1基因(表3)，表明Fhb1及其抗性基因組合可以有效提高品種抗性，攜帶該抗性基因的材料可作為抗赤霉病的較好種質(zhì)。

在抗性育種過程中，分子標記便于篩選、跟蹤抗性基因，可以大大提高育種效率。小麥赤霉病抗性是受多基因控制的數(shù)量性狀[8-18]，在育種中聚合多個抗性基因，可以較快獲得攜有目標基因的育種材料。本研究也發(fā)現(xiàn)，部分分子標記陽性的材料抗性水平并不高(表3)，分析可能有以下幾種原因：分子標記與抗性基因之間存在一定的遺傳距離，發(fā)生了交換，即篩選僅得到的是標記而非基因，可以通過精細定位克隆相關(guān)抗性基因，選擇與抗性基因共分離的標記提高分子標記的精度；另一方面相關(guān)材料遺傳背景中可能存在促進病害發(fā)生的“感病”基因，基因間的互作，使抗性水平下降。本研究通過單花滴注接種，可以有效提高接種的成功率，但與小麥赤霉病的自然發(fā)生存在差異，不能有效區(qū)分品種間I型抗性的差異，所以在檢測Fhb4、Fhb5基因效應(yīng)時會存在一定的誤差。由于小麥赤霉病抗性是復(fù)雜的數(shù)量性狀，抗性受環(huán)境影響非常大，同時生育期、株高等品種特性也會對抗性產(chǎn)生影響，可以通過控制發(fā)病條件、增加對照和重復(fù)等手段來提高表型鑒定的精度。即使如此，本研究還是利用與抗性QTL緊密連鎖的分子標記檢測到小麥品種的抗性位點，并鑒定出攜有Fhb1和Fhb4基因的小麥抗病品種揚富麥101及攜有單個或多個抗性位點中抗級別小麥品種表明分子標記能夠快速鎖定抗性QTL，通過分子標記輔助選擇，可以較快獲得攜有目標基因的育種材料，大大提高育種效率。