劉婭　張博

摘 要 親水相互作用色譜（HILIC）與反相色譜（RPLC）是目前常用的二維液相色譜分離模式，但兩種色譜模式存在流動(dòng)相不兼容的問題， 因而對二維液相色譜聯(lián)用過程中的樣品轉(zhuǎn)移技術(shù)提出了較高的要求。 本研究建立了一種可用于HILIC-RPLC二維液相色譜的樣品轉(zhuǎn)移技術(shù)，通過溶劑補(bǔ)充稀釋和捕集柱富集的方法解決了二維液相色譜聯(lián)用過程中溶劑不兼容的問題。通過對補(bǔ)充液的流速進(jìn)行優(yōu)化，可將第一維HILIC分離的有機(jī)相比例降至5%以下，實(shí)現(xiàn)高達(dá)95%的樣品轉(zhuǎn)移效率。將此技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)酶解物的二維色譜分離，理論峰容量可達(dá)680，而且峰容量可隨第一維采樣頻率的增加而增大，表明此技術(shù)可用于復(fù)雜樣品的高分辨分離分析。

關(guān)鍵詞 二維液相色譜; 親水相互作用色譜; 反相色譜; 樣品轉(zhuǎn)移; 峰容量

1 引 言

二維分離技術(shù)是解決復(fù)雜體系分離與分析最有前景的手段之一，可有效提高色譜分離的選擇性和峰容量[1]。二維分離的概念最早由Giddings提出[2]，該方法通過耦聯(lián)兩種不同的色譜分離模式，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品的充分分離。二維色譜的理論峰容量是兩個(gè)維度色譜分離峰容量的乘積[3]，可分為在線和離線聯(lián)用兩種模式[4]。為了有效增加二維液相色譜分離的分辨率，要求兩個(gè)維度的色譜分離具有較高的正交性[5]。親水相互作用色譜（Hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）與反相色譜（Reversed phase liquid chromatography，RPLC）正交性良好，是目前最常使用的二維液相色譜分離模式組合之一。但HILIC與RPLC聯(lián)用時(shí)存在溶劑不兼容的問題[6]：HILIC使用的高有機(jī)流動(dòng)相在RPLC中顯現(xiàn)出高洗脫強(qiáng)度，而反相色譜使用的高水流動(dòng)相也是HILIC模式的強(qiáng)洗脫液。因此，第一維分離使用的流動(dòng)相總在第二維分離中顯現(xiàn)出高洗脫強(qiáng)度，可能導(dǎo)致第一維分離得到的樣品在轉(zhuǎn)入第二維分離時(shí)難以保留，導(dǎo)致第二維分離的分辨率降低，所以對兩種色譜模式的聯(lián)用方式提出了較高的要求。

