張媛 王小艷 陳博 李義 佟毅

摘 ?????要： 為獲得高產(chǎn)高光學(xué)純D-乳酸生產(chǎn)菌，本研究從篩選得到的一株耐高溫耐高糖的植物乳桿菌出發(fā)，利用基因工程技術(shù)，敲除其中與L-乳酸合成相關(guān)的基因，引入或增強(qiáng)D-乳酸脫氫酶活性，構(gòu)建了一株基因工程菌Lp-DA。該菌株可45℃發(fā)酵，產(chǎn)乳酸近200 g/L，D-乳酸光學(xué)純度達(dá)到99.9%，為光學(xué)純D-乳酸工業(yè)生產(chǎn)提供了新的菌株選擇。

關(guān) ?鍵 ?詞：D-乳酸;植物乳桿菌;光學(xué)純;基因敲除;基因敲入

中圖分類號(hào)：TQ 78 ??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ??????文章編號(hào)： 1671-0460（2019）04-0674-06

Abstract： ?In order to obtain high-yield and high-optical pure D-lactic acid producing strain， a strain of Lactobacillus plantarum with high temperature and sugar tolerance was screened out. Starting from this strain， a genetically engineered strain Lp-DA was constructed by knocking out the genes related to L-lactic acid synthesis and introducing or enhancing the activity of D-lactic acid dehydrogenase. This strain can be fermented at 45 ℃ to produce nearly 200 g/L of lactic acid， and the optical purity of D-lactic acid can reach 99.9%. It provides a new strain option for industrial production of optical pure D-lactic acid

Key words： ?D-lactic acid; Lactobacillus plantarum; optical pure; gene knockout; gene knockin

聚乳酸（Poly-lactic acid，PLA）是一種以乳酸為主要原料聚合得到的聚合物，利用生物質(zhì)資源作為原料，來(lái)源豐富而且可再生。聚乳酸的生產(chǎn)過(guò)程無(wú)污染，其產(chǎn)品可以生物降解，實(shí)現(xiàn)在自然界中的循環(huán)，與有限的石油和化石資源相比，生物質(zhì)資源的優(yōu)勢(shì)在于不會(huì)有釋放到大氣中的凈二氧化碳[1]，因此是理想的綠色高分子材料，具有廣闊的市場(chǎng)前景。近年來(lái)聚乳酸技術(shù)的突破提高了其力學(xué)、耐熱、耐久性能及生物相容性，促進(jìn)了聚乳酸在高性能、高附加值材料領(lǐng)域的應(yīng)用拓展[2]。國(guó)內(nèi)外許多研究表明聚L-乳酸和聚D-乳酸的共聚可提高其機(jī)械性能、熱穩(wěn)定性等，實(shí)現(xiàn)聚乳酸材料的改性[3，4]，拓寬了聚乳酸的應(yīng)用范圍。

乳酸（Lactic acid）又叫α-羥基丙酸、丙醇酸，根據(jù)其結(jié)構(gòu)中的手性碳原子劃分為L(zhǎng)-乳酸和D-乳酸。聚乳酸的合成需使用高光學(xué)純度的乳酸單體作為前體。高光學(xué)純度的D-乳酸，因其可被用來(lái)提高聚乳酸材料的性能而備受關(guān)注。利用發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸具有生產(chǎn)成本低、產(chǎn)物光學(xué)純度和安全性高、生產(chǎn)條件溫和、污染小等優(yōu)點(diǎn)。然而，大多數(shù)乳酸菌只能同時(shí)生產(chǎn)L-乳酸和D-乳酸，只有極少數(shù)的天然乳酸菌和一些模式工程菌可用于專門(mén)生產(chǎn)D-乳酸，這些菌株D-乳酸產(chǎn)量和光學(xué)純度仍需要進(jìn)行大幅度的提升，因此，在通過(guò)微生物發(fā)酵法大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)D-乳酸時(shí)，目前可選擇的菌株仍然十分有限。由此，高產(chǎn)高光學(xué)純度D-乳酸的發(fā)酵菌株成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

本研究從大曲樣品中篩選獲得耐高溫高糖的乳酸菌，并利用基因工程技術(shù)，敲除其中與L-乳酸合成相關(guān)的基因，并引入或增強(qiáng)D-乳酸脫氫酶的活性，構(gòu)建一株高產(chǎn)高光學(xué)純度的D-乳酸工程菌，達(dá)到提高D-乳酸產(chǎn)量和光學(xué)純度的目的。為光學(xué)純D-乳酸工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵菌株提供了新的選擇。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 ?菌株及培養(yǎng)條件

