余利星　翟睿　龔曉云　謝潔　黃澤建

摘 要 DNA四面體納米材料具有較高的穩(wěn)定性、良好的生物相容性及易于修飾等優(yōu)點，在生物傳感器、藥物輸送、生物成像和分離分析等領域得到了廣泛的研究與應用。研究人員采用不同的設計方法，將特異性功能分子修飾在DNA 四面體頂點、DNA 四面體籠狀結構內部、DNA雙螺旋結構內部和DNA四面體邊臂等位置，從而將DNA四面體的優(yōu)勢與修飾分子的特異性功能有機結合，實現(xiàn)DNA四面體材料的功能化。本文回顧了DNA納米技術的發(fā)展歷程，介紹了DNA四面體納米材料的4種不同的功能化修飾方法及其研究應用現(xiàn)狀，并展望了未來的發(fā)展趨勢。

關鍵詞 DNA納米技術; DNA四面體; 功能化; 評述

1 引 言

DNA是由4種脫氧核苷酸組成的生物大分子，作為遺傳信息的載體存在于細胞核內。1953年， Watson和Crick首次提出DNA雙螺旋結構[1]。此后，能夠進行高精確度堿基互補配對的DNA引起了研究者的關注，并逐漸在醫(yī)學、遺傳學、生態(tài)學等領域得到應用。納米材料具有獨特的電學、光學和磁學等特性，在家電、醫(yī)藥、環(huán)境保護、紡織工業(yè)等領域廣泛應用。DNA可根據(jù)堿基互補配對的原則進行自組裝，空間結構具有較高的可控度和精密度[2]，故易于組裝成多種形態(tài)的DNA納米材料，表現(xiàn)出許多獨特的優(yōu)點：（1）基于DNA組成的納米材料易穿透帶負電的細胞膜[3]; （2）相較于其它納米材料普遍具有細胞毒性的問題，DNA納米材料幾乎沒有細胞毒性[4]; （3）該類材料能較好地抵抗核酶作用，具有高穩(wěn)定性; （4）該類材料功能化修飾位點豐富[5]，可根據(jù)不同需要修飾生物分子或熒光染料等。目前，以DNA為基礎元件的DNA納米技術備受關注[6]。 Raniolo等[7]用葉酸功能化的DNA八面體納米籠分析了兩種不同內化途徑介導的細胞攝取過程; Liu等[8]設計了DNA納米探針，用于細胞實時成像，并分析了線粒體中Ca2+及pH值的變化; Zhu等[9]通過在DNA納米結構邊緣結合對pH敏感的i-motif序列，構建了可逆運輸水和鐵氰化物的動態(tài)三維DNA納米泵; Man等[10]將DNA納米技術和正反饋化學反應相結合，實現(xiàn)了活性手性等離子體分子的自組裝。

相比較經(jīng)典且最簡單的多面體，DNA四面體納米材料可通過簡單的自組裝法合成。目前，一些綜述文章也介紹了DNA四面體納米材料及其應用進展。如Xie等[11]從生物傳感器和藥物輸送兩個方面回顧和總結了DNA四面體納米材料在活細胞研究中的發(fā)展和應用; Wang等[12]綜述了3種（1D、2D和3D）DNA納米結構在疾病診斷和治療方面的生物應用現(xiàn)狀; Su等[13]對基于框架核酸（Framework nucleic acids，F(xiàn)NA）的生物傳感器在電化學檢測、光學檢測和細胞內傳感等方面應用的最新研究進展進行了闡述。為了更好地發(fā)揮DNA四面體納米材料的優(yōu)勢，常需將DNA四面體納米材料與特異性功能分子相結合。本文針對DNA四面體納米材料的不同功能化方法及其應用進行了綜述。

