王曉堂，肖蘭飛，高繼萍，梁宇翔，軒瑞晶，閆曉如，高 莉，宋國華

(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物與人類疾病動物模型山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030001)

口腔癌作為近年來頻發(fā)的腫瘤，在全身惡性腫瘤中約占3%～5%，是全球范圍內(nèi)常見的第11位癌癥，具有轉(zhuǎn)移性高、手術(shù)切除難度大、術(shù)后易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)[1]?？谇击[狀細(xì)胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)的發(fā)病率約占口腔惡性腫瘤的90%，且發(fā)病率較高、惡化程度極強(qiáng)，患者5年存活率在50%左右[2]。已有證據(jù)指出，口腔鱗狀細(xì)胞癌的形成與患者的多種不良生活習(xí)慣有關(guān)。此外，遺傳因素、慢性炎癥及病毒感染也是該病的誘因[3]。世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)，未來幾十年口腔癌的發(fā)病率將持續(xù)上升，成為一種嚴(yán)重的世界公共衛(wèi)生問題[4]。因此，需進(jìn)一步研究口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病進(jìn)程中的相關(guān)機(jī)制，以便更好地進(jìn)行癌前診斷與預(yù)后治療。

近年來，大量研究表明長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)在多層次調(diào)控生物體的基因表達(dá)，參與生物體內(nèi)多種重要的生物學(xué)過程[5]。最新研究指出，LncRNA具有復(fù)雜的生物學(xué)功能與作用調(diào)控機(jī)制，通過介導(dǎo)基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及組織分化等途徑調(diào)控基因表達(dá)，引起細(xì)胞功能紊亂、代謝失調(diào)，導(dǎo)致多種疾病和癌癥的形成[6-7]。目前，有研究指出LncRNA在多種腫瘤發(fā)生過程中異常表達(dá)，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲與凋亡過程，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮致癌或抑癌作用，是腫瘤發(fā)生的重要因素之一[8-10]。但是，LncRNA在口腔鱗狀細(xì)胞癌中作用機(jī)制的研究相對較少，局限于未能獲得足夠的臨床樣本。因此，建立與人類口腔鱗狀細(xì)胞癌相似的疾病動物模型模擬OSCC的發(fā)生發(fā)展過程，深入研究其發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。

中國地鼠(Cricetulusbarabensisgriseus)具有獨(dú)特的頰囊組織結(jié)構(gòu)，口腔黏膜與人類的相似性較高，可用其構(gòu)建口腔癌實(shí)驗(yàn)動物模型，模擬人類口腔癌癌變過程[11-13]。本課題組在前期研究中已成功建立中國地鼠口腔鱗狀細(xì)胞癌動物模型，本文將高通量LncRNA測序技術(shù)與生物信息學(xué)技術(shù)相結(jié)合，篩選中國地鼠口腔鱗狀細(xì)胞癌組織樣本與正常組織樣本中顯著差異表達(dá)的LncRNA，對其進(jìn)行靶基因預(yù)測，并對靶基因進(jìn)行GO功能分析與KEGG信號通路分析，預(yù)測差異表達(dá)的LncRNA可能具有的功能，深入探討其對中國地鼠口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機(jī)制，為口腔鱗狀細(xì)胞癌的臨床研究提供數(shù)據(jù)與理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級中國地鼠60只，雄性，8～10周齡，體重(20 ± 2)g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK (晉)2015-0001]。中國地鼠飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心屏障環(huán)境[SYXK (晉)2015-0001]，溫度25℃，濕度40%～70%，光暗循環(huán)12 h/12 h)。嚴(yán)格按照山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理委員會的要求進(jìn)行全部動物實(shí)驗(yàn)【IACUC號：2017016】，所有實(shí)驗(yàn)均遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)，普通PCR與熒光定量PCR相關(guān)試劑(日本 Takara 公司)，Nanodrop微量分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher公司)，Qubit熒光定量儀(美國Thermo Fisher公司)，Agilent 2100生物芯片分析系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織樣本中RNA提取

本課題組前期采用二甲基苯并蒽涂抹的方式成功制備口腔鱗狀細(xì)胞癌動物模型[12-15]。在課題組前期制備的中國地鼠口腔鱗狀細(xì)胞癌模型組與正常組中分別隨機(jī)選取3只動物，取適量的頰囊組織樣本用液氮充分研磨，采用RNA提取試劑盒提取不同組織中的總RNA。

