趙悅伶，丁健，何佳，孔德棟，徐平*，王岳飛

（1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院茶葉研究所，杭州310058；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫研究所，杭州310058）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease, IBD）包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病，主要以結(jié)腸持續(xù)或周期性炎癥為特征。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，IBD的發(fā)病率在慢性病發(fā)病率中位列第2，僅次于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。我國(guó)潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病的患病率暫無確切統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，據(jù)研究人員推測(cè)，每10 萬中約有11.6 人次患潰瘍性結(jié)腸炎，每10 萬中約有1.4人次患克羅恩病，真實(shí)情況可能更加嚴(yán)峻[1]。IBD與增加的結(jié)腸氧化應(yīng)激、由結(jié)腸上皮細(xì)胞和浸潤(rùn)炎細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子及腸道屏障功能的喪失相關(guān)聯(lián)[2]。細(xì)胞因子在IBD發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。在試驗(yàn)性結(jié)腸炎和IBD患者體內(nèi)，由腸道固有層細(xì)胞分泌產(chǎn)生的白介素-6（interleukin-6, IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）（多指TNF-α）都有增加，并發(fā)揮促炎癥功能。T細(xì)胞產(chǎn)生的白介素-10（interleukin-10,IL-10）通過抗原呈遞細(xì)胞和T細(xì)胞抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[3]，相關(guān)的細(xì)胞因子治療方法已在IBD患者上使用。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate,EGCG）是茶葉中最具有活性的成分，具有抗氧化[4-5]、抗炎、抗腫瘤[6]等作用，如：EGCG對(duì)過氧化氫引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷有保護(hù)作用[7]，可降低人體血液中脂質(zhì)的過氧化水平[8]，對(duì)肝細(xì)胞氧化損傷具有積極的保護(hù)作用[9]等。流行病學(xué)調(diào)查研究表明，飲茶能夠降低潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病的發(fā)病率[10-13]，且在隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，每天服用400 mg 或800 mg 的EGCG 對(duì)5-氨基水楊酸或咪唑硫嘌呤耐藥的IBD病人有明顯的治療效果，且其副作用小[14]。

研究表明，兒茶素能夠抑制過度的氧化應(yīng)激和促進(jìn)抗氧化物質(zhì)的活化，減少結(jié)腸的氧化損傷，調(diào)控和活化炎癥相關(guān)的氧化應(yīng)激信號(hào)通路[15]。同時(shí)，兒茶素能夠調(diào)控Toll 樣受體4（Toll like receptor 4,TLR4）的表達(dá)，阻斷NF-κB的活化及調(diào)控上游核因子kappa-B 激酶抑制劑（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,IKK）復(fù)合物，抑制體內(nèi)TNF-α的表達(dá)[16]；兒茶素還能改善潰瘍性結(jié)腸炎，穩(wěn)定肥大細(xì)胞[17]。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)茶黃素和EGCG 能夠減少IBD 的炎癥情況，減少腸癌細(xì)胞的增殖[18]。而EGCG在腸道中是作用于腸上皮細(xì)胞還是腸道固有層細(xì)胞還未見報(bào)道。葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium, DSS）能夠破壞腸道的黏膜屏障及上皮細(xì)胞，使得腸道微生物能夠進(jìn)入固有層，從而產(chǎn)生持續(xù)性的炎癥反應(yīng)，因此，EGCG對(duì)炎癥性腸病的保護(hù)機(jī)制到底是修復(fù)了腸上皮細(xì)胞之間的緊密連接還是抑制了固有層細(xì)胞的炎癥因子分泌，還不太明確。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過DSS 誘導(dǎo)損傷，建立了小鼠的炎癥性腸炎模型，將小鼠腸道組織分離成腸上皮細(xì)胞和腸道固有層細(xì)胞，分別進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)以探究EGCG 對(duì)這2 種細(xì)胞的作用情況，并研究EGCG對(duì)炎癥小鼠小腸、脾及炎癥因子等的影響，評(píng)價(jià)EGCG 對(duì)炎癥性腸炎的保護(hù)作用，為闡釋EGCG對(duì)炎癥性腸病的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

