龔小霞，李超，曹曦月，楊誠誠，黃超

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型研究室，成都611130）

FOXO基因家族是一類進(jìn)化過程中高度保守的叉 頭 轉(zhuǎn) 錄 因 子，由FOXO1、FOXO3、FOXO4 和FOXO6組成，它們?cè)诓煌慕M織中均有表達(dá)[1]，廣泛參與細(xì)胞的各種代謝功能，包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化及氧化應(yīng)激監(jiān)管等，是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子。它們的激活刺激了位于不同亞細(xì)胞區(qū)的抗氧化蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，如：超氧化物歧化酶-2（superoxide dismutase-2,SOD-2）、過氧化物還原酶3（peroxiredoxins 3, POD-3）和過氧化物還原酶5（peroxiredoxins 5, POD-5）、過氧化氫酶（catalase,CAT）及血漿中細(xì)胞外抗氧化蛋白（如硒蛋白P和銅藍(lán)蛋白）等，從而促進(jìn)了細(xì)胞的氧化防御[2]。其中，人叉頭轉(zhuǎn)錄因子O 亞型6（forkhead box class O6,FOXO6）作為最晚被克隆發(fā)現(xiàn)的FOXO家族的成員,在先前的研究中被認(rèn)為僅在哺乳動(dòng)物大腦中表達(dá)，但之后KIM等[3]發(fā)現(xiàn)其也在動(dòng)物的肝、腸、肺、腎、肌肉和脂肪等組織中表達(dá)。FOXO6 位于小鼠4 號(hào)染色體D1區(qū)，位于人類染色體1p34.1區(qū)[4]，其cDNA全長約1.6 kb，共編碼559個(gè)氨基酸。該基因具有2個(gè)保守的AKT/PKB 磷酸化位點(diǎn)（thr26 和Ser184），被AKT/PKB 磷酸化后，因缺乏核輸出序列（nuclear export sequences, NES），無法與CRM-1 聯(lián)系在一起[5]，故以一種不同于FOXO 家族其他成員的方式介導(dǎo)胰島素對(duì)靶基因的調(diào)控。目前對(duì)該因子的研究多集中于肝中葡萄糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，亦有少量研究表明，其在胃癌[6]、肺癌[7]、肝細(xì)胞癌[8]等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。但是已有研究對(duì)于其在膠質(zhì)瘤中的作用報(bào)道較少，其是否能對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)展進(jìn)程產(chǎn)生影響尚不明確。

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性腫瘤，約占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%，占所有惡性腦腫瘤的80%[9]。盡管神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生率很高，但是其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚不清楚，因而給治療帶來了一定的困難?；诖耍緦?shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建pRK5-myc-FOXO6 重組質(zhì)粒，探究其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活的影響，以期為進(jìn)一步研究FOXO6 在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其相關(guān)的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型研究室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

FOXO6 上下游特異性引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成；限制性核酸內(nèi)切酶NotⅠ和SalⅠ、PrimeSTAR Max 預(yù)混合物（2×）、10×QuickCut Green 緩 沖 液、RNAiso Plus、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ（TliRnaseH Plus）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser），均購自寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒（E.Z.N.A.Gel Extraction Kit）購自北京天根生化科技有限公司；T4 DNA 連接酶、10×T4 DNA 連接酶緩沖液、DMEM basic、DAPI 封閉劑（ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；100×青霉素-鏈霉素溶液及胰酶消化液購自合肥Biosharp 公司；質(zhì)粒抽提試劑盒（Plasmid Mini KitⅠ）購自美國OMEGA公司；TransEasyTM轉(zhuǎn)染試劑購自成都福際生物技術(shù)有限公司；一抗Anti-β-Actin（ACTB）和二抗羊抗鼠IgG（H+L）、HRP 偶聯(lián)物購自武漢博士德生物工程有限公司；一抗Anti-c-Myc Mouse 購自德國Merck Millipore 公司；ECL 顯色發(fā)光試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 FOXO6 片段的擴(kuò)增

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

根 據(jù)NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的GenBank DNA序列數(shù)據(jù)庫發(fā)布的FOXO6轉(zhuǎn)錄因子編碼序列，借助聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 6.0 進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，在上游引物中加入SalⅠ酶切位點(diǎn)，在下游引物中加入NotⅠ酶切位點(diǎn)，并在酶切位點(diǎn)前方加入相應(yīng)的保護(hù)堿基，交由生工生物工程（上海）有限公司合成。引物序列如下：上游引物5′-AAGAGTCGACCATGGCTGCGAA GCTGCGAGC-3′；下游引物5′-AAGGAAAAAAG CGGCCGCTCAGCCCGGCACCCAGCTCT-3′。

