王 玲,李 昆,宋雅琦,公 勤,李兆華,*

1 湖北大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,武漢 430062 2 湖北省農(nóng)村安全飲用水工程技術(shù)研究中心,武漢 430062

土壤是大氣氧化亞氮(N2O)排放的重要來(lái)源之一,由土壤微生物介導(dǎo)的硝化、反硝化作用是產(chǎn)生N2O的主要過(guò)程[1,2]。然而常規(guī)靜態(tài)箱法監(jiān)測(cè)到的N2O排放量?jī)H是土壤中N2O產(chǎn)生與消耗過(guò)程綜合作用后的動(dòng)態(tài)結(jié)果[3]。由于土壤水、土壤孔隙等非生物因素的截留作用以及土壤微生物的還原作用,土壤剖面中產(chǎn)生的N2O量并不能完全遷移出土壤表面而貢獻(xiàn)排放[4,5]。近年來(lái)水稻土研究結(jié)果顯示,無(wú)論是淹水狀態(tài)還是落干過(guò)程,N2O排放可能主要來(lái)源于距離土表更近的0—5 cm深度的水稻土層[6- 8]。但同時(shí)Wang等研究發(fā)現(xiàn)0—5 cm深度土層產(chǎn)生的N2O氣體并不能完全排放,高達(dá)90%的N2O產(chǎn)生量以不同途徑消耗損失了[9],因此0—5 cm深度土壤N2O消耗能力值得關(guān)注。此外,越來(lái)越多的研究監(jiān)測(cè)到土壤N2O負(fù)排放量,在溫帶和熱帶區(qū)域的自然和耕作生態(tài)系統(tǒng)中,N2O凈消納率在<-1.0 μg N m-2h-1至-207 μg N m-2h-1范圍波動(dòng)[10,11]。全球每年通過(guò)土壤作用消耗的N2O總量不可忽視,土壤消耗N2O已經(jīng)成為很重要的一種降低大氣N2O濃度的途徑,值得深入探究。

水稻土是一種長(zhǎng)期處于淹水缺氧狀態(tài)中的人工水成土,土壤環(huán)境極有利于其反硝化脫氮和N2O充分還原[12,13]。但目前關(guān)于水稻土壤消耗N2O過(guò)程及其微生物調(diào)控機(jī)制的系統(tǒng)研究較為缺乏。為揭示0—5 cm深度水稻土層N2O消納量與N2O還原微生物之間的耦合關(guān)系,本研究擬通過(guò)微宇宙培養(yǎng)方法對(duì)淺表層(0—5 cm)原狀水稻土外源添加N2O氣體,測(cè)定N2O遷移通過(guò)土柱的動(dòng)態(tài)過(guò)程以及無(wú)機(jī)養(yǎng)分和氧化亞氮還原酶基因(nosZⅠ和nosZⅡ)豐度變化。研究結(jié)果將為水稻田溫室氣體減排提供重要的科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 土樣采集與預(yù)處理

土樣采集自湖南益陽(yáng)水稻豐產(chǎn)節(jié)水節(jié)肥試驗(yàn)田(29°08′N(xiāo), 112°27′E),為多年種植雙季稻土壤,土壤類(lèi)型為河流沖積物母質(zhì)發(fā)育的潮土(土壤質(zhì)密,可有效防止氣體從土壤裂縫泄漏)。采集時(shí)間為2016年4月(翻耕前2周),此時(shí)田間土壤處于休耕漬水狀態(tài)。采用隨機(jī)多點(diǎn)采樣法,盡量避免殘留主根區(qū)域,用自制PVC管(d=17 cm,h=8 cm)采集多個(gè)深度為0—5 cm的原狀水稻土柱。標(biāo)注方向后用保鮮膜包裹緊實(shí),帶回實(shí)驗(yàn)室做后續(xù)處理。同時(shí)在田間分別多點(diǎn)隨機(jī)采集0—5 cm土樣,混勻后帶回實(shí)驗(yàn)室測(cè)定基礎(chǔ)理化性質(zhì),結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 供試土樣基礎(chǔ)理化性質(zhì)

