姜 華，文海若，劉 麗，王亞楠，李路路，劉曉萌，李 偉，王 欣，周曉冰，王三龍，霍 艷

(中國(guó)食品藥品檢定研究院 國(guó)家藥物安全評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)中心，藥物非臨床安全評(píng)價(jià)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100176)

生物制品在創(chuàng)新藥物研發(fā)中占據(jù)重要地位，在全球最暢銷的藥物排行榜中占據(jù)半壁江山。生物制品的主要藥理作用是通過(guò)刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫物質(zhì)來(lái)激活人體免疫系統(tǒng)[1-2]。免疫系統(tǒng)功能異?？蓪?dǎo)致感染及腫瘤性病變，嚴(yán)重時(shí)可危及生命。藥物免疫毒性是當(dāng)前僅次于肝毒性的全球第二大新藥召回原因，故生物制品的免疫毒性風(fēng)險(xiǎn)是其安全性評(píng)價(jià)的重要關(guān)注點(diǎn)[3]。淋巴細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白以表面受體的形式，可特異性識(shí)別并參與機(jī)體抗原呈遞過(guò)程，并參與免疫調(diào)節(jié)功能。如T淋巴細(xì)胞中CD4+和CD8+表型的數(shù)值變化常用于監(jiān)測(cè)腫瘤、和獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)等與免疫功能有關(guān)的疾病的發(fā)生與發(fā)展[4-6]。使用流式細(xì)胞術(shù)分類計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞亞群已成為非臨床安全性評(píng)價(jià)中常規(guī)的免疫毒性評(píng)價(jià)手段之一。常見的淋巴細(xì)胞亞群分類包括CD3+CD4+、CD3+CD8+與CD3-CD20+細(xì)胞等[7]。

小鼠、大鼠和食蟹猴均為常用的安全性評(píng)價(jià)動(dòng)物模型。使用標(biāo)準(zhǔn)化的樣本制備方法，在符合藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范(Good Laboratory Practice，GLP)試驗(yàn)條件下建立淋巴細(xì)胞亞群分類背景數(shù)據(jù)，有助于研究和監(jiān)管者了解數(shù)值變化范圍，對(duì)動(dòng)物免疫毒性作合理評(píng)估[8]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)食蟹猴外周血淋巴細(xì)胞亞群流式檢測(cè)參考值相關(guān)文獻(xiàn)已有數(shù)篇報(bào)道[8-11]，但數(shù)據(jù)涉及動(dòng)物數(shù)量有限(不超過(guò)100只)或僅分析單一性別，僅有一篇為由安評(píng)機(jī)構(gòu)匯總的基于多年大量動(dòng)物的背景數(shù)據(jù)[8]。此外，大鼠及小鼠淋巴細(xì)胞亞群流式檢測(cè)參考值相關(guān)報(bào)道較少，因不同品系的大鼠和小鼠其背景值范圍也有所差異，有必要在安評(píng)機(jī)構(gòu)中建立基于大量動(dòng)物樣本數(shù)的淋巴細(xì)胞亞群的背景值范圍。本研究收集國(guó)家藥物安全評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)中心2007年至2019年在GLP條件下開展的生物制品安全性評(píng)價(jià)研究中未給藥組或溶媒組的BALB/c小鼠、SD大鼠和食蟹猴(廣西或北京)的CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD3-CD20+(僅食蟹猴)檢測(cè)值，根據(jù)動(dòng)物性別不同分別匯總以確定不同種屬動(dòng)物淋巴細(xì)胞亞群的參考值，為生物技術(shù)類藥物的免疫毒性評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF/VAF級(jí)BALB/c小鼠共303只(來(lái)自10項(xiàng)研究)，SPF/VAF級(jí)SD大鼠共359只(來(lái)自11項(xiàng)研究)，雌雄各半(購(gòu)入時(shí)約5～9周齡)，小鼠體重范圍約25～40 g，大鼠體重約300～400 g，均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK (京)2002-0003][SCXK (京)2012-0001][SCXK (京)2016-0011]。動(dòng)物飼養(yǎng)于本中心[SYXK (京)2011-0037][SYXK (京)2016-0045]屏障系統(tǒng)的大鼠籠具(長(zhǎng)×寬×高: 460 mm×315 mm×210 mm)和小鼠籠具(長(zhǎng)×寬×高: 350 mm×140 mm×136 mm)內(nèi)，飼養(yǎng)密度為2～3只/籠。給予鼠全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由攝食及飲水。大鼠和小鼠飼養(yǎng)于恒溫(20℃～26℃)、恒濕(40%～70%)的條件下，明暗周期為12 h，每小時(shí)最低換氣次數(shù)15次。