2 DNA納米技術的發(fā)展歷程及其合成和表征方式

2.1 DNA納米技術的發(fā)展歷程

1982年，紐約大學Seeman教授[14]發(fā)表了“結構納米技術”的構想，提出不同于常規(guī)的線狀雙鏈DNA的十字叉狀的Holiday結構。1983年，該團隊設計出Holiday結構，并將其稱為“四臂結”（Immobile nucleic acid junctions）[15]。1993年，F(xiàn)u等[16] 改進了“四臂結”結構，形成了一種更加穩(wěn)定的Double crossover（DX）結構。1998年，Winfree等[17]首次使用DX為結構基元組裝出了二維平面網(wǎng)格結構，并使用原子力顯微鏡進行了證實。2006年，Rothemund等[18]開發(fā)了一種新的DNA自組裝技術，稱為DNA折紙術。利用此技術，Qian等[19]設計出了三角形、矩形、五角星和笑臉等多種DNA納米結構，以及不對稱圖形“中國地圖”的組裝。Andersen等[20]通過將其應用到動態(tài)結構中，設計出了尾巴可擺動的“海豚”等形狀。賈思思等[21]提出了“DNA 折紙術納米反應器”的概念，對DNA 折紙術的調控組裝做出了更進一步的探討研究。2017年，Tikhomirov等[22]采用分層組裝的方法獲得了尺寸可控的DNA納米結構，實現(xiàn)了不同圖案的大尺寸DNA折紙的自組裝。

根據(jù)材料性質及用途， 納米結構通常有“自上而下”和“自下而上”兩種組裝方法?！白陨隙隆钡姆椒ㄊ侵竿ㄟ^光刻、研磨、腐蝕等刻蝕技術將較大尺寸（μm～cm級）的材料制備成目標尺寸的納米結構，該技術統(tǒng)稱為納米刻印技術，其原理是在制備過程中，將單個納米構筑單元放置在特定圖形的位置上，通過相關技術便捷地制備出各種目標形貌的材料[23]。 如以掃描隧道顯微鏡為基礎的刻印技術[24]和以原子力顯微鏡為基礎的刻印技術[25]?！白韵露稀钡姆椒ㄊ菍⒁恍┹^小的、簡單的結構單元（如原子、分子、納米粒子等）通過相互作用力自組裝形成相對較大且復雜的納米級結構[26]，無需人工干預。

近年來，隨著DNA納米技術的快速發(fā)展，研究人員采用“自下而上”的自組裝方法，合成了多種形狀和大小各異的DNA納米材料。相比較經(jīng)典且最簡單的多面體，DNA四面體可通過簡單的自組裝法合成，具有較強的穩(wěn)定性、較低的細胞毒性、結構位點易于修飾等優(yōu)點，被廣泛應用于生物傳感器[27，28]、基因載體[29]和藥物輸送[30，31]等領域。

2.2 DNA四面體納米結構的合成及表征

DNA四面體是由4條相互配對的單鏈DNA構成，通常，需設計4條單鏈DNA的堿基序列，每條單鏈DNA的堿基數(shù)均分成3個小片段，每條單鏈的1個小片段與另一條單鏈的1個小片段互補雜交， 形成DNA四面體的1條邊（圖1）。每條單鏈DNA的5'和3'端交匯于四面體的頂點或在邊上形成1個端口。交匯于頂點時，可在DNA單鏈的5'或3'端修飾特異性功能分子，實現(xiàn)DNA四面體功能化; 交匯于端口處時，可使用DNA連接酶將端口連接，也可用功能分子進行修飾[32]。同時，為了使形成的DNA四面體相鄰的兩條邊都具有一定的夾角，保證DNA四面體結構能正確形成且具有一定的穩(wěn)定性，每條單鏈DNA相鄰的兩個小片段之間，均含有1個或2個不與其它任何序列配對的堿基[33]。根據(jù)堿基互補配對的原則，將合成的4條單鏈DNA等量加入到緩沖液中，通過一步退火操作，4條單鏈即可自動互補雜交形成具有四面體形狀的DNA 三維結構[34，35]。