雄性C57BL/6J小鼠（7周齡，清潔級(jí)，購(gòu)于上海斯萊科公司），于浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)征得浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意（ZJU20190004）。DSS（MP Biomedicals公司，美國(guó)）；96孔板（康寧公司，美國(guó)）；8連管（康寧公司，美國(guó)）；離心管[愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司]；EGCG（99%純度，浙江省湖州榮凱植物提取有限公司）；小鼠IL-6、IL-10、TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzymelinked immuno sorbent assay, ELISA）試劑盒（福建省泉州市科諾迪生物科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（qPCR RT master mix，TOYOBO 公司，日本）；Trizol 試劑、SYBR 熒光定量PCR 試劑盒（TaKaRa公司，日本）；無血清RPMI 1640 培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution,PBS）、雙抗溶液（杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；無水乙醇、甲醇、異丙醇、甲醛溶液（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉鹽（ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt, EDTA-2Na）（BIOSHARP 公司，中國(guó)）；二硫蘇糖醇（dithiothretiol, DTT）（Merck 公司，德國(guó)）；4 型膠原酶、焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate,DEPC）水[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

主要溶液的配制：

1）小鼠固有層消化液：將5%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、300 U/mL 4 型膠原酶溶解到50 mL無鈣鎂PBS溶液中。

2）小鼠腸上皮分離液：將5% FBS、1.86 g EDTA-2Na 和1 mmol/L DTT 溶解到1 000 mL 無鈣鎂平衡鹽溶液中。

3）DSS 水：將DSS 粉末溶解在無菌水中，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的溶液。

4）EGCG水：將99%EGCG粉末溶解在無菌水中，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的溶液。

1.2 儀器設(shè)備

醫(yī)用低溫保存箱（山東省青島海爾特種電器有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司），L600臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），Infinite M200Pro 酶標(biāo)儀（TECAN 公司，瑞士），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems 公司，美國(guó)），超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），明澈-D UV24純水/超純水一體機(jī)（彤迪科學(xué)儀器有限公司），CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]。

1.3 DSS 誘導(dǎo)的IBD 模型及EGCG 處理模型的建立

將7 周齡雄鼠隨機(jī)平均分為3 組，如表1 所示：空白組正常給水11 d；對(duì)照組為前7 d喂2%DSS溶液，后4 d 正常給水；EGCG 處理組為前7 d 喂2%DSS 溶液，后4 d 喂0.5%EGCG 溶液。每天對(duì)小鼠進(jìn)行稱量，觀察小鼠的活動(dòng)狀態(tài)及腹瀉、便血情況，并按照相應(yīng)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)予以評(píng)分。

表1 模型建立和分組Table 1 Model building and groups

1.4 結(jié)腸組織上清液制備

通過脫頸椎處死小鼠，并對(duì)各組進(jìn)行標(biāo)記。取小鼠腸組織（直腸+結(jié)腸），置于干凈的培養(yǎng)皿中，加入預(yù)冷的PBS溶液并用注射器反復(fù)多次洗凈，取近肛門端約1 cm 處腸組織進(jìn)行稱量（約40 mg），記錄后在超凈臺(tái)上加入含3 倍雙抗?jié)舛鹊腜BS 溶液，反復(fù)沖洗多次以保證無糞便殘留，然后將組織加入到450 μL 的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，在CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，收集上清液，用于IL-6、IL-10、TNF-α的ELISA檢測(cè)。

1.5 腸道固有層細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞分離

1）將腸組織放入干凈的培養(yǎng)皿中，加入預(yù)冷的PBS溶液，用注射器將小鼠腸道糞便沖洗凈，然后縱向切開，再用PBS 溶液沖洗掉結(jié)腸內(nèi)的黏液，倒去渾濁的PBS 清洗液，重復(fù)之前的清洗操作，反復(fù)多次，直到無明顯的污漬、血跡。

2）將干凈的腸組織剪成4 mm 左右的碎片，放入干凈的15 mL 離心管中，加入適量預(yù)冷的PBS 溶液，輕輕搖晃，倒去PBS，重復(fù)清洗3次后，每管加入5 mL經(jīng)37 ℃預(yù)熱的腸上皮分離液，搖晃均勻，將離心管置于恒溫?fù)u床（150 r/min，37 ℃）上，消化20 min 左右后，劇烈上下顛倒，并振蕩，同時(shí)準(zhǔn)備新的15 mL 離心管，用移液槍吸出離心管內(nèi)的分離液過篩網(wǎng)，過濾完成后將沒有濾過篩網(wǎng)的未消化碎片重新放回原來的離心管中，再次加入新的腸上皮分離液進(jìn)行消化，并過濾。將吸出的分離液收集到新的離心管中，在離心機(jī)上離心（400 g，5 min）結(jié)束后棄去上清液，收集得到小鼠腸上皮細(xì)胞，加入Trizol試劑，以備提取RNA。