大腸桿菌DH5α菌株為購(gòu)于全式金公司的Trans5α感受態(tài)，培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)，篩選用抗生素濃度為25 μg/mL 氯霉素或250 μg/mL紅霉素。

植物乳桿菌Lp43#篩選自大曲樣品，培養(yǎng)使用MRS培養(yǎng)基。37～45 ℃培養(yǎng)，篩選用抗生素濃度為10 μg/mL 氯霉素或10 μg/mL紅霉素。

1.1.2 ?酶和試劑

EasyTaq Mix，DNA Assembly Mix，DNA marker，凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等購(gòu)于全式金公司;PrimeStar DNA聚合酶購(gòu)于TaKaRa公司;基因組提取試劑盒購(gòu)于TIANGEN公司;限制性內(nèi)切么、DNA連接酶購(gòu)于NEB公司;紅霉素、氯霉素等購(gòu)于Solarbio公司。

1.1.3 ?培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.0。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、檸檬酸二銨2.0 g/L、無(wú)水乙酸鈉5.0 g/L、硫酸錳0.25 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、吐溫80 1.0 mL/L，pH 6.5;MRS固體培養(yǎng)基：在上述MRS液體培養(yǎng)基中添加瓊脂20 g/L;MRS-CaCO3平板：MRS固體培養(yǎng)基中再加入CaCO3 10 g/L;發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖180～200 g/L、酵母提取物10 g/L、乙酸鈉2 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、MnSO4·H2O 0.25 g/L、吐溫80 1 ml/L、CaCO3 90～100 g/L，pH 6.5。

1.2 ?實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ?菌株的分離篩選

將1 g大曲樣品搗碎后用10 mL無(wú)菌生理鹽水溶解，充分混勻30 min;取上述稀釋液10倍梯度稀釋后涂布于MRS-CaCO3平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取透明圈較大的菌落接種MRS培養(yǎng)基，37 ℃ 150 r/min培養(yǎng)1 h，取5 μL培養(yǎng)液點(diǎn)在MRS-CaCO3平板上，將平板放置于45 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 h;挑選平板中菌落生長(zhǎng)較快并且溶鈣圈較大的幾個(gè)單菌落再次轉(zhuǎn)接MRS培養(yǎng)基，37 ℃ 150 r/min培養(yǎng)1 h，取5 μL培養(yǎng)液點(diǎn)在MRS-CaCO3固體平板上，將平板放置于48 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。挑選其中溶鈣圈比較明顯的備選菌株保存并進(jìn)行發(fā)酵搖瓶實(shí)驗(yàn)。

將備選菌株接種MRS培養(yǎng)基，37 ℃ 150 r/min過(guò)夜培養(yǎng)獲得種子液，在30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中按照10%（v/v）的比例接種上述種子液，37 ℃ 150 r/min搖床培養(yǎng)3～5 h讓菌株生長(zhǎng)，然后升溫到45 ℃或48℃，繼續(xù)以150 r/min搖床培養(yǎng)72 h獲得發(fā)酵液。發(fā)酵結(jié)束后通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物中的乳酸，篩選出高溫高糖條件下產(chǎn)乳酸較快、乳酸產(chǎn)量較高的菌株。

1.2.2 ?菌株鑒定

篩選獲得的菌株通過(guò)顯微鏡檢測(cè)菌株形態(tài)，并結(jié)合16S rDNA 測(cè)序方法，鑒定菌株分類。

1.2.3 ?重組質(zhì)粒構(gòu)建

基因敲除質(zhì)粒構(gòu)建：使用對(duì)應(yīng)引物（表1）分別擴(kuò)增大腸桿菌復(fù)制子p15Aori（來(lái)自商業(yè)載體pACYC）、紅霉素抗性基因EmR（來(lái)自商業(yè)載體pMG36e）、待敲除基因CDS上游1 000 bp序列（擴(kuò)增自Lp43#基因組）、氯霉素啟動(dòng)子P32、氯霉素抗性基因CmR（來(lái)自商業(yè)載體pNZ8148）和待敲除基因CDS下游 1000 bp序列（擴(kuò)增自Lp43#基因組），使用DNA Assembly重組試劑盒組裝成為基因敲除質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入Trans5α感受態(tài)，氯霉素和紅霉素抗性，經(jīng)測(cè)序鑒定，獲得pKO-GeneX系列質(zhì)粒，GeneX為ldhL1、ldhL2或larA（圖1）。