由于DNA四面體堿基數(shù)量與結構形狀均發(fā)生了較明顯的變化，聚丙烯酰胺凝膠電泳可將相差數(shù)個或數(shù)十個堿基的DNA分離[36]。在聚丙烯酰胺凝膠電泳的實驗中，DNA四面體移動的速度比其它結構的DNA慢，因此可通過樣品對應的條帶位置對其進行表征[37]; 高分辨透射電子顯微鏡（High resolution transmission electron microscope，HRTEM）可對DNA四面體的形態(tài)進行表征[35]; 此外，也可以采用原子力顯微鏡觀察合成的DNA四面體[38，39]。

3 DNA四面體的功能化及其應用

根據(jù)功能基團或分子在 DNA 四面體的修飾位置，其修飾方式主要可分為以下4種：頂點型、膠囊型、鑲嵌型和懸臂型[40]（圖2）[29，41～43]。功能化的DNA四面體由于兼具DNA四面體和特異性功能分子的優(yōu)點，在生物傳感器、藥物輸送、生物成像等領域應用廣泛。

3.1 頂點型修飾的DNA四面體納米結構的應用

頂點型修飾是指將功能分子結合在DNA四面體的頂點[40]，如使DNA 四面體的3個頂點處為巰基基團，利用AuS鍵和DNA四面體具有穩(wěn)定的金字塔三維結構的性質，可將DNA四面體納米材料較穩(wěn)定地固定在金表面[41，44]。此外，也可根據(jù)實驗需要，在DNA四面體的頂點處修飾用于分子識別的生物活性分子或特異性序列[45]。

合成這類修飾的DNA四面體結構過程中，常在單鏈DNA的5'或 3'端修飾生物活性分子或特異性序列，使4條單鏈DNA的兩端交匯于四面體的頂點處，然后將設計好的4條單鏈DNA等量加入緩沖液中，通過一步退火雜交， 組合形成DNA 四面體。

microRNAs（miRNAs）是診斷早期胃癌的生物標志物，對其高靈敏地檢測有助于胃癌的早期診斷、治療及預后評估。Qu等[46]設計開發(fā)了一種基于框架核酸的微陣列，用于分析多種miRNAs。通過框架核酸頂點處的氨基基團可將探針固定在醛基修飾的玻璃毛細管內表面，然后向玻璃毛細管中加入待測定的miRNAs，使之與固定的FNA探針結合。最后，通過雜交鏈式反應（Hybridization chain reaction， HCR）增強熒光信號，實現(xiàn)低濃度（100 fmol/L）miRNA的測定（圖3）。與微陣列相類似，Qu等[47]設計出一種基于適配體修飾的DNA納米材料，用于納升或皮升體積液滴中目標物的分析。此外，Qu等[48]設計了一種新型DNA納米結構微陣列（DNA nanostructured microarray， DNM），通過DNM可敏感快速地選擇性檢測多種重金屬離子。

Wang等[49]將修飾后的單鏈DNA經(jīng)雜交形成DNA四面體的6條邊，使3個氨基基團與1個側鏈探針位于DNA四面體頂點。通過氨基基團與環(huán)氧基團之間的反應，將DNA四面體固定在載玻片上。然后，他們利用懸垂的探針捕獲目標DNA序列，使捕獲探針、目標DNA序列和生物素修飾的檢測探針形成“三明治”結構。最后，通過生物素與鏈霉親和素修飾的量子點結合，利用落射熒光顯微鏡得到的熒光點進行DNA計數(shù)。

金屬絡合藥物在細胞核中具有抗癌能力，在臨床治療方面有重要作用。然而，由于核膜的屏障作用，細胞質中的藥物只有1%～5%可擴散到細胞核[50]。為提高藥物進入細胞核中的劑量，具有生物相容性和易于修飾性的DNA折紙術受到了研究者的廣泛關注。為避免在化學改性過程中引起的DNA變性，Tian等[51]采用一步法將粘蛋白1（Mucin 1，MUC1）和適配體AS1411分別連接到DNA單鏈的5'末端，制備了一種基于雙靶向DNA四面體的抗癌金屬絡合物（[Ir（ppy）2phen]+PF6）運輸材料（Apts-DNA@Ir）（圖4）。結果表明，材料與人膠質瘤細胞U251孵育4 h期間，Apts-DNA@Ir逐漸進入細胞核，但游離的IrPP很難進入細胞核。這種雙靶向設計的DNA納米材料可較好地突破金屬絡合藥物難以擴散到細胞核的瓶頸，為高效精確的膠質瘤治療提供了新方法。