普通級(jí)食蟹猴共460只，雌雄各半(購(gòu)入時(shí)約3～4歲，體重約3～5 kg,來(lái)自共12項(xiàng)研究)，購(gòu)自廣西桂東靈長(zhǎng)類開發(fā)實(shí)驗(yàn)有限公司[SCXK (桂)2011-0001][SCXK (桂)2016-0001]或北京協(xié)爾鑫生物資源研究所有限責(zé)任公司[SCXK (京)2015-0011]。飼養(yǎng)于本中心[SYXK (京)2011-0037][SYXK (京)2016-0045]普通級(jí)動(dòng)物房不銹鋼籠具內(nèi)(長(zhǎng)×寬×高:80 cm×70 cm×75 cm)，單籠飼養(yǎng)。動(dòng)物自由飲水，每只動(dòng)物每天定量給料和水果各150 g，自由攝取。食蟹猴飼養(yǎng)于恒溫(16℃～26℃)、恒濕(40%～70%)的條件下，明暗周期為12 h，每次小時(shí)最低換氣次數(shù)8次。

所有研究方案均通過(guò)國(guó)家藥物安全評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)(institutional animal care and use committee, IACUC)的倫理審查(IACUC編號(hào)為：IACUC-2008-023、IACUC-2010-008、IACUC-2013-031、IACUC-2014-068、IACUC-2015-028、IACUC-2016-005、IACUC-2017-005、IACUC-2018-001、IACUC-2018-058，等等)，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑包括流式儀校準(zhǔn)微球(BD CalibriteTM3-color，批號(hào)：7347634、APC bead，批號(hào)：80129)、BALB/c小鼠用抗體FITC-CD8a(Clone 53-6.7，批號(hào)：3177592,8152865)、PerCP-CD4(Clone RM4-5，批號(hào)：8025572,8194889,8025572)、Hamster抗Mouse PE-CD3e(Clone 145-2C11，批號(hào)：6012949,7158744)和食蟹猴用抗體FITC-CD8(Clone RPA-T8，批號(hào)：5341673,5159821)、PE-CD4(Clone L200，批號(hào)：7299836,5313876,5057543)、PerCP-CD3(Clone SP34-2，批號(hào)：8124735,6092584,7069961)和APC-CD20(Clone 2H7，批號(hào)：3291627)均購(gòu)自BD公司；SD大鼠用抗體CD3-FITC/CD4-RPE(Clone IF4:W3/25，批號(hào)：1113)，CD8ALPHA:Alexa Fluor647(Clone OX-8，批號(hào)：0310)購(gòu)自BIO-RAD；紅細(xì)胞裂解液主要成分：氯化氨(批號(hào)：20161208)、碳酸氫鉀(批號(hào)：20150924)和乙二胺四乙酸二鈉(批號(hào)：20140328)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，磷酸鹽緩沖液(PBS批號(hào)：AD2016267，AD22391274)購(gòu)自Hyclone；多聚甲醛(批號(hào)：20170825)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，使用前經(jīng)PBS稀釋為1%的應(yīng)用液。主要儀器包括BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀，分析軟件Cell QuestTMPro；H-500FRS高速離心機(jī)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 血樣采集

本研究收錄動(dòng)物數(shù)據(jù)均來(lái)自未給藥動(dòng)物或生物制品溶媒對(duì)照組動(dòng)物數(shù)據(jù)，全部動(dòng)物采血前過(guò)夜禁食。嚙齒類動(dòng)物腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉后經(jīng)腹主靜脈采血，食蟹猴不麻醉由前臂靜脈采血。全部動(dòng)物采集全血0.3～0.5 mL，血樣于肝素鈉抗凝管中混勻，所有樣本在采集后4 h之內(nèi)完成制備與測(cè)定分析。

1.3.2 檢測(cè)流程

將各相應(yīng)熒光抗體組合和50 μL抗凝全血加入流式管中，混勻樣本后于室溫、避光條件下孵育30分鐘。在流式管中分別加入1 mL的紅細(xì)胞裂解液并混勻，小鼠和大鼠樣本的裂解時(shí)間通常為1～3 min，食蟹猴樣本約4～9 min。紅細(xì)胞充分裂解后，以1000 r/min離心5 min，棄上清并加入1 mL PBS再次離心(離心條件同上)并棄上清。每管加入1%多聚甲醛重懸細(xì)胞后上機(jī)測(cè)定。小鼠和大鼠樣本共收集3000～5000個(gè)淋巴細(xì)胞，食蟹猴共收集5000個(gè)淋巴細(xì)胞。分別計(jì)算表達(dá)CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+和CD3-CD20+(僅食蟹猴)的淋巴細(xì)胞百分率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

