吳豪杰 鄭 潔 歐仕益 黃才歡

（暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系 廣州510632）

丙烯酰胺具有生殖毒性和神經(jīng)毒性，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中致癌[1-2]，被國(guó)際機(jī)構(gòu)列入“人類可能致癌物”[3]。食品中的丙烯酰胺主要由羰基化合物與天冬酰胺在高溫加熱條件下通過(guò)美拉德反應(yīng)產(chǎn)生[4-5]。形成途徑之一是通過(guò)美拉德反應(yīng)形成3-氨基丙酰胺，其后在高溫下脫氨產(chǎn)生[6]。

前人研究表明，氨基酸氨基和巰基可與丙烯酰胺通過(guò)Michael 加成反應(yīng)形成加合物[7-8]，從而消除丙烯酰胺[9-11]。3-氨基丙酰胺的C-3 的活潑氨基也可與丙烯酰胺發(fā)生Michael 加成反應(yīng)，從而消除丙烯酰胺。本研究首次采用液-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLCMS-MS）鑒定3-氨基丙酰胺與丙烯酰胺形成的加合物，并研究反應(yīng)溫度、時(shí)間和反應(yīng)物的比例對(duì)丙烯酰胺消除的影響，以期闡明3-氨基丙酰胺在丙烯酰胺的形成和消減中的貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3-氨基丙酰胺鹽酸鹽，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；丙烯酰胺，百靈威科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，天津市大茂化學(xué)試劑廠；色譜級(jí)甲醇，美國(guó)Mallinckrodt Baker 公司；純凈水。

1.2 儀器與設(shè)備

HR-200 電子分析天平，A & D 公司；SHIMADZMLC-20AT 高效液相色譜分析系統(tǒng)，日本島津儀器公司；SHIMADZU LC-MS 8045 液-質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)，日本島津儀器公司；SBH200DC 數(shù)字式雙溫控干浴器，Stuart 公司；帶蓋20 mL 不銹鋼試管，自制。

1.3 方法

1.3.1 加合物的檢測(cè) 用pH8 的磷酸緩沖溶液配制50 mmol/L 3-氨基丙酰胺溶液，向不銹鋼試管中分別加入2 mL 3-氨基丙酰胺和2 mL pH 8 的磷酸緩沖溶液，旋緊管蓋，于160 ℃干浴器中反應(yīng)20 min，冷卻至室溫。將試管中的樣品轉(zhuǎn)移到10 mL 容量瓶中，定容，用高效液相色譜法檢測(cè)生成物。

1.3.2 加合物的質(zhì)譜鑒定

1.3.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱 （3.0 mm×100 mm，2.7-Micron）；流動(dòng)相：乙腈-水溶液（20∶80，V/V）；柱溫40 ℃，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣體積0.5 μL。

1.3.2.2 質(zhì)譜條件 ESI 離子源，正離子模式Q3掃描，電子能量-20 eV；霧化氣流量3.0 L/min，干燥氣流量10.0 L/min，加熱氣流量10.0 L/min；接口溫度300 ℃，DL 溫度250 ℃，加熱塊溫度400 ℃；準(zhǔn)分子離子峰m/z 分別為160 與231，掃描范圍m/z 50～1 000。

1.3.3 反應(yīng)條件對(duì)3-氨基丙酰胺消減丙烯酰胺的影響

1.3.3.1 反應(yīng)溫度對(duì)3-氨基丙酰胺消減丙烯酰胺的影響 向不銹鋼試管中分別加入2 mL 50 mmol/L 3-氨基丙酰胺與2 mL 50 mmol/L 丙烯酰胺溶液，旋緊管蓋，然后將試管分別置于120，140，160，180 ℃和200 ℃的干浴器中反應(yīng)20 min，考察不同反應(yīng)溫度下3-氨基丙酰胺對(duì)丙烯酰胺的消減率。