3）將上一步未被消化的碎片重新收集到新的15 mL 離心管中，加入適量預(yù)冷的PBS 溶液充分混勻并振蕩，用移液管吸出并棄去溶液，反復(fù)多次，保證盡量洗去殘留的分離液。

4）取出碎片并用實(shí)驗(yàn)剪刀剪成1 mm左右的碎片，用移液槍加入6 mL經(jīng)37 ℃預(yù)熱的小鼠固有層消化液，搖晃均勻后放入恒溫?fù)u床（150 r/min，37 ℃）上，消化20 min左右后，上下顛倒并振蕩20 s，將消化液過篩網(wǎng)過濾，然后收集到新的離心管中；將未消化完全的碎片重新收集到離心管中，再次加入適量固有層消化液繼續(xù)消化，反復(fù)多次，直到看不到肉眼可見的碎片。

5）將上述含有固有層細(xì)胞的液體重新收集到新的15 mL 離心管中，300 g 離心10 min，然后加入適量PBS+3% FBS 的混合液，充分混勻后棄去液體，重懸細(xì)胞，反復(fù)2次，洗滌結(jié)束后每孔加入1 mL Trizol試劑，以備提取RNA。

1.6 ELISA 檢測(cè)

腸組織培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-10、TNF-α的蛋白水平采用相應(yīng)的小鼠ELISA試劑盒進(jìn)行測(cè)定，相關(guān)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，最后用Infinite M200Pro酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

小鼠總RNA 通過實(shí)驗(yàn)室常用的Trizol 法進(jìn)行提取。向含有細(xì)胞的Trizol溶液中加入200 μL三氯甲烷并劇烈振蕩，于冰上靜置5 min 后，在1.2×104r/min、4 ℃條件下離心15 min，然后取400 μL 上清液移至新的試劑管內(nèi)，加入400 μL 異丙醇，輕微顛倒振蕩，在冰上靜置15 min后，在1.2×104r/min、4 ℃條件下離心5 min。加1 mL 70%無水乙醇，在1.2×104r/min、4 ℃條件下離心5 min，小心去掉上清液；再加入1 mL無水乙醇，在1.2×104r/min、4 ℃條件下離心5 min；小心去掉上清液，等待風(fēng)干，之后用20 μL DEPC 水溶解，65 ℃水浴5 min。置于冰上檢測(cè)其濃度并調(diào)節(jié)濃度，然后用TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，37 ℃水浴1 h，然后95 ℃水浴5 min，置于-80 ℃冰箱中保存。對(duì)反轉(zhuǎn)錄成的cDNA 濃度進(jìn)行測(cè)定后，用DEPC 水稀釋并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增。每孔反應(yīng)體系如下：SYBR 混合物12.9 μL，上游引物0.3 μL，下游引物0.3 μL，cDNA 1.5 μL。

在冰上完成加樣后用封板膜封口并離心，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行測(cè)定，引物序列見表2。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.8 蘇木精-伊紅染色

通過脫頸椎處死小鼠，取直腸近肛門處約1 cm長(zhǎng)度的腸組織，放入10%甲醛水溶液中固定，石蠟包埋，進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色，并拍照。

1.9 便血和腹瀉評(píng)分

便血評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表3所示；腹瀉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表4所示。

表3 便血評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[19]Table 3 Hematochezia scoring criteria[19]

表4 腹瀉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[19]Table 4 Diarrhea scoring criteria[19]

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 20.0 軟件進(jìn) 行配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)分析。P＜0.05 時(shí)用*表示，P＜0.01 時(shí)用**表示。數(shù)據(jù)均由3 次或3 次以上獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體質(zhì)量變化、便血和腹瀉情況

小鼠體質(zhì)量變化如圖1A所示。由于DSS誘導(dǎo)引發(fā)了小鼠炎癥反應(yīng)，從第4天開始，小鼠體質(zhì)量出現(xiàn)明顯下降，而對(duì)照組在改喂水后，體質(zhì)量逐漸趨于平穩(wěn)，且之后略有上升，然而EGCG 處理組在改喂EGCG 后，體質(zhì)量出現(xiàn)了進(jìn)一步的下降，體質(zhì)量減少率甚至達(dá)到了40%左右。