目前，常用的HILIC與RPLC二維液相色譜聯(lián)用方式有離線聯(lián)用[7～10]、第一維使用細(xì)內(nèi)徑色譜柱[11～14]、溶劑蒸發(fā)[15]和溶劑補(bǔ)充稀釋[16～19]等。其中，離線聯(lián)用是最常用的聯(lián)用方式，其將第一維分離出來的樣品分段接出，經(jīng)干燥復(fù)溶后，再轉(zhuǎn)入第二維進(jìn)行分離。該方法具有較大的靈活度，可分別對兩個(gè)維度的分離進(jìn)行獨(dú)立優(yōu)化，從而有效提高整體的分離性能。但離線聯(lián)用耗時(shí)耗力，并且轉(zhuǎn)移過程中可能會(huì)有樣品損失，所以僅適用于大體積樣品的轉(zhuǎn)移，較難進(jìn)行微量樣品的處理和轉(zhuǎn)移。也有研究者嘗試采用細(xì)的第一維色譜柱和粗的第二維色譜柱，以解決溶劑不兼容的問題。但這種方法的局限性在于：第一維色譜柱內(nèi)徑細(xì)，樣品容量低;第二維分離過程中樣品的度稀釋高，會(huì)大大降低檢測靈敏度，且與質(zhì)譜聯(lián)用也較不友好。Tian等[15]開發(fā)了一種結(jié)合真空蒸發(fā)的二維液相色譜系統(tǒng)。第一維色譜柱分離出來的樣品存儲(chǔ)在定量環(huán)中，并通過真空干燥使樣品黏附在定量環(huán)內(nèi)部，之后樣品溶解在第二維色譜柱使用的流動(dòng)相中，再進(jìn)行第二維分離。通過這種方法可有效解決溶劑不兼容的問題，但仍存在樣品易丟失和儀器裝置復(fù)雜等缺點(diǎn)，所以并未得到廣泛應(yīng)用。通過溶劑補(bǔ)充稀釋將第一維色譜柱分離使用的流動(dòng)相轉(zhuǎn)化為與第二維色譜柱分離兼容的流動(dòng)相，也是一種較常用的方法。通常，在第一維色譜柱分離的出液端通過三通引入與第二維分離兼容的溶劑進(jìn)行稀釋，再通過捕集柱預(yù)濃縮樣品，之后將捕集柱與第二維色譜柱耦聯(lián)后進(jìn)行第二維分離。采用這種方法可大大降低第一維流動(dòng)相的影響，也不會(huì)降低檢測靈敏度。但這種方法也存在一些問題，當(dāng)僅使用一根捕集柱通過反復(fù)切閥進(jìn)行樣品捕集和分離時(shí)[16]，第一維色譜柱分離會(huì)出現(xiàn)停流的現(xiàn)象，會(huì)造成樣品返混的現(xiàn)象，且耗時(shí)也較長。當(dāng)使用兩根捕集柱進(jìn)行交替捕集和分離時(shí)[17～19]，第二維色譜柱分離需使用短柱進(jìn)行快速分離，無法達(dá)到分離性能最大化。此外，目前大部分二維液相色譜分離方法都是基于常規(guī)色譜柱或細(xì)徑柱進(jìn)行的，基于毛細(xì)管色譜柱的二維液相色譜研究仍然較為有限，因而發(fā)展面向二維液相色譜的微納樣品轉(zhuǎn)移技術(shù)具有重要的意義。

本研究采用單顆粒柱塞技術(shù)[20]制備HILIC、RPLC毛細(xì)管液相色譜柱和捕集柱，通過與十通道流路選擇閥進(jìn)行耦聯(lián)，實(shí)現(xiàn)二維液相色譜的微納樣品轉(zhuǎn)移。此技術(shù)結(jié)合了離線聯(lián)用和溶劑補(bǔ)充稀釋，實(shí)現(xiàn)了微量樣品的高效轉(zhuǎn)移，且可對兩個(gè)維度的色譜分離進(jìn)行獨(dú)立優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)分離效能的最大化。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

P230高壓恒流泵（大連依利特儀器有限公司）; TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）; Ultimate 3000納流液相色譜儀（荷蘭Thermo-Dionex公司）; 488 nm激光誘導(dǎo)熒光檢測器（美國Beckman Coulter公司）; 超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）; 光學(xué)顯微鏡（福建麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）; Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

色譜純甲醇、色譜純乙腈（ACN）、色譜純?nèi)宜幔═FA）、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、胰蛋白酶、細(xì)胞色素C、牛血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、a-酪蛋白和肌紅蛋白（美國Sigma-Aldrich公司）; 熒光標(biāo)記試劑NBD-F（日本TCI公司）; 二氧六環(huán)、尿素和碳酸氫銨（分析純， 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

熔融石英毛細(xì)管（河北永年銳灃色譜器件有限公司）; 單顆粒柱塞（廈門宜柱科技有限公司）; 毛細(xì)管切割器（日本GL Sciences公司）; TFE套管、FEP套管、PEEK套管、接頭、二通、三通（美國IDEX Health & Science公司）; 10通道流路選擇閥（美國Valco instrument公司）; 3 μm TSKgel Amide-80填料（日本TOSOH公司）; 5 μm Ultimate XB-C18填料（上海月旭材料科技有限公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 毛細(xì)管液相色譜柱的制備 HILIC、RPLC毛細(xì)管填充柱和毛細(xì)管捕集柱的制備采用單顆粒柱塞技術(shù)[20]，具體步驟如下：（1）將單顆粒柱塞填入毛細(xì)管的一端作為出口塞; （2）通過高壓泵將勻漿液壓入帶柱塞的毛細(xì)管內(nèi)部，填柱壓力最高達(dá)40 MPa; （3）當(dāng)柱床達(dá)到需要的長度后緩慢泄壓，再填入入口塞。用這種方法制備了長20 cm、內(nèi)徑100 μm的HILIC色譜柱，長15 cm、內(nèi)徑100 μm的RPLC色譜柱和100 μm內(nèi)徑的毛細(xì)管捕集柱（柱床長1 cm，全長7 cm）。