3.2 膠囊型修飾的DNA四面體納米結構的應用

膠囊型修飾是指將功能化修飾的分子包裹在DNA四面體的籠狀結構內[40]。Li等[52]提出一種將金納米粒子（AuNP）封裝在DNA四面體籠狀結構內部，從而組裝金納米粒子簇的方法。他們首先將硫醇修飾的兩種單鏈DNA（綠色與藍色表示）修飾到AuNPin上，通過DNA單鏈（綠色）與DNA四面體（DNA tetrahedron，TET）的單鏈末端（紅色表示）雜交，將AuNPin包裹在DNA四面體中（AuNPin@TET）。然后，將另一組AuNPout修飾與DNA單鏈（藍色）互補的巰基化DNA單鏈（灰色），通過灰色DNA單鏈與藍色DNA單鏈雜交形成一種新型DNA四面體納米材料。 1個AuNP在材料籠內，4個AuNPs分別位于四面體每個面的中心（類似于甲烷結構，圖5）。該工作制備了具有類似甲烷結構的新型金納米粒子簇，為金屬納米簇的制備提供了新方法。

利用DNA四面體中心的空腔，可將一些納米尺度大小的物質包封在DNA四面體內，如包裹有細胞色素C的DNA四面體可調控凋亡酶激活因子（Apaf-1）的進入，當Apaf-1與細胞色素C形成復合物后， 可啟動凋亡蛋白酶級聯(lián)反應[53]。Erben等[42]自組裝制備了DNA四面體，其中心腔可容納半徑約2.6 nm的球體。他們將細胞色素C結合到一條寡核苷酸的5'末端，通過改變該寡核苷酸的序列，可調控細胞色素C相對于DNA四面體的位置（內部或外部）。這種設計可能應用于蛋白質功能的調節(jié)。

Zhou等[54]利用包裹有AuNPs的DNA四面體為單體，制備出更大尺寸的DNA四面體樹突狀大分子。通過將AuNPs替換成相應的抗原，利用這種DNA四面體樹枝狀大分子-金納米粒子共軛的方法，在癌癥治療[55]和免疫治療[56]方面具有良好的應用前景。

3.3 鑲嵌型修飾的DNA四面體納米結構的應用

鑲嵌型修飾是指將功能化分子或基團通過共軛的方法鑲嵌在DNA四面體雙螺旋結構的內部[40]。如為了進行生物成像分析或對DNA四面體納米材料輸送途徑的分析，往往利用鑲嵌型功能化的方法，將熒光標記的生物分子或染料劑鑲嵌在DNA四面體雙螺旋結構的內部[57，58]。鑲嵌型修飾在輸送抗癌藥物的方面也具有廣泛的應用[60]。將抗癌藥物嵌入DNA四面體的邊上，利用其能獨立地穿過帶負電的細胞膜、幾乎沒有細胞毒性等優(yōu)點，將抗癌藥物最大量的帶入目標細胞，有效提高藥物使用率的同時，也能較大限度地降低其對人體負面作用的影響。

游離的阿霉素（Doxorubicin，Dox）進入目標細胞的量比較少，對耐藥細胞幾乎沒有細胞毒性[59]，Dox與DNA四面體納米材料結合，能較大量地進入目標細胞，對耐藥細胞具有較大毒性。將DNA四面體用于遞送Dox進入抗藥性乳腺癌細胞，可較好地克服靶細胞耐藥性的問題。Kim等[60]為了將Dox嵌入到DNA四面體雙螺旋結構的內部，將Dox與DNA四面體（DNA tetrahedron，Td）一起孵育（Dox@Td），未負載上的Dox通過G25凝膠過濾除去。通過計算，每個Td上加載了約26個Dox分子。實驗結果表明，Dox@Td作為藥物運輸系統(tǒng)，可明顯抑制耐藥細胞的生長，如在臨床上作為克服癌細胞耐藥性的藥物運輸載體，具有很好的應用前景。