1.3.2 FOXO6 片段的擴(kuò)增

使用RNA抽提試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒，從腫瘤細(xì)胞U251 中提取RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA 為模板，利用PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，擴(kuò)增35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，與DNA 分子標(biāo)志物DL5000 進(jìn)行比較，篩選出長度為1 600 bp、有特異性且濃度較高的產(chǎn)物，然后用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.4 pRK5-myc-FOXO6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與測(cè)序

用限制性內(nèi)切酶NotⅠ和SalⅠ酶切載體pRK5-myc 和目的基因的PCR 產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收。然后在T4 DNA 連接酶的作用下，將酶切后的載體pRK5-myc 和目的基因回收片段置于10 μL體系中，于16 ℃條件下連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α 中，篩選陽性克隆菌落，并提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶NotⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定。將構(gòu)建成功的質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。

1.5 U251 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

將U251 細(xì)胞接種于含10 μL/mL 青鏈霉素及10% 胎牛血清的Dulbeco 改良MEM 培養(yǎng)基（Dulbeco’s modified eagle medium, DMEM）的6 孔板中，培養(yǎng)24 h左右，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%后開始轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 h 換液；將4 μL TransEasy 轉(zhuǎn)染試劑和4 μg 重組質(zhì)粒分別與100 μL 減血清培養(yǎng)基（opti-MEM）混勻，靜置5 min；然后將上述2種溶液混合，吹打數(shù)次使之充分混勻，靜置20 min；將TransEasy-重組質(zhì)粒復(fù)合物加入已接種U251 細(xì)胞的6孔板中，每孔200 μL，并以同樣的方法轉(zhuǎn)染空載體pRK5-myc作為對(duì)照；轉(zhuǎn)染完畢后于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，4～6 h 換液。培養(yǎng)36 h 后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)

在用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251 細(xì)胞36 h 后，收集各組細(xì)胞總蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）分離后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride, PVDF）上；用5%脫脂奶粉封閉1 h，經(jīng)三羥甲基氨基甲烷鹽酸吐溫（TBST）緩沖液洗滌后，加入一抗[Anti-β-Actin（ACTB）按1∶500 體積比稀釋，Anti-c-Myc Mouse按1∶1 000 體積比稀釋]，然后置于冰上輕搖、孵育過夜；用TBST洗滌膜3次后，再分別加入二抗[羊抗鼠IgG（H+L）、HRP偶聯(lián)物按1∶2 000體積比稀釋]，室溫輕搖、孵育1.5 h；最后用TBST 洗滌3 次，采用底物化學(xué)發(fā)光ECL法顯色1 min，使用MP全能成像儀顯影。

1.7 U251 細(xì)胞凋亡情況的檢測(cè)

1.7.1 細(xì)胞爬片

將預(yù)先處理好的蓋玻片置于6 孔板中，并在每孔滴加適量的多聚賴氨酸，于室溫下放置24 h 后，吸取出多余的多聚賴氨酸，并將蓋玻片用磷酸緩沖液（phosphate buffer solution,PBS）洗滌2次，然后鋪細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%后，進(jìn)行空載體pRK5-myc 和重組質(zhì)粒pRK5-myc-FOXO6 的轉(zhuǎn)染，然后置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)36 h，每4～6 h換液一次。

1.7.2 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚染色

U251 細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h 后，將6 孔板中的培養(yǎng)液吸出，并用PBS 洗滌2～3 次，每次1 min，然后使用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）染色封閉劑進(jìn)行封片，完畢后將其置于黑暗環(huán)境下室溫放置24 h，次日使用熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果。

1.8 過氧化物酶體增殖物激活受體γ 共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α,PGC-1α）表達(dá)的檢測(cè)

將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞采用Trizol 法提取RNA 后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，然后對(duì)cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,qPCR）擴(kuò)增。qPCR（20 μL）程序設(shè)置：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，共進(jìn)行39 個(gè)循環(huán)。各實(shí)驗(yàn)因子檢測(cè)均以h-β-actin為內(nèi)參，設(shè)立陰性對(duì)照，每個(gè)因子重復(fù)3 次，計(jì)算各樣品的△CT值，再用2-ΔΔCT法統(tǒng)計(jì)并計(jì)算各組樣品之間所有因子表達(dá)量的變化。