圖1 培養(yǎng)裝置模型圖Fig.1 Schematic diagram of incubation device

用小PVC管(d=5 cm,h=7 cm)在取回的原狀土柱上以環(huán)刀法采集小土柱(d=5 cm,h=5 cm),每大土柱可取2個(gè)小土柱。然后在底部安裝相同尺寸PVC管(d=5 cm,h=3 cm)制的通氣底座并密封邊緣。通氣底座上端用均勻打孔的PVC板覆蓋后,在PVC板下再覆蓋一層透氣不透水的硅膠片并密封邊緣,通氣底座下端直接用PVC板覆蓋并密封邊緣。確保每個(gè)邊緣密封完好后將整套裝置置于培養(yǎng)用塑料杯(d=9 cm,h=13 cm)中,用三通閥連接通氣底座與塑料杯外壁,用于外源氣體的添加。培養(yǎng)裝置如圖1所示。

從原狀土柱表面緩慢加入雙水使土表水層約1 cm左右,放置在25±1 ℃溫室預(yù)培養(yǎng)10 d后待用,預(yù)培養(yǎng)期間注意補(bǔ)充水分使水層厚度保持不變。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后將安裝了三通閥的塑料杯蓋蓋起并完全密封,用浸水法確定整體密封效果。之后用注射器連接塑料杯三通閥置換裝置內(nèi)氣體為高純He氣,反復(fù)置換5次后保證內(nèi)外氣壓平衡。

2.2 試驗(yàn)處理

每土層均設(shè)置3個(gè)N2O含量添加處理,分別為1 mL(N1)、5 mL(N5)、10 mL(N10) 99.99%純度N2O/盆(相當(dāng)于880、4404、8808 μg N2O-N/盆),每處理3個(gè)重復(fù)。為降低土壤異質(zhì)性對(duì)后續(xù)分析的影響,每處理0h和172h土樣樣品分別為同一大土柱取出的2個(gè)小土柱。塑料杯內(nèi)氣體置換完成后,用注射器連接通氣底座三通閥,分別抽出1、5、10 mL氣體后通入設(shè)定量的N2O氣體,隨后將整套裝置置于無(wú)氧培養(yǎng)裝置中(真空壓縮袋制,抽真空后通入高純He氣),開(kāi)始培養(yǎng)計(jì)時(shí),培養(yǎng)時(shí)間共計(jì)172 h。

2.3 樣品采集

氣體樣品采集：用注射器分別在密閉培養(yǎng)的0、33、82、125、172 h采集通氣底座內(nèi)氣體,并在0、5、 10、 21、 28、 33、44、57、69、82、94、107、125、144、172 h采集塑料杯內(nèi)氣體樣品1 mL于12 mL真空血清瓶中,充入29 mL高純He使氣瓶?jī)?nèi)氣體維持高壓,用于N2O含量的測(cè)定。每次采集氣體樣品前用注射器反復(fù)抽打空間內(nèi)氣體15—20次使空間氣體混勻,氣體樣品采集后立即補(bǔ)入等量高純He保證裝置內(nèi)各空間氣壓平衡。

2.4 氧化亞氮濃度,無(wú)機(jī)氮和DOC測(cè)定

N2O濃度采用溫室氣體氣相色譜儀(GC 7890A)測(cè)定。以高純N2作為色譜柱載氣,氣流速度28 psi,檢測(cè)器溫度為300 ℃,柱箱溫度為50 ℃,檢測(cè)器為微池電子捕獲器63Ni-ECD。

無(wú)機(jī)氮及DOC含量測(cè)定采用硫酸鉀共提法浸提。稱(chēng)取約10 g土樣,置于 100 mL 塑料振蕩瓶中,加入 50 mL 0.5 mol L-1K2SO4溶液浸提,在振蕩機(jī)上振蕩 1 h后用濾紙過(guò)濾懸濁液,澄清濾液分別采用連續(xù)流動(dòng)分析儀 (Flastar 5000 Analyzer) 和C/N分析儀測(cè)定硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量和DOC含量。

