張政 孫志藝 王涵琪 王集會(huì) 史磊

摘 ?????要：建立了用高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜法來檢測(cè)全蝎酶解液中蛋白類成分（>10 kDa） 的分析方法。采用未涂層彈性熔融石英毛細(xì)管柱（93 cm×0.75 μm），有效柱長(zhǎng)為79 cm;二極管陣列檢測(cè)器;50 mbar壓力進(jìn)樣10 s;運(yùn)行電壓為-30 kV;柱溫為20 ℃;運(yùn)行時(shí)間為60 min;考察不同檢測(cè)波長(zhǎng)、緩沖溶液種類、pH、濃度等對(duì)色譜峰的影響，并對(duì)10批樣品做了相似度評(píng)價(jià)。在緩沖溶液濃度為0.2 mol·L-1、pH=5.0硼酸緩沖溶液時(shí)響應(yīng)值較高，譜圖效果最好;檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm時(shí)出峰較多、吸收好，初步建立了以25個(gè)峰為共有峰的指紋圖譜。結(jié)論：25個(gè)峰的高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜共有模式可以作為全蝎酶解液中蛋白類成分（>10 kDa）的鑒別方法。

關(guān) ?鍵 ?詞：高效毛細(xì)管電泳;蛋白;全蝎酶解液

中圖分類號(hào)：R 284.2 ??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ??????文章編號(hào)： 1671-0460（2019）06-1144-05

Abstract： A method of protein detection of scorpion enzymolysis solution （>10 kDa） by HPCE was established. Elastic-uncoated-fused silica capillary column （93 cm×0.75 μm） with 79 cm effective column length was used as well as diode array detector， the sampling time at 50 mbar was 10 s， the operating voltage was 30 kV， the column temperature was 20 ℃， the operation time was 60 min.The effect of detection wavelength， buffer solution type， pH and concentration on chromatograms was investigated， meanwhile the similarity evaluation of 10 batches of samples was carried out. The results showed that， when 0.2 mol·L-1 borate with pH=5.0 was used as the buffer solution， the response value was higher， and the spectrum was the best. When the detection wavelength was 220 nm， the peak kinds was multiple and the UV absorbance was stronger， and the fingerprint spectrum of 25 peaks was established preliminarily. At last， it's pointed out that common model of HPCE chromatographic fingerprints of the 25 peaks can be used to detect the proteins of scorpion enzymolysis solution （>10 kDa）.

Key words： High performance capillary electrophoresis; Protein; Enzymolysis liquid of scorpion

動(dòng)物藥是我國(guó)傳統(tǒng)中藥中的重要組成部分，具有資源廣、活性強(qiáng)、療效獨(dú)特的特點(diǎn)。經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的研究發(fā)現(xiàn)，全蝎酶解液中的粗提混合物在體內(nèi)對(duì)荷瘤小鼠（Lewise肺癌）的抑制率稍弱于西藥對(duì)照藥順鉑，而其超濾物蛋白類成分體內(nèi)抗荷Lewise肺腺癌小鼠的活性強(qiáng)于順鉑常用量的療效[1，2]，這一結(jié)果充分地證明全蝎酶解物凍干粉蛋白類成分具有較強(qiáng)的抗肺腺癌的活性，而且主要物質(zhì)基礎(chǔ)是蛋白多肽類物質(zhì)，提純物具有更高的藥理活性，很有必要對(duì)其進(jìn)行成份研究。

目前，中藥成分分析的方法有很多，包括：高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）和高效毛細(xì)管電泳（HPCE）等色譜法[3]。其中，HPLC法最為常用，但用HPLC法進(jìn)行中藥成分分析有難以避免的缺點(diǎn)，像如分析時(shí)間長(zhǎng)、分辯率低、色譜柱容易被污染，會(huì)嚴(yán)重影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[4，5]。

毛細(xì)管電泳（CE），亦稱高效毛細(xì)管電泳（HPCE），是近十幾年來迅速發(fā)展起來的一種分析方法。以是高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和（或）分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一種液相分配技術(shù)[6]。與傳統(tǒng)的電泳技術(shù)和現(xiàn)代色譜技術(shù)相比，有以下幾個(gè)特點(diǎn)：微量、高效、分析速度快、分析對(duì)象廣、多模式、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保。毛細(xì)管電泳具有多種分離模式，有多種功能，應(yīng)用十分廣泛，通常能配制成溶液或懸浮溶液的樣品均能用CE進(jìn)行分離和分析[7，8]。毛細(xì)管電泳的柱效與分子擴(kuò)散系數(shù)成反比[9，10]，對(duì)于擴(kuò)散系數(shù)小、分子量較大的蛋白多肽類物質(zhì)的分析就有很大的優(yōu)勢(shì)，對(duì)中藥資源的研究起到了無可替代的推動(dòng)作用。為了更加精確的研究全蝎酶解液中抗腫瘤的蛋白類成分，特用高效毛細(xì)管電泳法來檢測(cè)。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?儀器