1.9 結(jié)果統(tǒng)計(jì)與分析

細(xì)胞凋亡結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因子方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 FOXO6 片段擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

使用FOXO6 上下游引物，從U251 細(xì)胞中提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，以得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得長度約1 600 bp 的DNA 片段（圖1），與預(yù)期目標(biāo)擴(kuò)增長度一致。

圖1 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

隨機(jī)挑取6個(gè)單菌落（圖2，泳道A～F），提取質(zhì)粒后用NotⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切，電泳結(jié)果（圖2，泳道C～F）顯示2條線性條帶，一條為大小約5 000 bp的pRK5-myc 質(zhì)粒，另一條為大小約1 600 bp 的FOXO6 條帶，與理論計(jì)算的FOXO6 片段堿基對(duì)數(shù)1 680 bp相符，表明目的基因已經(jīng)連接到質(zhì)粒上；將DNA 測(cè)序結(jié)果與GenBank 進(jìn)行比對(duì)表明，插入的DNA片段的序列與人源FOXO6基因的編碼序列完全一致（圖3）。

2.3 pRK5-myc-FOXO6 在U251 細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)

圖2 重組質(zhì)粒pRK5-myc-FOXO6雙酶切鑒定電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of recombinant plasmid pRK5-myc-FOXO6 using double enzyme digestion

將轉(zhuǎn)染了pRK5-myc-FOXO6 重組質(zhì)粒的U251 細(xì)胞培養(yǎng)36 h 后，收集各組細(xì)胞總蛋白，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)FOXO6 蛋白表達(dá)情況。使用Anti-c-Myc 抗體在分子質(zhì)量大小約70 kDa 處檢測(cè)到明顯的特異性條帶，說明pRK5-myc-FOXO6 重組質(zhì)粒在U251 細(xì)胞中成功表達(dá)；而空載體在相應(yīng)位置處無條帶，說明其未表達(dá)（圖4）。

2.4 U251 細(xì)胞凋亡情況的檢測(cè)

DAPI 染色結(jié)果（圖5）顯示，轉(zhuǎn)染pRK5-myc 空載體組中出現(xiàn)了少量以染色質(zhì)固縮、染色加深和細(xì)胞核裂解為表型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)染pRK5-myc-FOXO6重組質(zhì)粒組出現(xiàn)了更加明顯的凋亡現(xiàn)象，且細(xì)胞凋亡率（圖6）更大，表明FOXO6 能夠促進(jìn)U251細(xì)胞的凋亡。

2.5 PGC-1α 表達(dá)情況的qPCR 檢測(cè)

通過qPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染了pRK5-myc-FOXO6 重組質(zhì)粒的U251 細(xì)胞中，PGC-1α 的表達(dá)量明顯下降（圖7），這提示FOXO6導(dǎo)致的膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，可能是其抑制了PGC-1α 表達(dá)進(jìn)而影響了細(xì)胞的能量代謝及抗氧化過程，并最終導(dǎo)致了細(xì)胞的凋亡。

3 討論

圖3 重組質(zhì)粒pRK5-myc-FOXO6的測(cè)序結(jié)果Fig.3 Sequencing results of recombinant plasmid pRK5-myc-FOXO6

圖4 pRK5-myc-FOXO6蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Fig.4 Detection of pRK5-myc-FOXO6 protein expression by Western blotting