2.5 氧化亞氮還原酶基因豐度測(cè)定

土壤樣品的DNA提取方法主要參考Chen等[14]的方法。提取的DNA由Nanodrop ND- 1000UV-Vis分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和質(zhì)量系數(shù),并通過(guò)1% 凝膠電泳檢測(cè)DNA完整度,滿(mǎn)足條件后用于qPCR分析。

氧化亞氮還原酶基因PCR分析用引物分別為nosZI- 1126F(5′-GGG CTB GGG CCR TTG CA- 3′)和nosZI- 1381R(5′- GAA GCG RTC CTT SGA RAA CTT G - 3′),以及nosZII-F(5′-CTI GGI CCI YTK CAY AC- 3′)和nosZII-R(5′- GCI GAR CAR AAI TCB GTR C - 3′)。實(shí)時(shí) PCR 擴(kuò)增所用的儀器為 ABI PRISM 7900 (Applied Biosystems),實(shí)現(xiàn)熒光檢測(cè)和樣品濃度測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線用含nosZI和nosZII基因的質(zhì)粒為模板,以10倍梯度稀釋法配制nosZ基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為(10 μL)：上下游引物各0.2 μL,SYBRGreen(TaKaRa)5 μL,Rox 0.2 μL,DNA模板5 ng(1 μL),補(bǔ)水至10 μL。nosZI基因qPCR程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s預(yù)變性；95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 10 s,40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,95 ℃ 15 s校正溶解曲線。nosZII基因qPCR程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s預(yù)變性；95 ℃ 15s,54 ℃ 30s,72 ℃ 30 s,45個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,95 ℃ 15 s校正溶解曲線。所有樣品重復(fù)3次并設(shè)置陰性對(duì)照,溶解曲線分析和瓊脂糖凝膠電泳鑒定產(chǎn)物的特異性。

2.6 數(shù)據(jù)分析處理

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行分析。N2O濃度、無(wú)機(jī)養(yǎng)分濃度以及功能基因豐度處理間的差異性分析采用單向方差分析(One Way ANOVE,LSD 檢驗(yàn))。N2O濃度與消耗速率的關(guān)系采用線性回歸分析擬合。圖形制作采用Orgin Pro 9.0和Excel 2010軟件完成。

3 結(jié)果與分析

3.1 淹水水稻土柱N2O消納動(dòng)態(tài)

由于N1、N5、N10處理實(shí)際N2O充入量分別為705.48、10645.77、20200.19 μg N2O-N,與預(yù)設(shè)處理濃度稍有誤差,后續(xù)以實(shí)測(cè)量為基礎(chǔ)進(jìn)行計(jì)算和分析。

圖2 淺表層水稻土柱上部N2O釋放動(dòng)態(tài)與土柱底部N2O消減動(dòng)態(tài)Fig.2 Dynamics of inputting N2O content in the headspace and bottom space of 0—5 cm soil layer during flooding incubation

圖2顯示,土柱底部添加的外源N2O氣體量均隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而呈指數(shù)形式迅速降低。在培養(yǎng)172 h后,所有處理中的底部N2O含量值均接近于0,表明外源添加的N2O氣體已全部擴(kuò)散、遷移進(jìn)了原狀土柱。三個(gè)N2O濃度處理上部空間N2O量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)基本一致,均呈現(xiàn)先增后降的動(dòng)態(tài)變化,但高峰時(shí)間略有差別。N5、N10處理的土柱上部空間N2O氣體量在培養(yǎng)第45 h左右達(dá)到最高峰,分別占?xì)怏w添加總量的7.17%、9.76%,N1處理在培養(yǎng)第22小時(shí)即達(dá)到峰值,N2O量占?xì)怏w添加總量的9.80%,說(shuō)明5 cm淺表層水稻土在淹水狀態(tài)下對(duì)N2O氣體的截留率極高。隨后上部空間逸出的N2O量持續(xù)降低,進(jìn)一步說(shuō)明土體對(duì)上層空間N2O有吸收作用,隨著時(shí)間延長(zhǎng)外源N2O幾乎可被全部吸收。

