馮漢宇　孫艷梅　洪燕　陳剛　韓立新　何京京　任君安

摘要 為了了解不同粒色玉米糊粉層含量與成分，對14個株系不同色籽粒糊粉層進(jìn)行剝離、稱重，取一些株系籽粒糊粉層進(jìn)行紙層析和染色觀察，結(jié)果表明不同色糊粉層重差異顯著，重量10～20 mg，均值為14 mg，整粒籽粒糊粉層含量處于3.2%～8.2%，均值為5.7%;經(jīng)過酸性的one-step blue染色的含花青素的糊粉層細(xì)胞呈鮮紅和粉紅色，碘-碘化鉀染色的呈黃色，組化染色與分析發(fā)現(xiàn)糊粉層可能主要含有2種花青素和蛋白質(zhì)，糊粉層細(xì)胞染色觀察表明細(xì)胞主要含纖維素、蛋白質(zhì)和花青素。

關(guān)鍵詞 粒色;成分;糊粉層含量;染色

中圖分類號 TS207.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）21-0170-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.051

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Aleurone Layer Content and Component Analysis of Different Kernels Color Maize

FENG Hanyu， SUN Yanmei， HONG Yan et al

（Beijing AgroBiotechnology Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Beijing 100097）

Abstract In order to understand the content and composition of aleurone layer in maize with different kernel colors， the aleurone layer of 14 lines with different kernel colors was peeled and weighed， and the aleurone layer of some lines was observed by paper chromatography and dyeing. The result showed that aleurone layer weights were significant different，the weights were 10-20 mg， the average value was 14 mg， the kernel aleurone contents were 3.2%-8.2%， the average value was 5.7%.Aleurone layer cells containing anthocyanins were fresh red and pink red by acid onestep blue dyeing and were yellow by iodineiodidum potassium dyeing.Aleurone layer mainly contained two kinds of anthocyanins and protain by test paper dyeing and analysis， aleurone cells mainly contained cellulose，protein and anthocyanins.

Key words Kernel color;Component;Aleurone layer content;Dye

基金項目 中國博士后科學(xué)基金面上項目（Z171100001117123）。

作者簡介 馮漢宇（1980—），男，河南鹿邑人，博士，從事作物遺傳育種及轉(zhuǎn)基因玉米研究。

收稿日期 2019-04-08

玉米、大麥、小麥、高粱和水稻5種谷物糊粉層的大小雖不同，但其結(jié)構(gòu)類似，糊粉層細(xì)胞壁一般較厚，胞質(zhì)內(nèi)主要為糊粉粒[1]。小麥糊粉層位于籽粒皮層的內(nèi)層，介于種皮和胚乳之間，占籽粒的6%～8%，一般不含淀粉[2]。淀粉遇碘-碘化鉀溶液變色，將碘-碘化鉀溶液滴在縱切或橫切的水稻穎果的切面上，直鏈淀粉為主的被染成藍(lán)黑色，支鏈淀粉為主的被染成紅褐色，個別秈糯稻糊粉層被染成藍(lán)色含有少量單粒淀粉體[3]。玉米糊粉層位于種皮內(nèi)層，介于種皮和胚乳之間（圖1），除黃橙白色籽粒外，其他色籽粒糊粉層一般含有花青素。該研究從不同色籽粒糊粉層重和含量入手，對糊粉層進(jìn)行理化染色，紙層析和顯微觀察，嘗試闡明不同色糊粉層之間的異同、糊粉層主要成分，以期為糊粉層加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以轉(zhuǎn)C1基因的京501株系與京24雜交（京501和京24由北京市農(nóng)林科學(xué)院陳剛研究員選育），在北京市農(nóng)林科學(xué)院內(nèi)，北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)房山基地和三亞市玉米研究中心崖城育種站經(jīng)過多代自交選育得到一些不同粒色株系，編號分別為A-30、A-28、A-45（11-1）、A-47（11-4）、A40-3（9-5）、A-43-5（10-2）、A-39（12-9）、B-14（9-2）、A-37（12-5）、A-44（10-7）、11-7和9-7;用吳忠義老師課題組提供的上海佑隆生物科技有限公司生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因CP4EPSPS速測試紙抽樣檢測表明有些株系A(chǔ)-45（11-1）和A-40-3（9-5）葉片含有轉(zhuǎn)入的CP4EPSPS，B-14（9-2）和A-37（12-5）不含CP4EPSPS（圖2），京501、HiⅡ為非轉(zhuǎn)基因材料。