基因插入質(zhì)粒構(gòu)建：分別合成待插入基因植物乳桿菌的ldhD（Gene ID：1061762）和德氏乳桿菌ldhA（Gene ID：4085369）基因的CDS序列，并在起始密碼子之前和終止密碼子之后分別加入XhoI和BamHI酶切位點(diǎn)，雙酶切獲得待插入基因的片段;將前面構(gòu)建的pKO質(zhì)粒同樣用XhoI和BamHI雙酶切獲得去除了氯霉素抗性基因的載體片段，將經(jīng)過(guò)同樣雙酶切并純化后的載體和基因片段用DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)入Trans5α感受態(tài)，紅霉素抗性，經(jīng)測(cè)序鑒定，獲得基因插入質(zhì)粒，命名為pKI-X：GeneY，GeneY為ldhD或ldhA（圖2）。

1.2.4 ?植物乳桿菌電轉(zhuǎn)化

接種平板活化的植物乳桿菌單菌落于4 mL MRS培養(yǎng)基中37 ℃ 150 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，按初始OD600= 0.2轉(zhuǎn)接至100 mL含1%甘氨酸的MRS培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至OD600= 0.6;菌液冰浴20 min，4 ℃、8 000×g離心15 min收集菌體;用100 mL 4℃預(yù)冷的1 mM MgCl2和30% PEG1000依次沖洗菌體1次;用1 mL 4 ℃預(yù)冷的30% PEG1000重懸菌體，每份分裝100 μL感受態(tài)。

每份感受態(tài)細(xì)胞加入5 μg重組質(zhì)粒，冰浴10 min，使用0.2 cm電轉(zhuǎn)杯，1.5 kV、25 F、200 Ω電擊，迅速加入0.8 mL MRS-SM培養(yǎng)基（在MRS培養(yǎng)基中加入0.5 M蔗糖和0.1 M MgCl2），37 ℃培養(yǎng)2 h，離心1 min，去掉部分上清后重懸涂布于含抗生素的MRS平板上，37 ℃培養(yǎng)2 d獲得單菌落。

1.2.5 ?基因敲除菌株篩選

植物乳桿菌中電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入基因敲除質(zhì)粒，氯霉素抗性篩選，并使用對(duì)應(yīng)鑒定引物菌落PCR，獲得有2條條帶的發(fā)生了第一次交換的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，挑選1～2個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子用含氯霉素的MRS液體培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，每2代劃線并菌落PCR篩選僅剩較小一條條帶，即為第二次交換成功的菌株，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)目標(biāo)基因已敲除，即獲得目標(biāo)基因敲除的植物乳桿菌菌株。

1.2.6 ?基因插入菌株篩選

在植物乳桿菌敲除菌株中轉(zhuǎn)入對(duì)應(yīng)的基因插入質(zhì)粒，紅霉素抗性篩選，并使用對(duì)應(yīng)鑒定引物菌落PCR，獲得有2條條帶的發(fā)生了第一次交換的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，挑選1～2個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子用無(wú)抗MRS液體培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)用于篩選第二次交換的菌株，成功發(fā)生基因插入的菌株菌落PCR結(jié)果應(yīng)僅剩一條偏大條帶，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)目標(biāo)基因已插入到基因組中對(duì)應(yīng)位置，即獲得目標(biāo)基因敲入的植物乳桿菌菌株。

1.2.7 ?發(fā)酵方法

將菌株接種20 mL MRS培養(yǎng)基，37 ℃ 150 r/min過(guò)夜培養(yǎng)獲得種子液。然后，在100 mL產(chǎn)酸發(fā)酵培養(yǎng)基中按照10%（v/v）的比例接種上述種子液，37 ℃ 150 r/min培養(yǎng)6 h讓菌株生長(zhǎng)，然后維持37 ℃或升溫至45 ℃，繼續(xù)以150 r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)66 h獲得發(fā)酵液，發(fā)酵過(guò)程中定期取樣檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物。

1.2.8 ?產(chǎn)物分析

乳酸、葡萄糖等濃度檢測(cè)方法：色譜儀為Agilent Technologies 1260 Infinity II;檢出器RID;分離柱為Aminex HPX-87H Column 300 mm×7.8 mm;流動(dòng)相0.005 M硫酸;流量0.5 mL/min;進(jìn)樣量20 μL。

乳酸的光學(xué)純度檢測(cè)方法：色譜儀為Agilent Technologies 1260 Infinity;檢出器波長(zhǎng)254 nm，靈敏度0.32AUFS;分離柱為MCI GEL-CRS10 W（3u）4.6 ID×50 mm;流動(dòng)相0.002 M硫酸銅;流量0.5 mL/min;進(jìn)樣量20 μL。根據(jù)峰面積計(jì)算L-乳酸和D-乳酸的比例。

