鄧妙，張紅艷，王沖，劉元偉，盛祝梅，張治芬

目前復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）的診斷標(biāo)準(zhǔn)尚不統(tǒng)一，我國通常將3次或3次以上，在妊娠28周之前的胎兒丟失稱為RSA[1]。RSA病因復(fù)雜，近年來，免疫因素在RSA中的作用越來越受到重視。研究顯示，約50%的RSA存在免疫功能紊亂[2]。免疫因素包括自身免疫和同種免疫，其中同種免疫型RSA仍處于研究階段，被稱為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）。輔助性T細(xì)胞1型/輔助性T細(xì)胞2型（Th1/Th2）比例失衡與多種免疫性疾病有關(guān)，也是URSA的重要機(jī)制[3-5]。研究顯示，白細(xì)胞介素2基因[IL-2（rs6822844）]及其受體α[IL-2Ra（rs2104286）]單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化病、支氣管哮喘、1型糖尿病等多種Th1/Th2失衡性疾病有關(guān)[6-10]。然而，上述位點與URSA的相關(guān)研究目前未見報道。因此，本研究以中國浙江地區(qū)URSA患者為病例組，正常足月分娩的孕婦為對照組，分析2組患者上述位點等位基因和基因型頻率的分布差異，旨在探討IL-2（rs6822844）、IL-2Ra（rs2104286）與URSA的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年1月—2019年3月在杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院就診的URSA女性患者設(shè)為URSA組（145例），納入標(biāo)準(zhǔn)：URSA診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2016年中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科學(xué)分會產(chǎn)科學(xué)組標(biāo)準(zhǔn)[1]。夫妻均行染色體核型分析、血常規(guī)、C-反應(yīng)蛋白、生殖道分泌物解脲支原體、沙眼衣原體和淋球菌培養(yǎng)、艾滋病病毒抗體、梅毒特異性抗體、乙型肝炎病毒免疫學(xué)、弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒及其他病原微生物、生化、凝血功能、血黏度、性激素、甲狀腺功能、生殖道超聲檢查、抗磷脂抗體、抗核抗體檢查，男方行精液檢查，排除遺傳、感染、內(nèi)分泌、解剖、血栓前狀態(tài)、自身免疫、男方因素等的影響。另以隨機(jī)數(shù)字法選取同期來本院正常足月分娩的孕婦為對照組（220例），納入標(biāo)準(zhǔn)：本次正常足月分娩，既往無自然流產(chǎn)、異位妊娠、早產(chǎn)史，無妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓病史，無血栓栓塞、免疫性疾病及家族遺傳病史。2組患者均為浙江杭州地區(qū)漢族女性。URSA組年齡26～34歲，平均（29.68±2.35）歲，對照組年齡23～36歲，平均（29.12±3.54）歲，2組患者年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.805，P=0.072）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及DNA提取2組病例均空腹采集2 mL靜脈血，乙二胺四乙酸二鉀抗凝。用購自北京天根生化科技有限公司的全血基因組DNA提取試劑盒，按說明書操作，提取的DNA樣本放置-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因型測定應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR），擴(kuò)增引物由上海輝睿生物技術(shù)有限公司合成。引物序列及擴(kuò)增條件，見表1。反應(yīng)體系：50 μL反應(yīng)體系，10×PCR緩沖液（無Mg2+）5 μL，10 mmol/L dNTPs 4 μL，25 mmol/L Mg2+3 μL，10 μmol/L正反向引物各1 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶1 μL，基因組DNA 5 μL，加注射用水至總體積50 μL。由上海生工生物工程股份有限公司完成PCR產(chǎn)物測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析?；蛐秃偷任换蝾l率在群體中的代表性采用Hardy-Weinberg平衡檢驗；基因型、等位基因與URSA的相對風(fēng)險率OR的95%CI計算采用Miettinen法；2組基因型、等位基因頻率比較均采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 遺傳平衡檢驗 URSA組IL-2Rα（rs2104286）AA基因型頻率觀察值為88.62%，如符合Hardy-Weinberg遺傳平衡法則，AA基因型頻率=A等位基因頻率2，計算得A等位基因頻率期待值為88.66%，同理得G等位基因頻率期待值為11.75%。觀察值和期待值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.013，P=0.909），因此IL-2Rα （rs2104286） 基 因 型 頻 率 符 合Hardy-Weinberg遺傳平衡法則，見表2。

2.2 IL-2（rs6822844）基因型及等位基因頻率分析2組研究對象IL-2（rs6822844）等位基因均為G，基因型均為GG，均未發(fā)現(xiàn)SNPs分布，見圖1（后插一）。

圖1 IL-2（rs6822844）GG基因型測序圖

2.3 IL-2Rα（rs2104286）基因型及等位基因頻率分析 2組研究對象IL-2Rα（rs2104286）位點均存在SNPs分布，共檢測出3種基因型，分別為AA、AG、GG，見圖2（后插一）。URSA組A等位基因頻率（88.62%）高于對照組（79.09%），且A等位基因攜帶者URSA患病風(fēng)險是G等位基因攜帶者的2倍（OR=2.06，95%CI：1.34～3.16，P=0.001）。URSA組AA基因型頻率（78.62%）高于對照組（61.81%），且AA基因型較AG+GG基因型URSA患病風(fēng)險增加約1倍（OR=2.27，95%CI：1.40～3.68，P=0.001），見表3。