1.2 試驗設(shè)計與方法

1.2.1 糊粉層剝離與稱量。取不同色玉米籽粒6粒，去掉下邊與黑層相連的一部分，用清水浸泡，參考Chrispeels[4]獲取糊粉層的方法并更改。第2天取糊粉層，用鑷子擠壓，將種皮與胚乳部分分離，然后用鑷子撕下糊粉層，如果不能夠撕下的就用刀片削下糊粉層，有些會帶有一些淀粉，把帶有淀粉的糊粉層片放在水里，去掉淀粉，然后一起裝入小自封袋，放在試驗臺上晾干，每天14粒，連續(xù)6 d，共6個重復(fù)。稱14個株系6個重復(fù)糊粉層重，并進(jìn)行差異顯著性分析，另取同樣14個株系的6粒稱重量，用于計算糊粉層含量，整粒籽粒糊粉層含量=糊粉層重/單粒重×100%，去果皮黑層糊粉層含量=糊粉層重/去果皮黑層粒重×100%，去果皮黑層和胚糊粉層含量=糊粉層重/去果皮黑層和胚的粒重×100%。

1.2.2 糊粉層染色與觀察。取晾干的糊粉層用武漢賽維爾生物科技有限公司的碘-碘化鉀染液和Biotium生物技術(shù)公司提供的酸性one-step blue蛋白質(zhì)染液染色，剝離的糊粉層片上可能會帶有淀粉，為了區(qū)分碘-碘化鉀對淀粉層和糊粉層的染色情況，對個別株系籽粒淀粉層進(jìn)行了染色，然后采用北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心的Leica熒光正置顯微鏡觀察，并用LASV4.5系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.2.3 糊粉層成分組化染色與紙層析。取稱重后5粒種子糊粉層片加入小離心管中，用小改錐研磨粉碎，加入1 mL蒸

餾水，室溫提取0.5 h，用層析濾紙吸取上清液，陰干后用pH為4.5含量95%的酸性乙醇染色，陰干后分別用pH為2.0的one-step blue和pH為2.0的酸性考馬斯亮藍(lán)R250染色。用吸管吸取上清液加入另外一個小離心管中，晾干，配制正丁醇、乙酸和水體積比4∶1∶5混合液和正丁醇、2 mol/L鹽酸體積比1∶1的混合液作為展開劑對幾個株系糊粉層研磨樣進(jìn)行紙層析[5]。

1.2.4 3個株系籽粒糊粉層細(xì)胞染色與觀察。取3個株系A(chǔ)-40-3、A-47和B-14籽粒刮離的糊粉層，放在小離心管里，用小改錐研磨，用小滴管吸取0.2 mL即8滴蒸餾水加入其中，磨碎以后，用小滴管吸取一些滴在載玻片上，用one-step blue染液和碘-碘化鉀染色，采用北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心的Leica熒光正置顯微鏡觀察，并用LASV4.5系統(tǒng)進(jìn)行顯微拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 單粒糊粉層重量與含量

通過對14個株系籽粒糊粉層進(jìn)行稱重和差異顯著性分析及糊粉層含量的計算，發(fā)現(xiàn)不同色糊粉層重差異顯著（表1）。重量在10～20 mg，均值為14 mg，9-7株系籽粒糊粉層最輕，B-14株系的糊粉層最重，分別為10和20 mg;整粒籽粒糊粉層含量處于3.2%～8.2%內(nèi)，均值為5.7%，去果皮黑層糊粉層含量在3.6%～9.0%，均值為6.3%，去果皮黑層和胚糊粉層含量在3.9%～9.7%，均值為6.8%，A-28株系籽粒糊粉層含量較少，11-7株系籽粒糊粉層含量較多。