MUC1在大多數(shù)腺癌中過度表達，是癌癥治療的重要分子靶點[61～63]。Dai等[64]將可識別MUC1的適配體（Aptamer，Apt）和可負載Dox的DNA四面體（Td）結合，建立了一種靶向藥物輸送系統(tǒng)（Apt-Td-Dox）（圖6）。藥物負載實驗顯示，每個Apt-Td復合物約可攜帶25個Dox分子，利用DNA四面體的特性，最大量地將Dox遞送到MUC1陽性乳腺癌細胞中。與體外MUC1陰性對照細胞相比，負載有Dox的Apt-Td對MUC1陽性癌細胞表現(xiàn)出更高的細胞毒性（p<0.01）。因此，他們提出Apt-Td有可能成為靶向治療MUC1表達的乳腺癌有效藥物的載體。

在功能化納米材料具有靶向藥物傳遞能力的基礎上，Liu等[65]通過在納米載體材料中加入具有熒光特性的探針，實現(xiàn)了細胞膜上MUC1蛋白的成像分析，以區(qū)分MUC1陽性細胞和MUC1陰性細胞。他們構建了由負載有Dox的DNA四面體（Td）、MUC1適配體探針和AS1411適配體組成的納米載體材料（MUC1-Td-AS1411）。當AS1411適配體選擇性地與核仁蛋白結合后，納米載體材料進入細胞核并將Dox釋放到細胞核中。相較于游離的Dox，負載在MUC1-Td-AS1411的Dox對MUC1陰性HL-7702細胞顯示出較低的細胞毒性（p<0.01），對敏感的MCF-7細胞具有近似相同的效果 （p>0.05），而對耐阿霉素MCF-7細胞則表現(xiàn)出更好的殺傷效果（p<0.01）。

Li等[66]通過雜交，將作為信號指示劑的CdTe量子點（Quantum dots ，QDs）與DNA四面體結合，大量亞甲藍（Methylene Blue，MB）作為信號增強子鑲嵌進入DNA四面體的邊緣雙鏈中，建立了具有接近零背景噪聲的光電（Photoelectrochemical，PEC）生物傳感器（圖7）。該傳感器對于microRNA-141（miRNA-141）具有較寬的檢測范圍（50 amol/L～50 pmol/L），檢出限為17 amol/L。

為了高靈敏檢測人體IgG，Ding等[67]通過抗原（Ag）將鏈霉親和素連接的抗人IgG抗體（SA-Ab）固定在硅烷化玻璃板表面，然后通過生物素和鏈霉親和素的特異性反應將頂點含有生物素的DNA四面體附著到SA-Ab上，最后將熒光染料SYBR Green I插入到DNA四面體納米結構中。利用落射熒光顯微鏡與電子倍增電荷耦合器對該材料進行熒光成像分析（圖8）。

通過對熒光斑逐一計量得出人IgG分子的數(shù)量。進一步實驗表明，當人IgG的濃度在3.0×10^-14～1.0×10^-12mol/L范圍時，圖像上的熒光斑點數(shù)量與人體IgG的濃度呈現(xiàn)出較好的線性關系。

3.4 懸臂型修飾的DNA四面體納米結構的應用

懸臂型修飾是指將功能化分子或基團懸掛在DNA四面體結構的邊臂上[40]。如通過設計4條單鏈DNA的堿基序列，使單鏈DNA的5'和3'端交匯點處于DNA四面體納米結構的邊上（中間或其它非頂點處），其中未進行互補配對的5'或3'端向外延伸用于功能分子的修飾[29，31]。

端粒酶的活性在正常細胞中受到嚴密調控，但是在大多數(shù)惡性腫瘤細胞中，其活性會被重新激活，從而可能參與腫瘤細胞的惡性轉化過程[68，69]。因此，端粒酶活性的監(jiān)測對癌癥的診斷和治療具有重要意義。為了避免使用電流探針測定細胞內端粒酶活性時受到假陽性結果干擾，Meng等[70]提出一種新的熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）的方法用于監(jiān)測細胞內端粒酶活性。他們設計了由DNA四面體和Flare DNA構建成的DNA納米探針。由于有活性的端粒