雄性和雌性BALB/c小鼠外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD4+/CD8+淋巴細(xì)胞范圍(表1)，雄性的結(jié)果分別為45.45%～85.86%、12.73%～42.48%、1.07～6.74；雌性為53.27%～84.15%、8.95%～37.49%、1.42±8.59。雄性和雌性SD大鼠平均CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD4+/CD8+范圍(表2)，雄性的結(jié)果分別為48.26%～84.53%、16.35%～62.75%、0.99～8.78；雌性為34.06%～86.24%、7.39%～62.75%、0.54±11.67。約3～4歲齡雄性和雌性食蟹猴CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+和CD3-CD20+范圍(表3)，雄性的結(jié)果分別為28.42%～72.83%、23.93%～65.32%、0.44±3.04、1.40%～47.91%；雌性為22.70%～75.90%、17.43%～65.13%、0.35±4.22、9.6%～51.99%。

表1 BALB/c小鼠T淋巴細(xì)胞亞群參考范圍

表2 SD大鼠T淋巴細(xì)胞亞群參考范圍

表3 食蟹猴淋巴細(xì)胞亞群參考范圍

上述背景數(shù)值分布范圍較廣，故對(duì)不同種屬及性別動(dòng)物的淋巴細(xì)胞亞群分布情況作進(jìn)一步分析匯總。BALB/c小鼠的CD3+CD4+數(shù)值分布集中于60%～80%，CD3+CD8+分布多集中于15%～35%，CD4+/CD8+比值集中于1.5～4.5的區(qū)間范圍(表4)；SD大鼠的CD3+CD4+數(shù)值分布集中于60%～80%，CD3+CD8+分布集中于25%～45%，CD4+/CD8+比值多集中于1.5～4.5的區(qū)間范圍(表5)；食蟹猴的CD3+CD4+分布集中于40%～60%，CD3+CD8+分布多集中于30%～50%，CD4+/CD8+比值多集中于1.0～2.0，CD3-CD20+分布多集中于10%～30%(表6)。上述分布情況未見性別差異。

表4 BALB/c小鼠淋巴細(xì)胞亞群總體分布情況

表5 SD大鼠T淋巴細(xì)胞亞群總體分布情況

表6 食蟹猴淋巴細(xì)胞亞群總體分布情況

3 討論

免疫毒性評(píng)價(jià)已成為藥物毒理學(xué)評(píng)價(jià)中不可或缺的單元。使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法(flowcytometry, FM)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞表型已成為毒理學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的試驗(yàn)手段，該方法與免疫組化檢測(cè)法相比靈敏度高、更客觀、且可以更好地兼容高通量評(píng)價(jià)。外周血淋巴細(xì)胞表型是評(píng)估動(dòng)物免疫功能的重要指標(biāo)，而動(dòng)物的產(chǎn)地、環(huán)境、樣本制備和所用試劑不同等諸多因素均可對(duì)其數(shù)值產(chǎn)生影響[12-13]。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)確立一套正常動(dòng)物外周血淋巴細(xì)胞亞群正常參考范圍，有利于查找研究數(shù)據(jù)存在的問(wèn)題并對(duì)藥物潛在免疫毒性作出有效判斷，滿足不斷提高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度的要求，從而推動(dòng)生物制品產(chǎn)品研發(fā)并更好地服務(wù)于毒理數(shù)據(jù)監(jiān)管。當(dāng)試驗(yàn)中陰性組數(shù)值偏離背景數(shù)據(jù)時(shí)，認(rèn)為該組數(shù)據(jù)不可靠，應(yīng)查找原因并重復(fù)采血檢測(cè)。本研究匯總12年來(lái)我中心未給藥或僅給予溶媒的嚙齒類動(dòng)物和靈長(zhǎng)類動(dòng)物的淋巴細(xì)胞亞群分類結(jié)果，所有數(shù)據(jù)均來(lái)自10以上次獨(dú)立研究，背景值范圍在文獻(xiàn)報(bào)道范圍之內(nèi)[8-11]。