圖2 IL-2Rα（rs2104286）3種基因型測序圖

3 討論

目前RSA的診斷標(biāo)準(zhǔn)尚不統(tǒng)一，與我國中華醫(yī)學(xué)會對RSA的定義不同，美國生殖醫(yī)學(xué)會將2次或2次以上的妊娠失敗定義為RSA[11]，英國皇家婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會的標(biāo)準(zhǔn)則為同一性伴侶連續(xù)3次或3次以上24周前的胎兒丟失[12]。美國生殖醫(yī)學(xué)會的指南同時指出，生育年齡女性2次或2次以上自然流產(chǎn)率約5%，3次或3次以上自然流產(chǎn)率約1%[11]。RSA給患者身心健康、家庭穩(wěn)定、社會醫(yī)療支出等造成了嚴(yán)重影響。RSA病因復(fù)雜，主要包括遺傳、內(nèi)分泌、感染、解剖、自身免疫性疾病、血栓前狀態(tài)、全身性疾病及環(huán)境影響等，但仍有半數(shù)的RSA病因不明，被稱為URSA，又稱同種免疫型RSA。目前認(rèn)為，URSA與封閉抗體缺乏、NK細(xì)胞數(shù)量和活性異常及Th1/Th2細(xì)胞因子異常密切相關(guān)[1]。

表1 引物序列及擴(kuò)增條件

表2 IL-2Rα（rs2104286）Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

表3 IL-2Rα（rs2104286）等位基因和基因型頻率分布

Th1和Th2型細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的兩個功能亞群，根據(jù)分泌不同的細(xì)胞因子區(qū)分。Th1型細(xì)胞主要分泌IL-2、干擾素（IFN）和腫瘤壞死因子（TNF），促進(jìn)炎性反應(yīng)和細(xì)胞免疫、直接或間接地?fù)p傷胎盤，對胚胎起免疫損傷作用；Th2型細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5和IL-10，介導(dǎo)B細(xì)胞增殖、抑制巨噬細(xì)胞分泌炎性因子、維持同種免疫耐受狀態(tài)，對胚胎起免疫保護(hù)作用。正常母胎界面以Th2型細(xì)胞因子占優(yōu)勢，若Th1/Th2型細(xì)胞因子平衡向Th1偏移可導(dǎo)致不良妊娠[13-14]。細(xì)胞因子的合成受遺傳因素影響，細(xì)胞因子基因多態(tài)性主要為微衛(wèi)星基因多態(tài)性和SNPs。其中SNPs是指基因組DNA由于單個核苷酸（A、T、C、G）的改變引起的DNA序列變化，從而造成不同物種間或人體內(nèi)基因的多樣性。SNPs具有遺傳高穩(wěn)定性、高信息量和檢測方法多樣性的優(yōu)點，在病例對照相關(guān)分析中被廣泛應(yīng)用。Aslebahar等[15]的Meta分析納入了29個病例對照研究，結(jié)果顯示TNF-α-308 SNP位點GG基因型RSA的發(fā)病風(fēng)險是AA基因型的1.76倍（OR=1.76，95%CI：1.21～2.43，P=0.002）。進(jìn)一步分層分析顯示，亞洲人種攜帶GG基因型RSA發(fā)病風(fēng)險更高（OR=2.19，95%CI：1.47～3.27，P＜0.001）。Ma等[16]對中國漢族人群的研究顯示IFN-γ-874 SNP位點A/T等位基因及基因型與URSA無相關(guān)性。IL-2是Th1型細(xì)胞分泌的另一重要細(xì)胞因子，同時IL-2又能誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞分化增殖，從而相互促進(jìn)。IL-2通過與細(xì)胞膜上的IL-2R結(jié)合發(fā)揮作用，IL-2R有3個亞單位，分別為IL-2Rα鏈（CD25）、IL-2Rβ 鏈（CDl22）和IL-2Rγ鏈（CDl32）[17]。研究顯示，IL-2（rs6822844）、IL-2Rα（rs2104286）與多種Th1/Th2失衡性疾病相關(guān)[6-10]。然而，上述位點與URSA的相關(guān)性研究目前未見報道。