Agilent 3DEC高效毛細(xì)管電泳儀，配有二極管陣列檢測(cè)器;93 cm（有效柱長(zhǎng)為79 cm）×0.75 μm未涂層彈性熔融石英毛細(xì)管柱。

1.2 ?試劑

全蝎酶解液凍干粉樣品（分子量>10 kDa）由山東中醫(yī)藥大學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制，硼砂，硼酸，磷酸，磷酸二氫鉀，0.1 mol·L-1氫氧化鈉。實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為純凈水。

2 ?方法與結(jié)果

2.1 ?供試品的制備

精密稱取全蝎酶解液凍干粉（相對(duì)分子量>10 kDa）0.4 g，加6 mL純凈水溶解，于10 mL容量瓶中，加純凈水定容，用0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液作為供試品[11]。

2.2 ?電泳條件

未涂層彈性熔融石英毛細(xì)管柱（93 cm×0.75 μm）， 有效柱長(zhǎng)為79 cm;二極管陣列檢測(cè)器;50 mbar壓力進(jìn)樣10 s[2]; 運(yùn)行電壓為-30 kV;柱溫20 ℃[3];供試品用相應(yīng)的緩沖溶液稀釋一倍。毛細(xì)管使用前依次用0.1 mol·L-1氫氧化鈉、純凈水沖洗毛細(xì)管 5 min， 再用緩沖液沖洗至基線平穩(wěn)后開始進(jìn)樣，每?jī)纱芜M(jìn)樣之間設(shè)定緩沖液沖洗 5 min[12-14]。上述試劑使用前均用0.45 μm微孔濾膜濾過。

2.3 ?單因素考察

2.3.1 ?檢測(cè)波長(zhǎng)確定[4]

按照本實(shí)驗(yàn)2.2中的固定電泳條件，在0.2 mol·L-1的硼酸緩沖溶液;pH 5.0條件下，分別在波長(zhǎng)220、245、280 nm進(jìn)行測(cè)定，記錄并分析不同波長(zhǎng)條件下的色譜圖，見圖1。

結(jié)果顯示，在檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm時(shí)吸收峰較多，強(qiáng)度適宜。故選將檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為220 nm。

2.3.2 ?緩沖溶液種類的確定

按照本實(shí)驗(yàn)2.2中的固定電泳條件，在檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm;pH=5.0條件下，分別選用硼砂緩沖溶液[4]、硼酸緩沖溶液[15]、磷酸緩沖溶液[16]進(jìn)樣分析，觀察色譜峰情況，見圖2。

由圖2可知，緩沖溶液為硼砂緩沖溶液時(shí)，色譜峰很少，強(qiáng)度很低;為磷酸緩沖溶液時(shí)，不出峰;為硼酸緩沖溶液時(shí)，色譜峰數(shù)目比前幾種緩沖液要多，峰強(qiáng)度適宜。因此分析選擇硼酸緩沖溶液比較好。

2.3.3 ?緩沖溶液濃度的確定

按照本實(shí)驗(yàn)2.2中的固定電泳條件，在檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm;pH=5.0條件下，在選定硼酸緩沖溶液后，考察了不同緩沖液濃度（0.1、0.2、0.3 mol·L-1）對(duì)分離度的影響，見圖3。

由圖3可知，隨著緩沖溶液濃度增加，色譜峰強(qiáng)度減弱，分析時(shí)間延長(zhǎng)。綜合譜圖分析，選擇0.2 mol·L-1硼酸緩沖溶液色譜峰形最好。

Fig.3 A （0.1 mol·L-1 boric acid buffer solution）， B （0.2 mol·L-1 boric acid buffer solution）， C （0.3 mol·L-1 boric acid buffer solution）

2.3.4 ?緩沖溶液pH的確定[4]

按照本實(shí)驗(yàn)2.2中的固定電泳條件，在0.2 mol·L-1的硼酸緩沖溶液;檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm條件下，本實(shí)驗(yàn)考察了pH=5.5、5.0、4.5不同pH時(shí)的分離狀況，見圖4。