表2 不同處理水稻土柱淹水培養(yǎng)期N2O消耗量差異

不同小寫(xiě)字母代表N2O添加處理間差異顯著(P<0.05)

圖3 淺表層水稻土柱N2O平均消耗速率與底部添加N2O量的線性關(guān)系Fig.3 Linear relationship of N2O average consumption rate and N2O addition of surface paddy soil layer

培養(yǎng)期內(nèi)N2O消耗總量通過(guò)培養(yǎng)起始點(diǎn)(0 h)與結(jié)束點(diǎn)(172 h)裝置內(nèi)N2O量(上、下空間之和)的差值表示(表2)。結(jié)果顯示盡管N1、N5、N10處理N2O氣體添加量在培養(yǎng)起始點(diǎn)存在顯著差異(P<0.05),但經(jīng)過(guò)172 h密閉淹水培養(yǎng),三處理N2O消耗總量占初始N2O添加總量的97.11%—99.55%,說(shuō)明淺表層土壤對(duì)N2O的消耗能力很強(qiáng),且無(wú)論外源加入N2O量多少,均能夠被土壤基本消耗完全。而N1、N5、N10處理N2O平均消耗速率存在顯著差異(P<0.05)。N2O平均消耗速率隨N2O外源添加量的增加而增加,通過(guò)線性擬合分析發(fā)現(xiàn)(圖3),N2O平均消耗速率(Y)與外源N2O添加量(X)成顯著線性關(guān)系(P<0.01),表明淺表層水稻土柱N2O消耗能力會(huì)受到外源N2O添加量的刺激而顯著增強(qiáng)。

3.2 土壤含量變化

圖4 淺表層水稻土含量,含量和DOC含量在培養(yǎng)期內(nèi)的變化動(dòng)態(tài)Fig.4 Dynamics of concentration, and DOC concentration at 0h and 172 h of surface paddy soil layer不同小寫(xiě)字母代表處理間差異顯著(P<0.05)

可溶性有機(jī)碳結(jié)果(圖4)顯示表層水稻土柱中DOC含量在培養(yǎng)起始點(diǎn)均高于350 mg/kg,表明可利用的碳含量較為豐富。經(jīng)過(guò)淹水厭氧培養(yǎng)172 h后,各處理土壤DOC含量均被顯著消耗,N1、N5、N10處理DOC消耗量分別為126.38、134.50、212.33 mg/kg,消耗比例分別為35.60%、29.68%、48.61%。高濃度的N2O添加處理(N10)消耗了最多的DOC,由于DOC是供給微生物活動(dòng)的直接C源,側(cè)面反映高濃度N2O添加刺激了較多的微生物響應(yīng)。

3.3 氧化亞氮還原酶基因豐度變化

土壤細(xì)菌氧化亞氮還原酶基因豐度結(jié)果(圖5)顯示,培養(yǎng)起始點(diǎn)三處理土壤nosZI基因拷貝數(shù)量平均為1.20×109copies/g干土,而nosZII基因豐度則為nosZI基因豐度的2倍以上。此外,nosZI和nosZII基因拷貝數(shù)在淹水厭氧培養(yǎng)172 h后變化趨勢(shì)明顯不同。不同濃度外源N2O添加均引起了nosZI基因豐度的顯著增加,N1、N5、N10處理nosZI基因拷貝數(shù)分別增加了4.46×108、5.91×108、9.91×108。nosZI基因拷貝數(shù)增幅基本上隨N2O添加量增加而增加,表明外源N2O的添加刺激了含nosZI基因微生物數(shù)量的增長(zhǎng)。而nosZII基因數(shù)量對(duì)不同N2O添加濃度的響應(yīng)存在差異,N1處理低濃度N2O添加促進(jìn)了nosZII基因拷貝數(shù)的增長(zhǎng)(增長(zhǎng)幅度約為32.35%),N5、N10處理nosZII基因豐度無(wú)顯著變化,表明添加的高濃度N2O對(duì)含nosZII基因的微生物生長(zhǎng)無(wú)明顯激發(fā)作用。