1.3.3.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)3-氨基丙酰胺消減丙烯酰胺的影響 向不銹鋼試管中分別加入2 mL 50 mmol/L 3-氨基丙酰胺與2 mL 50 mmol/L 丙烯酰胺溶液，旋緊管蓋，將試管置于160 ℃的干浴器中分別加熱10，15，20，25 min 和30 min，考察不同反應(yīng)時(shí)間下3-氨基丙酰胺對(duì)丙烯酰胺的消減率。

1.3.3.3 反應(yīng)物的濃度比對(duì)3-氨基丙酰胺消減丙烯酰胺的影響 將適量的丙烯酰胺和3-氨基丙酰胺添加到不銹鋼試管中，使其濃度比分別為1 ∶5，2∶5，3∶5，4∶5 和1∶1，3-氨基丙酰胺終濃度為25 mmol/L。旋緊管蓋，然后將試管置于160 ℃的干浴器中分別加熱20 min，考察丙烯酰胺與3-氨基丙酰胺的濃度比對(duì)丙烯酰胺消減率的影響。

1.4 丙烯酰胺的檢測(cè)

色譜條件：色譜柱：Atlantis T3，4.6mm×150 mm，5 μm；流動(dòng)相：甲醇（A）和超純水（B），梯度洗脫條件為：0～4 min：10% A；4.01～5 min：10%～80%A；5.01～8 min：80% A，；8.01～9 min：80%～10% A；9.01～15 min：10% A；流速0.7 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm。

1.5 丙烯酰胺消減率的計(jì)算公式

式中：A1——丙烯酰胺單獨(dú)加熱后體系中丙烯酰胺的量；A2——3-氨基丙酰胺單獨(dú)加熱后體系中丙烯酰胺的量；A3——3-氨基丙酰胺與丙烯酰胺混合加熱后體系中丙烯酰胺的量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

對(duì)每種處理做3 次平行試驗(yàn)，用SPSS 17.0處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 加合物

采用高效液相色譜法檢測(cè)3-氨基丙酰胺在160 ℃反應(yīng)20 min 后的樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品的譜圖中不僅有3-氨基丙酰胺和丙烯酰胺的吸收峰，還出現(xiàn)兩個(gè)新的吸收峰（圖1）。同時(shí)，3-氨基丙酰胺與丙烯酰胺也出現(xiàn)同樣的兩個(gè)新吸收峰，推測(cè)3-氨基丙酰胺與丙烯酰胺之間發(fā)生相互作用。

圖1 3-氨基丙酰胺樣品160 ℃反應(yīng)20 min 后的液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatography of the reaction products after heating 3-aminopropanamide at 160 ℃for 20 min

圖2 3-氨基丙酰胺和丙烯酰胺可能形成的加合物Fig.2 Possible adduct formed between 3-aminopropanamide and acrylamide

2.2 加合物的質(zhì)譜鑒定

2.2.1 質(zhì)譜分析 在電噴霧正離子模式下，檢測(cè)新的吸收峰中物質(zhì)的分子質(zhì)量。由圖3可見，新的吸收峰中有2 個(gè)物質(zhì)，它們均以[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰形式存在（m/z 分別為160 和231），同時(shí)出現(xiàn)的還有它們的加鈉峰[M+Na]+（m/z 182 和253）。由于3-氨基丙酰胺C-3 的活潑氨基可與丙烯酰胺發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，新吸收峰中的物質(zhì)很可能是按圖2的反應(yīng)途徑生成2 種加合物。