在能量代謝過程中，活性氧（reactive oxygen species, ROS）主要在線粒體中連續(xù)產(chǎn)生[10]，而當(dāng)大量的ROS 在體內(nèi)累積時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA 等在內(nèi)的細(xì)胞成分的損傷，破壞細(xì)胞信號(hào)的正常傳導(dǎo)機(jī)制，并可能引起細(xì)胞死亡[11]。PGC-1α 是細(xì)胞中一個(gè)重要的共轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。它與一系列轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相結(jié)合，參與下游眾多信號(hào)分子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進(jìn)而調(diào)控很多重要的細(xì)胞進(jìn)程。一方面，它可與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NRF1 相結(jié)合，參與調(diào)控線粒體能量代謝過程[12-13]；另一方面，它可以與過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1β（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1β, PGC-1β）等轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相結(jié)合，直接參與到細(xì)胞中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）、CAT 等抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，控制細(xì)胞的氧化防御能力[14]。因此，當(dāng)PGC-1α表達(dá)受到抑制的時(shí)候，細(xì)胞的能量代謝和氧化防御能力均會(huì)受到影響。此外，它能夠促進(jìn)線粒體的生物合成[15]，由于大多數(shù)細(xì)胞中線粒體是ROS的主要產(chǎn)生場(chǎng)所，因此其與ROS的生成關(guān)系密切。多項(xiàng)研究表明癌細(xì)胞比正常細(xì)胞保持著更高的ROS水平，細(xì)胞內(nèi)的ROS 可作為細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的第二信使[16]，這對(duì)腫瘤維持高增殖率、加速代謝和發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。但是，ROS 是一把雙刃劍，它也會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，促進(jìn)細(xì)胞的衰老和凋亡。因此，ROS 在癌細(xì)胞中的抗氧化機(jī)制比在正常細(xì)胞中更強(qiáng)。而在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，PGC-1α 能夠誘導(dǎo)抗氧化酶的表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[17]。STPIERRE 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α 可以通過誘導(dǎo)谷胱甘肽過氧化物酶1（glutathione peroxidase-1,GPx-1）和SOD-2 的表達(dá)參與氧化防御過程，PGC-1α 水平的增加可顯著保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激介導(dǎo)而引起的死亡。

圖5 U251細(xì)胞凋亡情況的DAPI染色檢測(cè)Fig.5 Apoptotic detection of U251 cells by DAPI staining

圖6 空載體組和轉(zhuǎn)染pRK5-myc-FOXO6 重組質(zhì)粒組的細(xì)胞凋亡率Fig.6 Cell apoptosis rate in empty group and transfected pRK5-myc-FOXO6 recombinant plasmid group

圖7 PGC-1α表達(dá)情況的qPCR檢測(cè)Fig.7 Expression of PGC-1α detected by qPCR

FOXO 家族是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，ROS可以激活FOXOs的表達(dá)，促使其參與細(xì)胞氧化防御過程：在氧化應(yīng)激狀態(tài)下FOXO1對(duì)β細(xì)胞發(fā)揮短暫的 保護(hù)作用[18]，F(xiàn)OXO3α 調(diào)控CAT 的生成[2]，F(xiàn)OXO4 可通過上調(diào)錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase, MnSOD）和CAT 來清除線粒體和細(xì)胞中的氧化應(yīng)激產(chǎn)物，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷[19]等。而FOXO6 是否也如該家族的其他成員一樣參與了氧化防御過程尚不明確，但是目前已經(jīng)證實(shí)FOXO6在腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用：LI等[6]的研究結(jié)果表明，F(xiàn)OXO6 與HNF4 結(jié)合形成復(fù)合物，激活C-myc的表達(dá)以促進(jìn)胃癌的進(jìn)程；而HU等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO6的過表達(dá)會(huì)抑制A549人肺癌細(xì)胞的增殖，但內(nèi)源性FOXO6 的表達(dá)下調(diào)則會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞的增殖。

目的基因進(jìn)入真核細(xì)胞并進(jìn)行高效復(fù)制和蛋白質(zhì)表達(dá)，需要裝入載體才能實(shí)現(xiàn)。而質(zhì)粒是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，具有分子質(zhì)量小、攜帶抗性基因、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點(diǎn)，因此是基因工程最常用的轉(zhuǎn)運(yùn)載體。我們的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了pRK5-myc-FOXO6 重組質(zhì)粒組中的PGC-1α 的表達(dá)量顯著下降，并且通過DAPI 染色發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pRK5-myc-FOXO6 重組質(zhì)粒組的細(xì)胞染色質(zhì)出現(xiàn)固縮、染色加深，細(xì)胞核破裂、解體等現(xiàn)象，細(xì)胞死亡率為28%，顯著高于轉(zhuǎn)染pRK5-myc 空載體組。這表明FOXO6能夠通過抑制PGC-1α的表達(dá)，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的能量代謝及其氧化防御進(jìn)程，從而促進(jìn)了U251細(xì)胞的凋亡，因此，F(xiàn)OXO6可能成為治療膠質(zhì)瘤的靶點(diǎn)，但是其具體作用機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路尚不明確。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的pRK5-myc-FOXO6重組質(zhì)粒因其帶有myc 標(biāo)簽而使載體具有高度的免疫靈敏性，這為后續(xù)深入研究FOXO6 抑制膠質(zhì)瘤的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為膠質(zhì)瘤的治療開辟了新的途徑。