2.2.2 樣品的制備 分別制備了5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)酶解物樣品：稱取1 mg蛋白質(zhì)樣品，溶解于50 mL 40 mmol/L pH 8.0碳酸鹽緩沖溶液，如果蛋白質(zhì)分子量較大（如牛血清白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白），需要使用8 mol/L尿素使蛋白質(zhì)變性。再向蛋白質(zhì)溶液加入16 μL 50 mmol/L DTT溶液，56℃水浴45 min，以打開蛋白質(zhì)中的二硫鍵。待蛋白質(zhì)溶液冷卻到室溫后，加入54 mL 55 mmol/L IAA溶液，避光放置30 min，以防止游離的巰基再次生成二硫鍵。之后加入適量的胰蛋白酶溶液（酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比約為1∶50）于37℃反應(yīng)2 h，再加入等量的酶溶液于37℃反應(yīng)18 h。酶解溶液冷卻到室溫后，加入10 μL 10%甲酸溶液終止反應(yīng)，離心，取上清液。

對蛋白質(zhì)酶解物樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記：在20 μL蛋白質(zhì)降解物樣品中加入200 μL硼砂緩沖液（pH 8.0），再加入40 μL 1 mg/mL NBD-F溶液，混勻后在60℃下避光反應(yīng)30 min，最后加入480 μL 50 mmol/L HCl溶液。

對用于HILIC分離的樣品需溶解在高濃度ACN溶液中，所以蛋白質(zhì)樣品需要凍干后復(fù)溶到90% ACN溶液中，樣品濃度為1 mg/mL。

2.2.3 色譜分離條件 在Ultiamte 3000納流液相色譜系統(tǒng)上分別進(jìn)行HILIC和RPLC一維液相色譜分離和二維液相色譜分離。 流動(dòng)相A： 0.1% TFA，流動(dòng)相B： ACN + 0.1% TFA。

對于HILIC一維色譜的分離， 流速： 350 nL/min; 樣品： 細(xì)胞色素C降解物; 進(jìn)樣體積： 0.2 μL; 梯度洗脫： 0～5 min， 97% B; 5～35 min， 97%～65% B; 36～46 min， 60% B; 47～57 min， 97% B。對于RPLC一維色譜分離， 流速： 350 nL/min; 樣品： 細(xì)胞色素C降解物; 進(jìn)樣體積： 0.2 mL; 梯度洗脫： 0～5 min， 5% B; 5～35 min， 5%～50% B; 36～46 min， 80% B; 47～57 min， 5% B。

對于HILIC-RPLC二維液相色譜分離， 第一維采用長20 cm的HILIC毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行分離， 流速： 200 nL/min; 樣品： 5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)酶解物; 進(jìn)樣體積為1 μL; 第一維分離的梯度洗脫程序： 0～5 min， 97% B; 5～35 min， 97%～65% B; 36～50 min， 60% B; 51～70 min， 97% B。第一維分離得到的樣品通過100%的水相溶劑進(jìn)行補(bǔ)充稀釋， 再分段捕集到不同的C18捕集柱上， 之后捕集柱與第二維色譜柱連接即可進(jìn)行第二維分離。第二維采用15 cm長的RPLC毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行分離， 流速： 350 nL/min; 梯度洗脫程序： 0～5 min， 5% B; 5～35 min， 5%～50% B; 36～46 min， 80% B; 47～57 min， 5% B。

3 結(jié)果與討論

3.1 面向二維液相色譜的微納樣品轉(zhuǎn)移技術(shù)