進(jìn)一步分析新組分的結(jié)構(gòu)及其質(zhì)譜裂解途徑，對(duì)2 個(gè)新組分的ESI-MS2碰撞誘導(dǎo)裂解進(jìn)行研究?；? 的準(zhǔn)分子離子[M+H]+為m/z 160，由圖4a 可知，在二級(jí)質(zhì)譜圖中出現(xiàn)兩個(gè)相對(duì)豐度較高的碎片離子m/z 101 和m/z 84。其中m/z 101是加合物與N-4 位相連的C-C 鍵裂解后生成（N-裂解[12-13]），繼而在其羰基側(cè)發(fā)生裂解給出m/z 84；另外，非專一性N 原子上的氫轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了m/z 72（C3H6NO·）?；? 的準(zhǔn)分子離子[M+H]+為m/z 231（圖4b），在二級(jí)質(zhì)譜圖中相對(duì)豐度最高的碎片離子m/z 172，是加合物發(fā)生N-裂解失去烷基酰胺產(chǎn)生；其中m/z 101 是加合物與N-4 位相連的C-C 鍵裂解后生成 （N-裂 解），而m/z72（C3H6NO·）同樣為非專一性N 原子上的氫轉(zhuǎn)移后生成，由此推測(cè)加合物的分子結(jié)構(gòu)及分子碎片見圖5。

圖3 3-氨基丙酰胺與丙烯酰胺加合物的質(zhì)譜圖（正離子模式）Fig.3 Spectrum of the reaction products between 3-APA and acrylamide （in positive ionisation mode）

圖4 加合物的二級(jí)質(zhì)譜（a：相對(duì)分子質(zhì)量159，b：相對(duì)分子質(zhì)量230）Fig.4 MS-MS spectrum of the reaction product 1 （MW=159，a） and reaction product 2 （MW=230，b）

圖5 正離子模式下3-氨基丙酰胺-丙烯酰胺加合物的結(jié)構(gòu)式及碎片信息Fig.5 Predicted chemical formulas and molecular fragments information of 3-APA-acrylamide adducts in positive mode

2.2.2 加合物的高分辨質(zhì)譜分析 采用高分辨質(zhì)譜測(cè)定加合物的相對(duì)分子質(zhì)量，并擬合出相對(duì)分子質(zhì)量為159 和230 的產(chǎn)物的分子式分別為C6H13N3O2與C9H18N4O3。由2.2.1 節(jié)可知，加合物2為3，3'，3'-次氮基三丙酰胺，在正離子模式下，比較標(biāo)準(zhǔn)品與加合物2 的二級(jí)質(zhì)譜（圖6），其相對(duì)分子質(zhì)量與碎片信息高度吻合。

圖6 正離子模式下標(biāo)準(zhǔn)品（a）與加合物2（b）的高分辨二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.6 HRMS-MS of the standard （a） and reaction product 2 （b） in positive mode

2.3 反應(yīng)條件對(duì)3-氨基丙酰胺消減丙烯酰胺的影響

2.3.1 反應(yīng)溫度對(duì)3-氨基丙酰胺消減丙烯酰胺的影響 隨著溫度的不斷上升，3-氨基丙酰胺產(chǎn)生的丙烯酰胺逐漸增多，并在200 ℃時(shí)達(dá)到最大值，丙烯酰胺濃度隨著溫度的上升而略有下降，不明顯；而丙烯酰胺消減率隨著溫度的不斷升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，在160 ℃時(shí)消減率達(dá)到最大值43.37%（表1）。其原因可能是由于120 ℃時(shí)，3-氨基丙酰胺與丙烯酰胺的加合反應(yīng)較為緩慢，導(dǎo)致丙烯酰胺消減率不高。隨著溫度的不斷上升，反應(yīng)程度不斷增加，160 ℃時(shí)消減率達(dá)到最大值；隨后隨著溫度的進(jìn)一步上升，丙烯酰胺消減率不斷下降，說(shuō)明高溫促進(jìn)了3-氨基丙酰胺轉(zhuǎn)化為丙烯酰胺。