小鼠便血情況如圖1B 所示。由于DSS 誘導(dǎo)小鼠引發(fā)腸道炎癥反應(yīng)，對(duì)照組和EGCG 組小鼠從第3 天開始糞便出現(xiàn)明顯的血絲，并隨著DSS 不斷地?cái)z入，便血情況不斷加劇，在第5、6天時(shí)小鼠甚至出現(xiàn)了便血情況。對(duì)照組和EGCG 組在改喂水和EGCG后，便血情況沒有進(jìn)一步的加劇，而EGCG組相較對(duì)照組并沒有出現(xiàn)明顯的改善。

小鼠腹瀉情況如圖1C 所示。腹瀉情況與便血情況相當(dāng)，從第2、3天開始有輕微的腹瀉出現(xiàn)，隨著天數(shù)的增加，腹瀉情況加重，到第7 天時(shí)，通過觀察可以發(fā)現(xiàn)糞便已無具體形態(tài)，部分炎癥小鼠有輕微的脫肛現(xiàn)象，身體蜷縮，活動(dòng)狀態(tài)大不如前，停止DSS攝入后，小鼠身體狀況慢慢有所緩解。

圖1 EGCG對(duì)小鼠體質(zhì)量變化率和便血、腹瀉情況的影響Fig.1 Effects of EGCG on body mass change rate,hematochezia and diarrhea of mice

2.2 小鼠腸組織長(zhǎng)度和脾大小變化

小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度情況如圖2A 所示。通過測(cè)量長(zhǎng)度發(fā)現(xiàn)，空白組結(jié)腸長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于其他2組，EGCG組略短于對(duì)照組，且EGCG 組回盲瓣部位皺縮。這說明對(duì)于DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性腸道炎癥，0.5%EGCG會(huì)加重炎性腸病的病理特征。

由圖2B可以看出，對(duì)照組的脾大于EGCG組的脾。這說明對(duì)于DSS誘導(dǎo)的腸道炎癥，0.5%EGCG會(huì)減輕由腸道炎癥引起的小鼠體內(nèi)免疫反應(yīng)和全身性炎癥反應(yīng)。

圖2 各組小鼠腸組織長(zhǎng)度(A)及脾大小(B)比較Fig.2 Comparison of colons’length(A)and spleen size(B)of mice in each group

2.3 小鼠腸道固有層細(xì)胞中IL-6、IL-10、TNF-α的表達(dá)情況

分離各組小鼠的腸道固有層細(xì)胞，并檢測(cè)炎癥因子IL-6、IL-10、TNF-α的表達(dá)情況。如圖3所示，由于DSS誘導(dǎo)引發(fā)小鼠炎癥，在mRNA水平上，對(duì)照組和EGCG 組IL-6、IL-10、TNF-α 基因的表達(dá)水平明顯高于空白組。另外，我們還發(fā)現(xiàn)EGCG 組小鼠IL-6、TNF-α的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），而IL-10的表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05）。這些都表明EGCG 能夠作用于IBD 小鼠腸道固有層細(xì)胞，抑制其炎癥因子的表達(dá)，具有一定的抑炎作用。

2.4 小鼠結(jié)腸組織上清液中IL-6、IL-10、TNF-α的表達(dá)情況

圖3 EGCG對(duì)小鼠腸道固有層細(xì)胞中IL-6、IL-10和TNF-α表達(dá)的影響Fig.3 Effects of EGCG on IL-6,IL-10 and TNF-α expression in intestinal lamina propria cells of mice

圖4 EGCG對(duì)小鼠結(jié)腸組織上清液中IL-6、IL-10和TNF-α表達(dá)水平的影響Fig.4 Effects of EGCG on the expression level of IL-6,IL-10 and TNF-α in culture supernatants of colon tissues of mice

從圖4 可以發(fā)現(xiàn)：EGCG 組小鼠比對(duì)照組小鼠IL-6、TNF-α 的表達(dá)水平降低，說明在EGCG 作用下，炎癥因子的分泌得到了一定的抑制；而IL-10的分泌無明顯變化（P＞0.05）。

2.5 小鼠腸道HE 染色結(jié)果及小鼠腸道病理組織變化

對(duì)小鼠腸道進(jìn)行HE染色并觀察，結(jié)果如圖5所示。對(duì)照組和EGCG 組小鼠腸道細(xì)胞較空白組出現(xiàn)了明顯的水腫、隱窩增生、腸道潰瘍現(xiàn)象，且腸道黏膜和腸上皮屏障出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，單核細(xì)胞、多形核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，但對(duì)照組和EGCG 組之間的變化無明顯差別。提示0.5%EGCG 對(duì)腸組織的結(jié)構(gòu)保護(hù)作用并不明顯。