1.3.2 高通量LncRNA測序

RNA提取完成后，對其進(jìn)行質(zhì)檢。首先，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性、降解程度以及是否被污染。RNA純度采用Nanodrop微量分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher公司)進(jìn)行檢測，濃度采用Qubit熒光定量儀(美國Thermo Fisher公司)進(jìn)行精確定量。采用Agilent 2100生物芯片分析系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司)精確檢測RNA的純度與完整性。完成質(zhì)檢后，對質(zhì)檢合格的RNA進(jìn)行片段化、反轉(zhuǎn)錄成cDNA、末端修復(fù)、加接頭、PCR擴(kuò)增等一系列操作后完成cDNA文庫構(gòu)建[16-17]。篩選片段大小為200 bp左右的cDNA文庫，按有效濃度及目標(biāo)上機(jī)數(shù)據(jù)量的需求進(jìn)行Illumina測序[17]。

1.3.3 測序數(shù)據(jù)處理

測序獲得的原始序列中存在低質(zhì)量數(shù)據(jù)，本研究采用FASTQC軟件[18]處理原始數(shù)據(jù)并進(jìn)行質(zhì)量控制后得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)。質(zhì)控完成后，使用RSEM比對軟件[19]將高質(zhì)量數(shù)據(jù)比對到中國地鼠參考基因組上進(jìn)行序列聯(lián)配。RSEM比對軟件使用自身腳本對聯(lián)配的結(jié)果進(jìn)行表達(dá)量提取，生成基因的讀數(shù)、FPKM和TPM表達(dá)矩陣[20-21]。最后，篩掉低表達(dá)量的基因(平均數(shù)值>5)，分離mRNA和LncRNA對應(yīng)的基因。

1.3.4 差異表達(dá)LncRNA篩選及靶基因預(yù)測

首先，將RSEM估算得到的各個(gè)LncRNA的讀數(shù)作為輸入數(shù)據(jù)輸入到DESeq2軟件[20-21]進(jìn)行差異鑒定，軟件通過自行標(biāo)準(zhǔn)化與模型擬合，通過Wald檢驗(yàn)[22-23]鑒定兩組樣本間基因的差異顯著性。其次，采用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)與生物信息學(xué)相結(jié)合的方法篩選與OSCC密切相關(guān)的顯著差異表達(dá)的LncRNA，以log2(差異倍數(shù))1(|log2(fold change)|1)，P<0.05為篩選條件。本研究通過表達(dá)量相關(guān)性分析的方法預(yù)測差異表達(dá)LncRNA的反式作用靶基因，選取P<0.05的基因作為反式作用候選基因。

1.3.5 GO功能富集分析與KEGG信號通路分析

差異表達(dá)LncRNA的靶基因富集分析包括GO功能(Gene Ontology)分析與KEGG信號通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway)分析[24]。本研究采用GO功能注釋對中國地鼠口腔鱗狀細(xì)胞癌組織樣本中差異表達(dá)的LncRNA的靶基因進(jìn)行功能分析，使用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法篩選差異表達(dá)基因富集的生物學(xué)功能，以P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的功能條目。采用KEGG信號通路富集分析，以達(dá)到對差異表達(dá)LncRNA的靶基因生物通路注釋的目的，篩選出與OSCC相關(guān)的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號通路條目。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 中國地鼠口腔鱗狀細(xì)胞癌組織樣本與正常組織樣本差異表達(dá)基因

采用高通量LncRNA測序技術(shù)對組織樣本進(jìn)行測序分析，結(jié)果表明與中國地鼠正常頰囊組織樣本相比口腔鱗狀細(xì)胞癌組織樣本中共篩選出54個(gè)顯著差異表達(dá)的LncRNA(P<0.05，|log2(差異倍數(shù))|>1)，31個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，23個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，并繪制了顯著差異表達(dá)的LncRNA的火山圖(圖1)。進(jìn)一步采用t檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，篩選出10個(gè)差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的LncRNA(P<0.01，|log2(差異倍數(shù))|>3)，分別為LOC100754872、LOC103160606、LOC107978163、LOC103163417、LOC103162225、LOC103161306、LOC107979530、LOC103161117、LOC103164378、LOC103161380。其中7個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，3個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(表1)。