由圖4可知，pH=5.5，出峰數(shù)目最少;pH=4.5次之;pH=5.0時(shí)最好。綜合譜圖分析，選擇pH=5.0時(shí)色譜峰峰形，分離效果最好。

2.4 ?方法學(xué)考察[10，11，17]

2.4.1 ?穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

一份供試品配置后0、2、6、10、24 h按照本實(shí)驗(yàn)所選的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣分析，選擇10號(hào)峰為參比峰，結(jié)果樣品在24 h內(nèi)，共有峰的相對(duì)遷移時(shí)間RSD<2.021%，相對(duì)峰面積RSD<3.001%，表明供試品在測(cè)定的24 h穩(wěn)定。

2.4.2 ?精密度實(shí)驗(yàn)

取同一試樣，按照本實(shí)驗(yàn)所選擇的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣分析6次，選擇10號(hào)峰為參比峰，計(jì)算共有峰的相對(duì)遷移時(shí)間RSD<2.217%，相對(duì)峰面積RSD<4.980%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 ?重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取6份全蝎酶解凍干粉，按照本實(shí)驗(yàn)所選的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣分析，選擇10號(hào)峰為參比峰，計(jì)算各峰的相對(duì)遷移時(shí)間、相對(duì)峰面積，計(jì)算RSD，計(jì)算出各峰的相對(duì)遷移時(shí)間RSD<2.972%，相對(duì)峰面積RSD<4.641%，證明本實(shí)驗(yàn)方法重現(xiàn)性好。

2.5 ?指紋圖譜的建立[18，19]

根據(jù)十批次樣品測(cè)定結(jié)果給出的峰數(shù)、峰面積和峰位（相對(duì)遷移時(shí)間）等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)的比較，確定優(yōu)化的指紋圖譜，見圖5。

2.6 ?指紋圖譜分析

2.6.1 ?共有指紋圖譜的標(biāo)定

2.6.2 ?相似度評(píng)價(jià)

取十批次已溶解的供試品于樣品管中，按照本實(shí)驗(yàn)所選擇的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣分析。比較十批次供試品的色譜圖，應(yīng)用EXCEL表格，對(duì)十批次進(jìn)樣數(shù)據(jù)分析，形成對(duì)照譜圖，見圖6。

經(jīng)共有模式譜圖計(jì)算相似度。見表1。

表1表明，本實(shí)驗(yàn)10批次進(jìn)樣得到譜圖的相似度都在0.999左右，證明本實(shí)驗(yàn)10批次進(jìn)樣得到的譜圖相似度好。

3 ?討 論

本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究了緩沖溶液對(duì)于分離的影響。本實(shí)驗(yàn)研究表明，采用在2.2中固有的實(shí)驗(yàn)條件下，采用檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm;0.2 mol·L-1的硼酸緩沖溶液;pH=5.0時(shí)對(duì)全蝎酶解液蛋白類成分檢測(cè)效果好，由本實(shí)驗(yàn)獲得的高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜可以作為全蝎酶解液蛋白類成分（相對(duì)分子量>10 kDa）定性或定量的依據(jù)。

毛細(xì)管電泳技術(shù)的研究與應(yīng)用，為藥物分析、藥物研究等領(lǐng)域帶來了生機(jī)與活力，尤其是在中成藥復(fù)方制劑的分析研究、中藥材種屬的鑒定和基因工程藥物研究方面的進(jìn)展迅速[3，4]，令人矚目。

但毛細(xì)管電泳法也有難以完全改善的缺點(diǎn)。例如，毛細(xì)管柱內(nèi)徑很小，蛋白質(zhì)易于吸附堵塞，另外雖然通過改變緩沖溶液可以減少蛋白質(zhì)的吸附，但由于毛細(xì)管電泳分離模式的多樣性，蛋白質(zhì)吸附問題仍是亟待解決的問題之一。再有與HPLC相比，高效毛細(xì)管電泳存在重現(xiàn)性差的問題，雖然選擇了比較優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于蛋白質(zhì)的定量分析遠(yuǎn)不如高效液相色譜法簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性高。由于蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量大，不同蛋白的等電點(diǎn)也不相同，pH值改變，相對(duì)應(yīng)的蛋白的電泳方向可能也會(huì)發(fā)生改變，所以高效毛細(xì)管電泳法在目前來說并不是最優(yōu)的蛋白定量方法。

雖然如此，毛細(xì)管電泳技術(shù)在中藥復(fù)方制劑研究中仍發(fā)揮著重要的作用，隨著科技的不斷發(fā)展，相信毛細(xì)管電泳技術(shù)應(yīng)用將會(huì)更加廣泛。

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