圖5 淺表層水稻土細(xì)菌nosZ基因豐度在培養(yǎng)期內(nèi)的變化動(dòng)態(tài)Fig.5 Dynamics of nosZ gene abundance at at 0 h and 172 h of surface paddy soil layer不同小寫(xiě)字母代表nosZI處理間差異顯著(P<0.05), 不同大寫(xiě)字母代表nosZII處理間差異顯著(P<0.05)

3.4 淺表層水稻土N2O氧化亞氮消耗速率與相關(guān)土壤因子關(guān)系

表3 淺表層水稻土N2O消耗速率與N2O添加量及相關(guān)土壤因子相關(guān)系數(shù)

Table 3 Pearson′s correlation coefficients for relationships between N2O consumption rates and N2O addition, relative soil variables of surface paddy soil layer

N2O添加量N2O additionsN2O平均消耗速率N2O consumption ratesNH+4-N消耗量NH+4-N consumptionNO-3-N消耗量NO-3-N consumptionDOC消耗量DOC consumptionnosZI基因增加量nosZI gene copies incrementnosZII基因增加量nosZII gene copies incrementN2O添加量N2O additions1.00N2O平均消耗速率N2O consumption rates0.98??1.00NH+4-N消耗量NH+4-N consumption0.83??0.83??1.00NO-3-N消耗量NO-3-N consumption-0.82??-0.86??-0.91??1.00DOC消耗量DOC consumption0.87??0.79?0.50-0.501.00nosZI基因增加量nosZI gene copies increment0.93??0.86??0.68?-0.620.92??1.00nosZII基因增加量nosZII gene copies increment-0.84??-0.86??-0.95??0.88??-0.53-0.67?1.00

** 相關(guān)性在0.01水平上顯著; * 相關(guān)性在0.05水平上顯著

4 討論

農(nóng)業(yè)土壤是大氣N2O排放的重要來(lái)源之一,土壤中的N2O主要是通過(guò)一系列土壤微生物作用驅(qū)動(dòng)產(chǎn)生的。而后N2O氣體在土壤剖面內(nèi)遷移擴(kuò)散,部分被土壤反硝化微生物利用進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為分子氮(N2),部分被截留在土壤水、土壤孔隙中,剩余部分才能以N2O形式排出土壤表面[3]。土壤體截留、消耗一部分N2O后,土表N2O排放量并不總是與土壤剖面中累積的N2O產(chǎn)生量直接相關(guān)。Gao等通過(guò)野外監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)頻繁淹水的河岸帶土壤剖面中N2O含量升高的同時(shí),土表N2O排放量并未顯著變化,推測(cè)可能是在持續(xù)厭氧的淹水環(huán)境下土壤中累積的N2O在遷移至土表前已被大量消耗[5]。本研究采用從0—5 cm土柱底部外源添加N2O氣體的方法,模擬了累積在5 cm土壤深度的N2O氣體遷移通過(guò)土柱后的排放動(dòng)態(tài)。結(jié)果顯示底部外源添加的三個(gè)濃度的N2O氣體量均迅速降低,遷移擴(kuò)散進(jìn)了水稻土柱,但通過(guò)土柱后排放出的N2O量最高值也僅占添加總量的7.17%—9.80%,暗示0—5 cm表層水稻土在淹水厭氧狀態(tài)下可截留、消耗5 cm深度N2O積累量的90%以上。Wang等通過(guò)對(duì)0—20 cm原狀水稻土柱剖面N2O含量和土表N2O排放量動(dòng)態(tài)耦合關(guān)系研究發(fā)現(xiàn),0—5 cm土層產(chǎn)生的N2O大量損失,每天的N2O排放量?jī)H占總損失量的10%左右,約90%的N2O以其他途徑消耗損失[9]。這部分N2O損失途徑可能是被還原轉(zhuǎn)化為N2、溶解于土壤水中或是停留在土壤孔隙中[15],因此持續(xù)淹水條件下稻田土壤N2O排放量很低,甚至?xí)霈F(xiàn)N2O負(fù)排放的現(xiàn)象[16,17]。

5 結(jié)論