2.2 糊粉層染色結(jié)果

經(jīng)過one-step blue染液染色的糊粉層為深淺不一的紅色，碘-碘化鉀染液染色的糊粉層為黃色，上面分布有黑色物質(zhì)。白色的HiⅡ糊粉層和黃色的京501糊粉層經(jīng)one-step blue染色后呈略微粉色，橙色的9-7糊粉層染色后為粉色，A-39、A-28、A-45、11-7和A-40-3株系籽粒糊粉層染色后為紅色;HiⅡ、京501和9-7株系籽粒的糊粉層經(jīng)碘-碘化鉀染色后黃色糊粉層上黑色物質(zhì)較少，A-39、A-28、A-45、11-7和A-40-3的株系籽粒糊粉層染色后黃色糊粉層上黑色物質(zhì)較多（圖3）。

2.3 淀粉層染色顯微觀察

觀察發(fā)現(xiàn)碘-碘化鉀染液染色的糊粉層色與淀粉層色不同，白色淀粉層染色后為黑藍(lán)色，不考慮目鏡倍數(shù)前提下，物鏡10倍視野下塊狀、顆粒狀淀粉為白色和黑藍(lán)色2種，物鏡20倍視野下發(fā)現(xiàn)塊狀、顆粒狀白色淀粉顆粒為白色，染色的黑藍(lán)色淀粉顆粒藍(lán)色加強，而且有些淀粉顆粒中部透亮（圖4）。

2.4 糊粉層染色顯微觀察

用酸性的one-step blue和碘-碘化鉀染色以后，顯微觀察發(fā)現(xiàn)含花青素的A-39、A-28、A-45、11-7和A-40-3株系籽粒糊粉層內(nèi)糊粉粒分為鮮紅和粉紅2種色，這可能與花青素種類及含量有關(guān)，京501、9-7和HiⅡ株系籽粒糊粉層內(nèi)染色的糊粉粒略微顯現(xiàn)淺粉色，糊粉粒外層有少量黑色絲狀物包著;碘-碘化鉀染色的含花青素的A-40-3、A-28、A-45、11-7和A-40-3糊粉粒與不含花青素的京501、9-7和HiⅡ糊粉粒都染成金黃色，外層包被有較多黑色絲狀物，不染色的糊粉粒色澤多樣，外層同樣被絲狀物包圍著，只是較密集，這可能與糊粉層片厚薄有關(guān)（圖5）。

2.5 組化染色的糊粉層成分

通過one-step blue，95%的酸性醇和考馬斯亮藍(lán)R250染色發(fā)現(xiàn)籽粒糊粉層含花青素的提取物質(zhì)在紙上呈線條狀分布，可分三層，一層磚紅色花青素，一層鮮紅色花青素，另外一層為藍(lán)綠色或藍(lán)紫色蛋白質(zhì)，比如A-47、B-14、A-43-5、A-30和A-45;只有個別株系籽粒糊粉層僅有藍(lán)色或綠色點狀物，可能是蛋白質(zhì)較少，比如A-39和A-40-3;自交系京501、9-7和HiⅡ只有一層藍(lán)色或綠色物質(zhì)，沒有紅色花青素（圖6）。對A-40-3、B-14、A-37（12-5）和A-45采用95%酸性乙醇，正丁醇、乙酸和水混合液，正丁醇、鹽酸混合液展開劑進(jìn)行花青素紙層析分析，發(fā)現(xiàn)花青素分為磚紅和鮮紅2種色，只是分離不開（圖7）。