圖5 各組小鼠腸道HE染色Fig.5 HE-staining of colonic sections of mice in each group

2.6 小鼠腸上皮細(xì)胞中緊密連接蛋白claudin-1、occludin 的表達(dá)情況

緊密連接蛋白是緊密連接結(jié)構(gòu)和組成的重中之重，如果緊密連接蛋白的表達(dá)出現(xiàn)了異常，那么緊密連接結(jié)構(gòu)的功能會(huì)受到極大的影響。近幾年以來，有研究人員在細(xì)胞緊密連接區(qū)域不斷發(fā)現(xiàn)各種具有特異性的蛋白，如claudin蛋白家族及跨膜蛋白o(hù)ccludin 等。有研究表明，在炎癥反應(yīng)中炎癥因子的增加不僅會(huì)極大地影響緊密連接蛋白的表達(dá)，同時(shí)還會(huì)影響其在細(xì)胞胞膜上的分布，使得緊密連接結(jié)構(gòu)的完整性受到破壞[20]。我們對(duì)小鼠腸上皮細(xì)胞中緊密連接蛋白o(hù)ccludin和claudin-1的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。在mRNA水平上，對(duì)照組和EGCG 組之間的claudin-1、occludin 表達(dá)量無明顯變化（P＞0.05）。

圖6 EGCG 對(duì)小鼠腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白o(hù)ccludin 和claudin-1 mRNA表達(dá)的影響Fig.6 Effects of EGCG on occludin and claudin-1 mRNA expression in intestinal epithelial cell of mice

3 討論

正常機(jī)體的免疫系統(tǒng)和腸道微生物相互作用并形成一種精細(xì)且微妙的穩(wěn)態(tài)環(huán)境，而一旦有外來物影響機(jī)體與腸道微生物之間的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，原本的平衡就會(huì)被打破，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥性腸病等一系列病癥的發(fā)生[19]。所以，在本實(shí)驗(yàn)中DSS 誘導(dǎo)小鼠腸道炎癥模型的原理，就是利用了DSS對(duì)黏膜屏障和腸上皮細(xì)胞功能破壞的特性，使機(jī)體內(nèi)部的保護(hù)屏障出現(xiàn)漏洞，讓外來抗原有機(jī)可乘，進(jìn)入到固有層中，并誘發(fā)了一系列的免疫和炎癥反應(yīng)，最終形成炎癥性腸?。↖BD）模型。本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)立空白組、對(duì)照組和EGCG 處理組來探究EGCG 對(duì)DSS 誘導(dǎo)小鼠炎癥性腸病的影響。

有研究發(fā)現(xiàn)，EGCG 的治療能夠減緩DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸變短及脾變大[21]。在本實(shí)驗(yàn)中，通過記錄小鼠的體質(zhì)量變化、便血及腹瀉情況，我們發(fā)現(xiàn)EGCG對(duì)便血、腹瀉情況的影響無顯著差異。另外，我們還發(fā)現(xiàn)在已經(jīng)患有炎癥性腸病的情況下，攝入EGCG 會(huì)進(jìn)一步地引起體質(zhì)量的降低，這與BITZER 等[21]的研究結(jié)果一致。但在BITZER 等[21]的研究中DSS濃度為1.5%，EGCG濃度為0.32%，均比本實(shí)驗(yàn)中這2 種物質(zhì)的濃度低一些，故推測(cè)較輕度的腸炎模型可能在較低濃度的EGCG 中有一定的恢復(fù)效果，而在比較嚴(yán)重的腸炎模型中，較高濃度的EGCG 可能會(huì)加重腸炎的病癥。另有文獻(xiàn)表明，EGCG 可以減少熱量和常量營(yíng)養(yǎng)素的吸收[22-24]。在肥胖的情況下，這種減少熱量和營(yíng)養(yǎng)素消化吸收的作用有助于體質(zhì)量的減輕。然而，本研究結(jié)果表明，EGCG 在IBD 模型中加劇了小鼠體質(zhì)量減輕的癥狀，這說明如果將EGCG 用于炎癥性腸病的治療，必須考慮EGCG 對(duì)患者體質(zhì)量減輕的不利影響。在炎癥性腸病中，多種免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞群（如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、效應(yīng)T細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞）會(huì)產(chǎn)生可溶性和膜結(jié)合性腫瘤壞死因子（TNF）。TNF在炎癥性腸病的發(fā)炎黏膜中能發(fā)揮多種促炎作用，尤其是TNF 能誘導(dǎo)血管生成，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和T 細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子的能力，引起腸道屏障改變，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞和潘式細(xì)胞的死亡。TNF 還能通過增加肌成纖維細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶分泌、驅(qū)動(dòng)T 細(xì)胞的抗凋亡作用和激活NFκB來促使組織遭到更嚴(yán)重的破壞[3]。有研究通過檢測(cè)IBD患者腸道內(nèi)炎癥因子的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，TNFα mRNA表達(dá)水平明顯升高[25-26]。