酶可催化DNA延伸，改變DNA納米探針的結構，導致標記的兩個熒光團之間距離增加，從而顯著降低FRET的效率（圖9）。他們通過該方法制備的比率傳感器可用于單細胞水平的端粒酶活性檢測。此外，該方法還可進一步用于端粒酶抑制劑的檢測，有助于發(fā)現(xiàn)新的抗癌藥物。

Lee等[29]自組裝了具有明確大小的DNA四面體，其可將siRNAs遞送到細胞中沉默腫瘤相關靶基因。他們首先設計了6條3'末端具有互補懸垂的DNA單鏈，然后通過自組裝法獲得DNA四面體納米材料，其中，四面體的每條邊中間懸出未互補配對的序列，用于連接siRNA序列。最終，siRNA通過固載在 DNA四面體上進入細胞內部。

Charoenphol等[31]將DNA四面體納米材料設計出多個懸垂部分，作為結合靶向配體的位點。已有研究證實，核酸適配體AS1411具有抑制腫瘤細胞增殖的作用[71，72]，故將AS1411適配體修飾到DNA四面體的懸垂部分。實驗結果顯示，修飾有AS1411的DNA四面體納米材料可在24小時內抑制HeLa細胞的生長，而且其高效的選擇性對非癌細胞系生長幾乎沒有任何不利影響。該方法為基于DNA四面體為媒介物輸送多種生物活性分子，實現(xiàn)協(xié)同治療提供了參考。

4 總結與展望

功能化的DNA四面體納米材料具有自組裝簡單、機械性能穩(wěn)定、生物相容性能好、不易被核酶降解等優(yōu)點，在生物傳感器、分離分析、生物成像和藥物輸送等方面表現(xiàn)出良好的應用前景。功能化的DNA四面體納米材料易于構建成特異性富集材料， 實現(xiàn)復雜體系中目標物質的分離與定性分析。然而，由于無法獲得材料捕獲目標物質的確切含量，功能化的DNA四面體納米材料在定量分析方面還存在一些困難。在生物診療領域，目前以DNA四面體納米材料進行的相關體內實驗仍主要選用小鼠為實驗對象，在進行人體體內相關實驗之前仍面臨許多挑戰(zhàn)。首先，DNA四面體納米材料進入細胞后，會進入溶酶體[73]， 這是否最終影響它們的使用效果，目前仍不明確。此外，用于功能化修飾DNA四面體納米材料的生物活性分子、熒光染料和探針等在進入體內后是否產(chǎn)生其它不良影響，仍需進一步研究。

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Progress in DNA Tetrahedral Nanomaterials and

Their Functionalization Research

YU Li-Xing1， 2， ZHAI Rui2， GONG Xiao-Yun2， XIE Jie2， HUANG Ze-Jian2， LIU Mei-Ying2，

JIANG You2， DAI Xin-Hua2， FANG Xiang*2， YU Xiao-Ping

1（College of Life Sciences， Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection & Quarantine，

China Jiliang University， Hangzhou 310018， China）

2（Mass Spectrometry Engineering Technology Research Center， Center for Advanced Measurement Science，

National Institute of Metrology， Beijing 100029， China）

Abstract DNA tetrahedral nanomaterials have been widely used in the fields of biosensors， drug delivery， bioimaging and separation analysis because of their high stability， good biocompatibility and easy modification. Through different designs， specific functional molecules can be modified at DNA tetrahedral vertices， DNA tetrahedral cage structures， DNA double helix structures， or DNA tetrahedron arms. The advantages of the materials are well combined with the specific functions of the active molecules. This paper first reviewed the development of DNA nanotechnology， and then introduced four different functional modifications of DNA tetrahedron nanomaterials and their research status.

Keywords DNA nanotechnology; DNA tetrahedron; Functionalization; Review