2.6 碘-碘化鉀與one-step blue染色的糊粉層細(xì)胞成分

不染色的B-14糊粉層細(xì)胞成空室，壁較厚，流出的花青素顆粒紅色，one-step blue染色細(xì)胞鮮紅色，外有稀疏的纖維素包被，解離的花青素細(xì)胞物質(zhì)分散開來，纖維素呈網(wǎng)狀連接，粉紅色花青素顆粒分布其中，有個別藍(lán)色蛋白質(zhì)鑲嵌在花青素顆粒中。A-40-3糊粉層細(xì)胞的花青素顆粒被碘-碘化鉀染成黃紅色，不染色的看不清楚，one-step blue染色的有的細(xì)胞自溶，有的含有藍(lán)色螺旋狀蛋白顆粒，有的外層有少量黑色纖維素，內(nèi)層是紅色花青素顆粒，包圍著一些藍(lán)色螺旋狀蛋白質(zhì)，有的細(xì)胞部分纖維素解離，露出一些藍(lán)色螺旋狀蛋白質(zhì)，也有完整的細(xì)胞呈紅色，被稀疏的黑色纖維素包著。不染色的A-47糊粉層細(xì)胞花青素顆粒呈紫紅色，碘-碘化鉀染色的花青素顆粒呈金黃色，one-step blue染色的A-47糊粉層細(xì)胞呈凝膠狀，里面分布個別藍(lán)色蛋白顆粒（圖8）。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

糊粉層是介于種皮和胚乳之間的一層或幾層細(xì)胞，在禾谷類作物中廣泛存在，花青素在籽粒中是主要分布于糊粉層中的一種色素。該研究表明不同色籽粒糊粉層重存在差異，重量10～20 mg，整粒籽粒糊粉層含量為3.2%～8.2%，去果皮黑層籽粒糊粉層含量為3.6%～9.0%，去果皮黑層和胚的籽粒糊粉層含量為3.9%～9.7%，均值分別為5.7%、6.3%和6.8%;經(jīng)酸性one-step blue染液染色的含花青素糊粉粒分為鮮紅和粉紅2種色，組化染色分析表明糊粉層含有蛋白質(zhì)和2種類型的花青素，糊粉層細(xì)胞主要含有纖維素、花青素和蛋白質(zhì)。

3.2 討論

種植業(yè)生產(chǎn)過程主要涉及種苗繁育、種植、肥水管理、有害生物防治、收獲等[6]，關(guān)鍵控制點在于產(chǎn)地環(huán)境和投入品[7-8]，使用健康水，嚴(yán)格控制各種肥料、農(nóng)藥污染，才能促進(jìn)玉米安全生產(chǎn)[9]，無公害玉米栽培過程中可以使用化肥、低毒農(nóng)藥進(jìn)行病蟲草害防治[10];該研究的玉米在選育和種植過程中，各試驗點肥水管理和有害生物防治不同，在農(nóng)林科學(xué)院內(nèi)基地用井水灌溉，底肥施用復(fù)合肥，生育期間追氮肥，人工鋤草，在崖城試驗站主要靠井水灌溉，磷鉀肥作底肥，播種后除草劑封閉，生育期間追氮肥，除草劑除草，房山基地播種前澆底墑水，生育期期間依靠降雨，人工鋤草;各試驗點都進(jìn)行套袋授粉確保純度和質(zhì)量，在籽粒接近成熟的黃熟期收獲，環(huán)境因素對籽粒糊粉層含量和成分影響不大。玉米濕法加工制備淀粉及副產(chǎn)物的過程，一般采用二氧化硫和乳酸浸泡液浸泡 [11];該試驗采用清水浸泡玉米籽粒1 h，去種皮和黑層，然后再取出胚，需一直保持籽粒濕潤，軟化后才能剝離，晾干。小麥糊粉層含有大量蛋白質(zhì)和纖維素，藍(lán)粒小麥糊粉層含有花青素[12]，薏苡種子糊粉層細(xì)胞內(nèi)充滿大量糊粉粒，糊粉粒含蛋白質(zhì)和不溶性多糖[13]，水稻種子糊粉層也含有大量蛋白質(zhì)[14-16]，該研究表明含花青素的玉米糊粉層細(xì)胞主要含纖維素、蛋白質(zhì)和花青素。

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