2.3.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)3-氨基丙酰胺消減丙烯酰胺的影響 3-氨基丙酰胺單獨(dú)加熱時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，丙烯酰胺產(chǎn)生量逐漸增多，反應(yīng)時(shí)間為30 min 時(shí)，丙烯酰胺的產(chǎn)生量比加熱10 min 時(shí)增加13 倍。丙烯酰胺單獨(dú)加熱體系中，其含量隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)略有下降。在3-氨基丙酰胺與丙烯酰胺同時(shí)加熱的體系中，丙烯酰胺的消減率隨著加熱時(shí)間的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)加熱時(shí)間在20 min 時(shí)，丙烯酰胺的消減率達(dá)到最大值43.37%（表2）。其原因可能是160 ℃下，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)反應(yīng)程度不斷加大，在20 min 時(shí)丙烯酰胺消減率達(dá)到最大值；之后隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，可加合物在此條件下不穩(wěn)定，逐漸分解，重新釋放出3-氨基丙酰胺與丙烯酰胺，導(dǎo)致丙烯酰胺消減率不斷下降。

表1 不同溫度對(duì)丙烯酰胺消減的影響Table 1 Effect of different temperature on acrylamide elimination

表2 加熱時(shí)間對(duì)丙烯酰胺消減的影響Table 2 Effect of heating time on acrylamide elimination

2.3.3 反應(yīng)物的濃度比對(duì)3-氨基丙酰胺消減丙烯酰胺的影響 3-氨基丙酰胺消減丙烯酰胺的量隨著丙烯酰胺添加量的不斷增大呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)丙烯酰胺與3-氨基丙酰胺濃度比為3∶5 時(shí)，丙烯酰胺消減率達(dá)到最大值47.29%。通過(guò)對(duì)比液相色譜圖發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺與3-氨基丙酰胺濃度較低時(shí)形成的加合物有兩種，而當(dāng)丙烯酰胺與3-氨基丙酰胺濃度比增大到3∶5 時(shí)所形成的加合物僅1 種。其原因可能為加合反應(yīng)的類型有兩種，當(dāng)丙烯酰胺的量較少時(shí)，1 分子的丙烯酰胺與1分子的3-氨基丙酰胺通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)形成相對(duì)分子質(zhì)量為159 的加合物1 后，部分加合物1 再與一分子的丙烯酰胺繼續(xù)反應(yīng)形成加合物2（相對(duì)分子質(zhì)量為230）。而當(dāng)丙烯酰胺的量不斷增大時(shí)，反應(yīng)向著生成相對(duì)分子質(zhì)量為230 的加合物的方向進(jìn)行，消耗了體系中的加合物1；當(dāng)丙烯酰胺過(guò)量時(shí)，由于3-氨基丙酰胺不足，過(guò)量的丙烯酰胺無(wú)法通過(guò)形成加合物被消減，導(dǎo)致丙烯酰胺的消減率下降。

3 結(jié)論

采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)3-氨基丙酰胺與丙烯酰胺通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)形成的產(chǎn)物進(jìn)行研究，結(jié)果表明：3-氨基丙酰胺不僅能在高溫下脫氨形成丙烯酰胺，也可與生成的丙烯酰胺通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)形成兩種加合物，其相對(duì)分子質(zhì)量分別為159 與230。考察不同反應(yīng)條件對(duì)3-氨基丙酰胺消減丙烯酰胺的影響，發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺消減率隨溫度、時(shí)間、丙烯酰胺與3-氨基丙酰胺的濃度比的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)；當(dāng)丙烯酰胺與3-氨基丙酰胺濃度之比較低時(shí)，體系中同時(shí)存在加合物1 和加合物2；而當(dāng)丙烯酰胺與3-氨基丙酰胺濃度增加到3 ∶5 時(shí)，體系中有47.29%的丙烯酰胺被消除，且反應(yīng)產(chǎn)物只有由2分子的丙烯酰胺與1 分子的3-氨基丙酰胺形成的加合物2。

表3 丙烯酰胺添加量對(duì)丙烯酰胺消減的影響Table 3 Addition amounts of acrylamide on the effect of acrylamide elimination

本研究發(fā)現(xiàn)兩種丙烯酰胺與3-氨基丙酰胺的加合物，為美拉德反應(yīng)中產(chǎn)物的相互作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。