本研究以浙江地區(qū)145例URSA患者為病例組，220例正常分娩人群為對照組。結(jié)果顯示，2組研究對象IL-2（rs6822844）等位基因均為G，未發(fā)現(xiàn)SNP分布，究其原因可能與人種及地域相關(guān)。Louahchi等[6]的研究顯示IL-2（rs6822844）A等位基因與阿爾及利亞馬格里布地區(qū)摩洛哥人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病密切相關(guān)（OR=2.57，95%CI：1.74～3.83，P=0.001）。但鄭緒陽等[8]在分析IL-2基因多態(tài)性與浙江地區(qū)漢族兒童支氣管哮喘的關(guān)聯(lián)時發(fā)現(xiàn)，IL-2（rs6822844）等位基因也均為G，未發(fā)現(xiàn)SNP分布。本研究顯示，URSA組IL-2Rα（rs2104286）A等位基因和AA基因型頻率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。且A等位基因攜帶者URSA患病風(fēng)險是G等位基因攜帶者的2倍，AA基因型較AG+GG基因型URSA患病風(fēng)險增加約1倍。提示IL-2Rα（rs2104286）A等位基因可能是浙江地區(qū)URSA的遺傳易感基因。人IL-2R位于第10號染色體短臂上（10p14.15），由8個外顯子和7個內(nèi)含子構(gòu)成，IL-2Rα（rs2104286）位于該基因第一個內(nèi)含子內(nèi)，提示rs2104286可能是一個功能性位點[17]。Wang等[18]的Meta分析顯示，IL-2Rα（s2104286）A等位基因分別與白種人（OR=1.19，95%CI：1.13～1.25，P＜0.001）和亞洲人（OR=1.25，95%CI：1.01～1.55，P=0.041）多發(fā)性硬化癥風(fēng)險增加有關(guān)。Tang等[19]的Meta分析共納入了19項獨(dú)立研究、23 528個樣本，結(jié)果顯示IL-2Rα（rs2104286）A等位基因與1型糖尿病的發(fā)病相關(guān)（OR=1.24，95%CI：1.17～1.30，P＜0.001）。鄭緒陽等[8]的研究也顯示，IL-2Rα（rs2104286）A等位基因與浙江地區(qū)漢族兒童支氣管哮喘發(fā)病相關(guān)（OR=1.708，95%CI：1.11～2.63，P=0.01）。因此，我們認(rèn)為IL-2Rα（rs2104286）A等位基因可能是多種免疫性疾病共同的易患基因。

URSA的治療方案包括子宮內(nèi)膜干細(xì)胞樣細(xì)胞治療、免疫細(xì)胞和免疫球蛋白灌注治療、粒細(xì)胞集落刺激因子治療、環(huán)孢素、糖皮質(zhì)激素、TNF-α和維生素D等，目前研究主要集中在淋巴細(xì)胞免疫治療和靜脈注射丙種球蛋白，但對其療效目前仍有爭議[12,20-21]。Chen等[20]的研究顯示，與常規(guī)黃體酮保胎的URSA患者相比，淋巴細(xì)胞主動免疫治療組流產(chǎn)率明顯降低，妊娠成功率明顯升高（2組妊娠率分別為89.7%和32.2%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。但英國皇家婦產(chǎn)科協(xié)會的指南指出，淋巴細(xì)胞主動免疫治療及靜脈注射丙種球蛋白等免疫療法并不顯著提高RSA患者的活產(chǎn)率[12]。因此，新的、有效的URSA免疫治療方案仍待探索。鄭緒陽等[8]的研究同時顯示，IL-2Rα（rs2104286）AA基因型個體外周血IL-2Rα mRNA相對表達(dá)量以及血漿IL-2Rα水平均高于AG基因型（Z分別為－2.029和－2.361，P=0.043和0.018），提示IL-2Rα（rs2104286）AA基因型同時影響了其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而升高了浙江地區(qū)漢族兒童支氣管哮喘的發(fā)病率。研究顯示，IL-2Rα（CD25）單克隆抗體在多種免疫性疾病的治療中發(fā)揮作用。陶濤等[22]研究CD25單抗治療異基因造血干細(xì)胞移植后合并糖皮質(zhì)激素耐藥型急性移植物抗宿主病的效果，結(jié)果顯示治療總有效率達(dá)75.0%，其中完全緩解率達(dá)52.5%。Tang等[23]的研究顯示，CD25單抗可以通過抑制CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增強(qiáng)日本血吸蟲疫苗的保護(hù)作用。CD25單抗的作用機(jī)制主要包括促進(jìn)T細(xì)胞有絲分裂、增強(qiáng)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的殺傷功能及輔助抗體生成[22-24]。目前未見CD25單抗用于URSA治療的報道，結(jié)合上述研究，我們認(rèn)為CD25單抗可以作為治療URSA的一個潛在方案進(jìn)一步研究。

綜上所述，IL-2Rα（rs2104286）A等位基因可能是浙江地區(qū)URSA 的遺傳易感基因，IL -2（rs6822844）基因多態(tài)性與浙江地區(qū)URSA無相關(guān)性。今后有必要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本含量，開展多中心臨床研究，綜合分析IL-2Rα、IL-2Rβ 和IL-2Rγ SNPs、單倍型及單倍型組合與URSA發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性，進(jìn)而進(jìn)行基因功能研究和免疫治療安全性、有效性研究，探討URSA發(fā)病的遺傳因素和分子機(jī)制，為臨床診斷、預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。