CD3+CD4+為輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞亞群，主要通過(guò)分泌的淋巴因子來(lái)增強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答；而CD3+CD8+屬于抑制/細(xì)胞毒細(xì)胞亞群，可特異性殺傷靶細(xì)胞, 具有抗病毒、抗腫瘤及重要的調(diào)節(jié)作用[14]。影響CD4+/CD8+的因素除種屬外，也與年齡和性別等因素有關(guān)。如，衰老與免疫功能減退息息相關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)BALB/c小鼠、SD大鼠和食蟹猴的CD4+/CD8+范圍分別為1.07～8.59、0.54～11.67和 0.35～4.22，范圍區(qū)間大，與個(gè)別動(dòng)物個(gè)體差異導(dǎo)致頭尾兩端的數(shù)據(jù)差異大有關(guān)。故進(jìn)一步對(duì)所有數(shù)據(jù)分區(qū)間進(jìn)行匯總，發(fā)現(xiàn)相同種屬大多數(shù)動(dòng)物的數(shù)值(約70%～85%左右)位于相同區(qū)間內(nèi)，且數(shù)據(jù)分布無(wú)明顯性別差異。黃秋香等對(duì)不同性別和不同周齡的食蟹猴的淋巴細(xì)胞亞群分類結(jié)果比較分析，發(fā)現(xiàn)3～5歲的食蟹猴存在雌性動(dòng)物CD3+CD4+較高的現(xiàn)象，而1.5～2歲的食蟹猴數(shù)據(jù)中未見上述差異[8]。此外，李巖等匯總的4～7歲食蟹猴淋巴細(xì)胞亞群分類結(jié)果中亦未見性別差異[11]。食蟹猴通常約4歲左右達(dá)性成熟，本中心用于藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)的食蟹猴年齡通常為3～4歲，處于接近性成熟或性成熟伊始階段。輔助性T淋巴細(xì)胞(CD3+CD4+)變化可與動(dòng)物的性成熟和胸腺萎縮程度有關(guān)，動(dòng)物的年齡以及雌性動(dòng)物性成熟時(shí)間早于雄性動(dòng)物等因素可能是造成年齡和性別差異的主要原因。因上述文獻(xiàn)使用動(dòng)物產(chǎn)地各異，不排除存在食蟹猴產(chǎn)地原因。

除CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+和CD3-CD20+外，其它淋巴細(xì)胞表型對(duì)特殊靶向的生物制品的免疫毒性也有一定提示，然而涉及研究較少，未獲得大量數(shù)據(jù)用于制定背景數(shù)據(jù)。如自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)認(rèn)為是T細(xì)胞和B細(xì)胞外的第三大最重要的免疫細(xì)胞，可通過(guò)CD16+或CD56+識(shí)別。作為天然免疫的核心細(xì)胞，外周血中NK的多寡也可反應(yīng)受試物的免疫毒性[15]。而表達(dá)CD40+的B細(xì)胞可激活樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)并在CD8+的調(diào)控中至關(guān)重要[16]。當(dāng)前已有針對(duì)CD40+開發(fā)的一系列抗體抗腫瘤藥物，如SEA-CD40、魯卡木單抗、阿韋舒托等陸續(xù)進(jìn)入臨床，上述藥物的毒性評(píng)估中應(yīng)關(guān)注CD40+的表達(dá)水平。此外，近年來(lái)靶向CD19、CD20和CD22的嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor, CAR)修飾的T細(xì)胞治療在復(fù)發(fā)/難治型急性淋巴細(xì)胞白血病的治療中彰顯優(yōu)勢(shì)[17,18]，類似細(xì)胞治療產(chǎn)品陸續(xù)進(jìn)入安評(píng)領(lǐng)域，而表型為CD19+、CD20+和CD22+的淋巴細(xì)胞表達(dá)水平也成為其毒性監(jiān)測(cè)的關(guān)注點(diǎn)。今后應(yīng)注意收集相關(guān)數(shù)值，完善背景數(shù)據(jù)積累。

本研究規(guī)范而系統(tǒng)性地收集了12年來(lái)大量小鼠、大鼠和食蟹猴的外周血淋巴細(xì)胞亞群背景數(shù)據(jù)，尤其是首次報(bào)道了基于大量樣本的小鼠和大鼠淋巴細(xì)胞亞群背景數(shù)據(jù)，作為生物制品臨床前動(dòng)物試驗(yàn)數(shù)據(jù)解讀的重要支持，對(duì)進(jìn)一步討論藥物或疾病對(duì)動(dòng)物免疫功能狀態(tài)的影響提供參考。當(dāng)前有關(guān)嚙齒類動(dòng)物的淋巴細(xì)胞亞群背景值信息罕有報(bào)道，本文對(duì)以嚙齒類動(dòng)物為模型的生物制品評(píng)價(jià)及研究具有借鑒意義。