與TNF-α相似，IL-6也是腸炎炎癥反應(yīng)中重要的炎癥因子。巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞在受到刺激后開始大量產(chǎn)生IL-6，而IL-6通過在局部的炎癥反應(yīng)及損傷過程中發(fā)揮作用，使細(xì)胞生長(zhǎng)加速，并加快細(xì)胞的分化速度，其在炎癥反應(yīng)中擔(dān)任了多種角色，如刺激細(xì)胞毒性T 細(xì)胞反應(yīng)的發(fā)生；另外，IL-6還使B 細(xì)胞活化形成漿細(xì)胞，從而使免疫球蛋白在細(xì)胞中的濃度不斷上升；IL-6還有一個(gè)非常大的作用就是加速了造血干細(xì)胞從G0期進(jìn)入G1期的過程，大大縮短了干細(xì)胞的細(xì)胞周期，使單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞的數(shù)量在短時(shí)期內(nèi)得到快速增加[27]。有研究人員發(fā)現(xiàn)，IL-6表達(dá)明顯增加的情況在腸炎的損傷組織中均存在，其中在巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)被發(fā)現(xiàn)含量最多，并且IL-6的表達(dá)程度及分布情況與患者腸炎的病變程度呈正相關(guān)[3,25]。

IL-6、IL-10 和TNF-α 在炎癥反應(yīng)過程中均發(fā)揮了非常重要的作用，被認(rèn)為可以作為炎癥反應(yīng)重要的炎性調(diào)節(jié)介質(zhì)。我們通過檢測(cè)小鼠固有層細(xì)胞中IL-6、IL-10 和TNF-α 的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，0.5%EGCG能夠降低IL-6、TNF-α的表達(dá)，但對(duì)IL-10的分泌和產(chǎn)生無明顯作用，說明EGCG 能夠減少炎癥因子的表達(dá)和分泌，即EGCG 在抗炎方面對(duì)IBD 小鼠可能起到了保護(hù)作用。

有資料顯示，在保護(hù)機(jī)體免受外來抗原物入侵的過程中，腸道黏膜和腸道上皮屏障擔(dān)任了非常重要的保護(hù)角色，同時(shí)還在維持腸道對(duì)食物的消化吸收、穩(wěn)定機(jī)體內(nèi)腸道微環(huán)境等機(jī)體活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。在DSS誘導(dǎo)的腸炎中，腸道黏膜和腸上皮細(xì)胞都會(huì)受到不同程度的破壞，如腸上皮通透性增加，大分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)增多，緊密連接蛋白功能出現(xiàn)異常，腸道穩(wěn)態(tài)微環(huán)境遭到破壞，腸道黏膜免疫系統(tǒng)失去對(duì)腸道菌群的耐受性，從而產(chǎn)生非正常的持續(xù)性應(yīng)激免疫反應(yīng)等[3,19]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EGCG 對(duì)緊密連接蛋白claudin-1、occludin的表達(dá)無明顯作用，小鼠腸道HE染色的病理變化情況在各實(shí)驗(yàn)組間也沒有得到明顯的修復(fù)。推測(cè)0.5%EGCG 可能對(duì)腸道上皮屏障的損傷無明顯的修復(fù)作用，也可能EGCG 只在抗炎癥反應(yīng)方面對(duì)腸炎患者進(jìn)行了保護(hù)，而在腸道中的病理癥狀和腸上皮中的緊密連接蛋白方面無明顯保護(hù)作用。因此，EGCG 是否能夠真正對(duì)患有炎癥性腸炎的病人起到保護(hù)作用還有待進(jìn)一步研究。綜上所述，雖然0.5%EGCG對(duì)腸炎小鼠的腸道組織病理特征，腸上皮黏膜相關(guān)的組織、蛋白相關(guān)變化無明顯影響，且會(huì)加重小鼠體質(zhì)量的下降趨勢(shì)，但是EGCG能夠抑制炎癥因子的分泌，甚至能減少由腸道炎癥引起的小鼠全身性炎癥反應(yīng)，對(duì)DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病小鼠起到一定的保護(hù)作用。