在傳統(tǒng)的HILIC-RPLC二維液相色譜分離方法中，第一維分離產(chǎn)生的餾分直接轉(zhuǎn)入第二維色譜柱，嚴(yán)重的稀釋效應(yīng)和流動(dòng)相不兼容的問題會(huì)直接影響色譜分離的分辨率和峰容量[21]，限制了HILIC-RPLC二維液相色譜的應(yīng)用。在本研究中，為了解決HILIC與RPLC二維分離過程中溶劑不兼容的問題，設(shè)計(jì)了一種帶有捕集柱和補(bǔ)充液的新型樣品轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。此系統(tǒng)可避免稀釋效應(yīng)引起的靈敏度降低，實(shí)現(xiàn)微量樣品的高效轉(zhuǎn)移，而且兩個(gè)維度的色譜柱都可以在最佳分離條件下運(yùn)行。

采用C18捕集柱作為二維液相色譜聯(lián)用過程中轉(zhuǎn)移樣品的容器，通過HILIC毛細(xì)管色譜柱、三通、十通道流路選擇閥和捕集柱的連接， 構(gòu)建面向HILIC-RPLC二維液相色譜的樣品轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，裝置如圖1所示。其中，第一維液相色譜使用HILIC毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行分離。對于HILIC分離過程中產(chǎn)生的強(qiáng)洗脫餾分（對于RPLC是強(qiáng)洗脫餾分）， 在HILIC毛細(xì)管色譜柱的出液端連接三通，引入弱洗脫溶劑進(jìn)行稀釋。之后，通過十通道流路選擇閥將稀釋后的樣品組分分段捕集到不同的C18捕集柱上。如將第一維分離得到的樣品切割成10個(gè)組分以下，則連接上所需數(shù)量的C18捕集柱即可; 如果將第一維分離的樣品切割成10個(gè)組分以上，則需將富集到樣品的捕集柱依次替換成新的捕集柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。最后，將捕集柱通過二通連接到RPLC毛細(xì)管色譜柱上，即可進(jìn)一步進(jìn)行第二維反相液相色譜分離。

對于面向HILIC-RPLC二維液相色譜的微納樣品轉(zhuǎn)移平臺(tái)， 影響樣品轉(zhuǎn)移的效率和二維分離的性能的參數(shù)包括第一維和第二維色譜的分離條件、補(bǔ)充液的流速和第一維分離樣品的切割頻率等。對于HILIC和RPLC分離條件的選擇，本研究組之前的工作中已分別對這兩種固定相制備的毛細(xì)管色譜柱的性能進(jìn)行了研究[22，23]，并建立和優(yōu)化了相應(yīng)的分離條件。

如圖2所示，在選定的分離條件下， 分別用HILIC和RPLC毛細(xì)管色譜柱對細(xì)胞色素C酶解物進(jìn)行一維液相色譜分離，在30 min的梯度洗脫時(shí)間內(nèi)獲得的峰容量分別為45和87。由此可知，兩種色譜模式在進(jìn)行一維液相色譜分離時(shí)獲得的峰容量較為有限，無法用于復(fù)雜樣品體系的高分辨分離，也證明了二維液相色譜分離的必要性。

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Microscale Sample Transfer Technology for Capillary

Two-Dimensional Liquid Chromatography

LIU Ya， ZHANG Bo*

（College of Chemistry & Chemical Engineering， Xiamen University， Xiamen 361005， China）

Abstract Hydrophilic interaction chromatography （HILIC） coupled with reverse phase liquid chromatography （RPLC） is the most commonly used two-dimensional separation mode. However， it is suffered from the incompatibility of mobile phase. To overcome this issue， a microscale sample transfer technology was developed for capillary HILIC-RPLC two-dimensional liquid chromatography in this work. The sample transfer technology was consisted of weak elution make-up liquid and trap column， so that the strong elution solvent from the first dimension could be diluted effectively. Through optimization of make-up flow rate， the organic concentration of the first dimension effluent was reduced to less than 5%， and up to 95% sample transfer efficiency was achieved. This technology was applied to the two-dimensional separation of five standard protein digest. When 8 sample fractions from the first dimension separation were transferred to the second dimension separation， a theoretical peak capacity of 680 could be obtained. In addition， the peak capacity could be improved with the increasing sampling frequency， suggesting that this technology could be effectively applied to high-resolution separation of complex mixtures.

Keywords Two dimensional liquid chromatography; Hydrophilic interaction chromatography; Reverse phase chromatography; Sample transfer; Peak capacity