表1 兩組織樣本中顯著差異表達(dá)前十的LncRNA

注：X軸代表差異表達(dá)倍數(shù)的log2值，縱坐標(biāo)代表各個(gè)基因的經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化后的P值。顯著上調(diào)的基因(|log2(差異倍數(shù))|>1)為紅色標(biāo)識，顯著下調(diào)的基因?yàn)樗{(lán)色標(biāo)識，表達(dá)量沒有變化的基因?yàn)榛疑珮?biāo)識。

2.2 中國地鼠口腔鱗狀細(xì)胞癌組織樣本與正常組織樣本差異表達(dá)的LncRNA靶基因預(yù)測

表2 顯著差異表達(dá)LncRNA靶基因預(yù)測結(jié)果統(tǒng)計(jì)

采用靶基因預(yù)測軟件預(yù)測顯著差異表達(dá)的54個(gè)LncRNA反式作用靶基因。本研究對極顯著差異表達(dá)(P<0.01)的10個(gè)LncRNA預(yù)測的靶基因數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，不同LncRNA位于染色體上不同位置，發(fā)揮不同生物學(xué)功能，因此預(yù)測的靶基因數(shù)目不同(表2)。進(jìn)一步使用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分別統(tǒng)計(jì)了極顯著差異表達(dá)的LncRNA相關(guān)性最高的前5個(gè)靶基因(表2)(相關(guān)性>0.85，P<0.01)。推測組織樣本中極顯著差異表達(dá)的LncRNA可能通過與其靶基因之間相互調(diào)控發(fā)揮作用，從而調(diào)控口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生進(jìn)程。

2.3 中國地鼠口腔鱗狀細(xì)胞癌組織樣本與正常組織樣本差異表達(dá)LncRNA的靶基因GO分析

采用GO功能注釋方法分析54個(gè)顯著差異表達(dá)的LncRNA的靶基因富集的生物學(xué)功能。GO注釋結(jié)果中共獲得73個(gè)條目，70條與生物過程相關(guān)，3條與細(xì)胞位置相關(guān)，未發(fā)現(xiàn)與分子功能相關(guān)的條目。采用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法篩選顯著富集的GO條目(P<0.05)，其中10條與生物過程相關(guān)，3條與細(xì)胞位置相關(guān)，該結(jié)果表明差異表達(dá)基因的靶基因主要分布在細(xì)胞外區(qū)域，參與調(diào)控硫酯、?；o酶A、輔酶、輔因子、脂質(zhì)代謝過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡、細(xì)胞黏附、組織發(fā)育及組織形態(tài)發(fā)生等過程(圖2A)。以P<0.01為篩選條件，篩選出極顯著富集的GO條目，8條與生物過程相關(guān)(圖2B、2C)，3條與細(xì)胞位置相關(guān)(圖2D、2E)。推測以上生物學(xué)功能的紊亂或異?？赡芤鹂谇击[狀細(xì)胞癌的惡化。

注：A：GO分類所有條目柱狀圖，橫坐標(biāo)為富集的基因數(shù)量，縱坐標(biāo)為GO條目，不同的顏色代表不同的GO分類。B：生物過程相關(guān)的GO條目的柱狀圖。C：生物過程相關(guān)的GO條目的氣泡圖。D：細(xì)胞組成相關(guān)的GO條目的柱狀圖。E：細(xì)胞組成相關(guān)的GO條目的氣泡圖。

2.4 中國地鼠口腔鱗狀細(xì)胞癌組織樣本與正常組織樣本差異表達(dá)LncRNA的靶基因KEGG分析

KEGG通路富集分析結(jié)果表明，差異表達(dá)的LncRNA的靶基因共富集了25條信號通路(P<0.05)。采用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，篩選極顯著富集的信號通路(P<0.01)，共篩出12條極顯著的信號通路(圖3A、3B，表3)。主要包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用信號通路(cge04060)、粘著力信號通路(cge04510)、軸突指導(dǎo)信號通路(cge04360)、鈣信號通路(cge04020)與TNF信號通路(cge04668)，這些通路多與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。此外，差異表達(dá)的LncRNA的靶基因還參與調(diào)控ARVC信號通路(cge05412)、DCM信號通路(cge05414)、HCM信號通路(cge05410)、心肌細(xì)胞的腎上腺素信號傳導(dǎo)通路(cge04261)、造血細(xì)胞譜系信號通路(cge04640)、萜類骨架的生物合成(cge00900)及ECM-受體相互作用通路(cge04512)，這些通路大多與心臟疾病密切相關(guān)。推測在口腔鱗狀細(xì)胞癌中這些信號通路在不同程度上發(fā)揮調(diào)控作用，影響口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。