增強(qiáng)乳酸發(fā)酵菌株對(duì)環(huán)境脅迫的抵抗力是提高乳酸發(fā)酵能力的方向之一，本研究通過(guò)篩選，獲得了耐高溫、高糖的乳酸發(fā)酵菌株。利用耐高溫菌株進(jìn)行發(fā)酵可以縮短生產(chǎn)周期、減少溫控所需的能耗以及減少雜菌污染的風(fēng)險(xiǎn);而耐高糖的性能有助于簡(jiǎn)化發(fā)酵工藝，提高乳酸總產(chǎn)量。

采用基因工程手段對(duì)乳酸高產(chǎn)菌株進(jìn)行改造，能進(jìn)一步提高其產(chǎn)酸效率和乳酸的光學(xué)純度。本研究使用同源重組的基因工程手段，敲除了植物乳桿菌中可能與L-乳酸合成相關(guān)的基因，并在同一位點(diǎn)替換了外源或內(nèi)源的D-乳酸脫氫酶基因，進(jìn)一步提高其活性。發(fā)酵結(jié)果分析認(rèn)為，敲除菌株ldhL1、ldhL2、larA基因后，阻斷了代謝途徑中可能的L-乳酸代謝，同時(shí)，菌株的乳酸積累不受這幾個(gè)基因缺失的影響，表明該植物乳桿菌的乳酸代謝過(guò)程中，乳酸脫氫酶的種類不是乳酸產(chǎn)量的限制因素。并且增加的D-乳酸脫氫酶活性更有助于提高D-乳酸的合成能力。改造后菌株與野生菌株相比，在乳酸產(chǎn)量和乳酸光學(xué)純度方面均有大幅提升。

同源重組方法是基因組改造的常用手段，產(chǎn)生的變化僅存在于基因組中，因此構(gòu)建的突變體具有較高的遺傳穩(wěn)定性。并且最終的菌株沒(méi)有選擇標(biāo)記和質(zhì)粒殘留，可避免常規(guī)基因工程菌培養(yǎng)體系復(fù)雜等問(wèn)題，安全性較高，也便于對(duì)菌株進(jìn)行進(jìn)一步的代謝途徑改造。

最終獲得的菌株Lp-DA可在45 ℃條件下發(fā)酵大量生產(chǎn)乳酸，并且僅合成D-乳酸，該重組D-乳酸生產(chǎn)植物乳桿菌提供了滿足光學(xué)純D-乳酸工業(yè)生產(chǎn)的新選擇。當(dāng)然，新菌株的工業(yè)應(yīng)用還需要與菌株特性相適應(yīng)的高效發(fā)酵工藝和低能耗的提取精制工藝，才能讓D-乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)更具競(jìng)爭(zhēng)力。

參考文獻(xiàn)：

[1] Hofvendahl， K， Hahn-Hagerdal B. Factors affecting the fermentative lactic acid production from renewable resources[J]. Enzyme Microb.Technol， 2000， 26：87–107.

[2] Lasprilla AJ， Martinez GA， et al. Poly-lactic acid synthesis for application in biomedical devices-A review[J]. Biotechnology Adv.， 2012， 30（1）：321–328.

[3] Ouchi T， Ichimura S， Ohya Y. Synthesis of branched poly（lactide） using polyglycidol and thermal， mechanical properties of its solution-cast film[J]. Polymer，2006， 47（1）：429–434.

[4] Tsuji H. Poly（lactide） stereocomplexes： formation， structure， properties， degradation， and applications[J]. Macromolecular Bioscience， 2005， 5（7）： 569–597.

[5] Zheng Z， Sheng B， et al. Relative catalytic efficiency of ldhL- and ldhD–encoded products is crucial for optical purity of lactic acid produced by Lactobacillus strains[J]. Appl Environ Microbiol， 2012， 78：3480-3.

[6] Siezen RJ， Francke C， et al. Complete resequencing and reannotation of the Lactobacillus plantarum WCFS1 genome[J]. J Bacteriol， 2012， 194：196-6.

[7] Okano K， Zhang Q， et al. Efficient production of optically pure D-lactic acid from raw corn starch by using a genetically modified L-lactate dehydrogenase gene-deficient and alpha-amylase-secreting Lactobacillus plantarum strain[J]. Appl Environ Microbiol， 2009， 75：462-7.

[8] Desguin B， Goffin P， et al. Lactate racemase is a nickel-dependent enzyme activated by a widespread maturation system[J]. Nat Commun，2014， 5：3615.

[9] Razeto A， Kochhar S， et al. Domain closure， substrate specificity and catalysis of D-lactate dehydrogenase from Lactobacillus bulgaricus[J]. J Mol Biol，2002， 318