注：A：KEGG信號通路柱狀圖。B：KEGG信號通路氣泡圖。

3 討論

口腔癌是經(jīng)過一系列組織病理學(xué)發(fā)展進(jìn)程演變而來，病損因輕到重，最后發(fā)展為原位癌或口腔鱗狀細(xì)胞癌[25-26]。近年來，口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病者趨于年輕化，發(fā)病率不斷上升[27]。由于缺少針對性的早期篩查方法，就診患者大多為晚期病人。因此，尋找口腔鱗狀細(xì)胞癌早期篩查與診斷預(yù)后的生物標(biāo)記物成為近年來臨床研究熱點(diǎn)。長鏈非編碼RNA是長度大于200 bp的非編碼RNA，不編碼蛋白質(zhì)，在生物體生長發(fā)育、生殖分化過程中發(fā)揮重要作用，是目前生物學(xué)與醫(yī)學(xué)的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域[28-29]。大量研究報(bào)道，LncRNA在表觀遺傳與基因表達(dá)過程中扮演重要角色，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡進(jìn)程[30-32]。LncRNA與其靶mRNA的3’非翻譯區(qū)部分序列通過互補(bǔ)配對的方式結(jié)合，調(diào)控靶mRNA的表達(dá)，導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生，在一定程度上影響腫瘤細(xì)胞增殖，參與調(diào)控細(xì)胞病變與癌癥惡化過程，在腫瘤增生及患者生存期不同的病理生理特點(diǎn)中發(fā)揮作用，表明LncRNA可能作為潛在的癌癥診斷標(biāo)記物[33-34]。高通量LncRNA測序技術(shù)能在較短的時(shí)間內(nèi)對大量LncRNA基因組信息進(jìn)行分析，預(yù)測其可能具有的生物學(xué)功能，有利于加速新的腫瘤標(biāo)記物的產(chǎn)生，推動腫瘤的臨床研究與治療。

表3 極顯著差異KEGG pathway統(tǒng)計(jì)表

大量臨床數(shù)據(jù)表明，口腔癌患者體內(nèi)異常表達(dá)的LncRNA參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[35-36]。有研究者對人類第一個(gè)口腔黏膜及其癌前病變的LncRNA表達(dá)譜進(jìn)行研究，結(jié)果表明在癌組織中超過60%的異常表達(dá)的LncRNA與口腔癌相關(guān)[37]?？紫榕蔚萚38]研究指出LncRNAFOXCUT在口腔癌組織及鱗癌細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)下調(diào)后會抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、克隆與遷移。付叢等[39]研究表明，LncRNAAFAP1-AS1在口腔鱗癌組織中相對表達(dá)水平是正常組織的5.16倍，并與腫瘤臨床分期、分化與轉(zhuǎn)移相關(guān)。劉速等[40]研究指出LncRNAMALAT1敲低表達(dá)后抑制癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力。Tang等[41]檢測了口腔鱗狀細(xì)胞癌中6種常見的LncRNA的表達(dá)情況，結(jié)果表明癌組織與正常組織相比MALAT-1、HOTAIR、NEAT-1、HULC、UCA1的表達(dá)顯著升高，MEG-3表達(dá)水平顯著降低。基于已有研究，推測LncRNA在口腔鱗狀細(xì)胞癌的病變過程中發(fā)揮重要作用。因此，闡明新發(fā)現(xiàn)的LncRNA與已知的LncRNA在腫瘤形成過程中具有的生物學(xué)功能，將有助于癌癥的早期診斷和預(yù)后治療。目前，口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的組織樣本較難獲取，且耗時(shí)很長，嚴(yán)重阻礙了對其發(fā)病機(jī)制的研究。基于以上原因，本課題組在前期研究中采用化學(xué)誘導(dǎo)法成功建立中國地鼠口腔鱗狀細(xì)胞癌動物模型，模擬人類口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的病變過程[12-15]。該動物模型的建立可以在較短的時(shí)間內(nèi)獲得實(shí)驗(yàn)所需的口腔鱗狀細(xì)胞癌組織樣本，以彌補(bǔ)臨床樣本的不足。大量臨床研究采用基因芯片技術(shù)對腫瘤組織樣本中差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，本研究則選用高通量LncRNA測序技術(shù)進(jìn)行研究。與基因芯片技術(shù)相比，采用高通量測序技術(shù)篩選模型動物組織樣本中LncRNA差異表達(dá)譜可發(fā)現(xiàn)一些新的LncRNA，為揭示更多新發(fā)現(xiàn)的LncRNA在疾病中的作用調(diào)控機(jī)制提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)采用高通量LncRNA測序技術(shù)對中國地鼠口腔鱗狀細(xì)胞癌組織樣本與正常樣本進(jìn)行測序分析，揭示了LncRNA在兩種組織樣本中的差異表達(dá)，成功建立了中國地鼠口腔鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)的長鏈非編碼RNA差異表達(dá)譜。采用聚類分析的方法對實(shí)驗(yàn)組與對照組差異表達(dá)基因進(jìn)行研究，共篩選出54個(gè)顯著差異表達(dá)的LncRNA(P<0.05)。對顯著差異表達(dá)LncRNA的靶基因進(jìn)行功能性分析發(fā)現(xiàn)，OSCC相關(guān)的GO條目有73條，以P<0.01為條件，篩選出極顯著富集的GO條目，8條與生物過程相關(guān)，3條與細(xì)胞位置相關(guān)。GO功能分析表明，差異表達(dá)LncRNA的靶基因主要位于細(xì)胞外區(qū)域，參與調(diào)控參與調(diào)控硫酯、?；o酶A、輔酶、輔因子、脂質(zhì)代謝過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡、細(xì)胞黏附、組織發(fā)育及組織形態(tài)發(fā)生過程。此結(jié)果與先前的研究報(bào)道一致[42-44]。KEGG信號通路富集分析結(jié)果指出，差異表達(dá)LncRNA的靶基因主要參與調(diào)控25條信號通路(P<0.05)，其中極顯著富集的信號通路12條(P<0.01)。主要包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用信號通路、粘著力信號通路、軸突指導(dǎo)信號通路、鈣信號通路和TNF信號通路。這些信號通路在其他癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制已有報(bào)道，但其在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的報(bào)道相對較少[45-47]。因此，深入研究口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生進(jìn)程中的生物學(xué)功能變化與相關(guān)信號通路的作用機(jī)制，有利于更好的揭示口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制。

綜上所述，本研究以中國地鼠為實(shí)驗(yàn)動物，利用其獨(dú)特優(yōu)勢成功構(gòu)建成功構(gòu)建了符合口腔鱗狀細(xì)胞癌病理生理過程的中國地鼠模型，實(shí)驗(yàn)操作簡單，造模成功率高。應(yīng)用此模型對口腔鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)行基礎(chǔ)研究，可為其臨床治療提供新思路。此外，本實(shí)驗(yàn)主要基于生物信息學(xué)技術(shù)對動物模型中差異表達(dá)LncRNA進(jìn)行篩選，對其靶基因的功能進(jìn)行預(yù)測，并未進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在接下來的研究中還有許多問題有待解決。因此，在下一步的研究中，將深入探討測序結(jié)果篩選出的極顯著差異表達(dá)LncRNA參與調(diào)控口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的具體調(diào)控機(jī)制，闡明其與靶基因的相互關(guān)系以及在口腔鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)的信號通路中發(fā)揮的作用，以期望為口腔鱗狀細(xì)胞癌的癌前診斷與預(yù)后治療提供新的腫瘤標(biāo)記物。

注：中國地鼠(Cricetulusbarabensisgriseus)是倉鼠科倉鼠亞科動物，在公開出版物中使用倉鼠作為名稱更為科學(xué)。但鑒于目前我國實(shí)驗(yàn)動物國家標(biāo)準(zhǔn)中提到的動物的種類都是地鼠，作為專業(yè)人員能夠清楚該物種在動物分類中地位，并不妨礙科學(xué)研究的成果和使用。中文名稱后面的拉丁文不會對該研究的主體產(chǎn)生歧義，故本文在發(fā)表時(shí)仍沿用“中國地鼠”，待國標(biāo)修訂后再統(tǒng)一命名為“倉鼠”。