蘇學(xué)軍， 劉廣聰， 宗春燕

（泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇泰州225300）

亞硝酸鹽是威脅動物健康的一種有毒物質(zhì)。過量的亞硝酸鹽進(jìn)入血液中， 會導(dǎo)致動物全身組織缺氧， 造成呼吸困難及神經(jīng)機(jī)能紊亂（余文蘭等，2017），嚴(yán)重時可致動物死亡。通常飼料中的亞硝酸鹽含量極少， 但若調(diào)制不當(dāng)或因貯藏條件不適，產(chǎn)品受到污染（王春林，2000），在還原酶及有害菌的作用下， 殘留在飼料中的硝酸鹽會大量地轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽，從而使含量超標(biāo)。飼料中的亞硝酸鹽一方面能引起動物的急、慢性損害，影響動物的生產(chǎn)性能和繁殖能力； 另一方面其作為一種氧化劑， 會氧化飼料中的還原性營養(yǎng)成分（齊德生等，2003），降低飼料的營養(yǎng)價值。在動物的胃腸道內(nèi)，亞硝酸鹽易與仲胺類物質(zhì)發(fā)生亞硝化反應(yīng)，生成致癌性強(qiáng)的亞硝胺（Yang 等，2009），從而增加動物消化器官癌變的風(fēng)險， 這對人類健康也構(gòu)成了潛在威脅。 因此，研究清除飼料中的亞硝酸鹽，降低飼料中亞硝酸鹽的殘留量， 對于人類與動物的安全具有積極意義。

仙鶴草（Agrimonia pilosaLedeb.）系薔薇科多年生草本植物，又名龍牙草、脫力草、石打穿等（路芳等，2012）， 廣泛分布于我國南北各地。 研究表明，仙鶴草提取物可用于防治家畜流行性腹瀉、絳蟲病，可以治療牛血乳病，對豬鏈球菌也有明顯的抑制作用（陳應(yīng)戰(zhàn)，2015；吳周水，1998）。 目前，對仙鶴草的研究多集中在藥理活性及臨床應(yīng)用方面， 而關(guān)于其清除飼料中亞硝酸鹽的研究鮮有報道。 本試驗通過超聲波輔助提取工藝制備仙鶴草提取物， 研究其在體外模擬胃液條件下對飼料中亞硝酸鹽的清除作用， 以期為仙鶴草資源的開發(fā)利用提供一種新途徑。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 原料與試劑 飼料購自本地飼料市場，四分法濃縮至200 g，粉碎后過篩，混勻，密封低溫保存；仙鶴草購自同仁堂大藥房；無水乙醇、亞硝酸鈉、硫酸鋅、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺，均為市售分析純試劑。

模擬胃液（梅勝等，2017）：稱取2.0 g NaCl 及3.2 g 豬胃蛋白酶， 雙蒸水溶解后加入7 mL 濃鹽酸，定容于1 L 容量瓶內(nèi)。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備 Cary 60 紫外-可見分光光度計；HH-S1 數(shù)顯恒溫水浴鍋；BJ-150 多功能粉碎機(jī)；LRH-250F 生化培養(yǎng)箱；KQ5200E 超聲波清洗器；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.2 試驗方法

1.2.1 仙鶴草提取物的制備 仙鶴草去雜后，置于減壓干燥箱內(nèi)烘干至脆，粉碎，過40 目篩。準(zhǔn)確稱取5 g 粉末，加入100 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的乙醇浸泡30 min，50 ℃下超聲輔助提取20 min。 過濾，濾渣中加入上述乙醇80 mL 于相同條件下再超聲提取1 次， 合并濾液，70 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至浸膏狀， 以60%的乙醇溶解后定容于100 mL 棕色容量瓶中， 即得質(zhì)量濃度50 mg/mL 的仙鶴草提取物原液。 將原液配成不同質(zhì)量濃度的稀釋液，避光冷藏備用。

1.2.2 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用鹽酸萘乙二胺比色法（鐘希瓊等，2015），建立亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 亞硝酸鹽清除率的測定 分別移取不同質(zhì)量濃度的仙鶴草提取物1 mL，置于25 mL 的比色管內(nèi)， 各加入8 mL 模擬胃液， 再加入20 μg/mL NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，37 ℃水浴， 反應(yīng)至既定時間后，加入2 mL 0.4%對氨基苯磺酸溶液，搖勻，5 min后立刻加入1 mL 0.2% 鹽酸萘乙二胺溶液，搖勻，蒸餾水定容，靜置15 min，在波長538 nm 處測定吸光度。平行測定3 次，按下式計算仙鶴草提取物對亞硝酸鹽的清除率。

式中：A0為未加入提取物時的吸光度；Ai為加入提取物后的吸光度；Aj為提取物本底吸光度。

1.2.4 仙鶴草提取物對飼料中亞硝酸鹽的清除作用 稱取10 g 粉碎混勻的飼料樣品兩份，分別置于150 mL 錐形瓶中， 其中一份加入模擬胃液8 mL 及仙鶴草提取液50 mL， 放置在37 ℃的恒溫水浴振蕩器中，220 r/min 孵育1 h （王瑞國等，2015）。取出，過濾、洗滌、烘干得濾渣。將濾渣及另一份樣品各自加入蒸餾水100 mL 和20% NaOH溶液1.2 mL，調(diào)節(jié)pH 至8 ～9，全部轉(zhuǎn)至200 mL棕色容量瓶內(nèi)。加入0.42 mol/L 的硫酸鋅溶液10 mL，搖勻，直至蛋白質(zhì)完全沉淀。 然后于60 ℃水浴中加熱15 min，室溫冷卻后，蒸餾水定容，靜置30 min（少量油脂可用吸管吸去）。過濾，棄去初濾液20 mL，剩余濾液作為樣品試液備用。 取25 mL比色管，加入10 mL 樣品試液，按1.2.3 加入顯色劑進(jìn)行顯色， 并根據(jù)回歸方程計算出樣品中亞硝酸鹽的含量，按下式計算清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以亞硝酸鈉質(zhì)量m（μg)為橫坐標(biāo)，538 nm 處吸光度A 值為縱坐標(biāo)，作m-A 函數(shù)圖， 見圖1， 得相應(yīng)的回歸方程為A=0.0301m+0.0012，R2=0.9997，線性檢測范圍為0 ～12.5 μg。

圖1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同質(zhì)量濃度仙鶴草提取物對亞硝酸鹽的清除作用 分別移取質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10、12 mg/mL 的仙鶴草提取物1 mL 與亞硝酸鹽反應(yīng)20 min，其清除效果見圖2。

圖2 不同質(zhì)量濃度仙鶴草提取物對亞硝酸鹽的清除作用

由圖2 可見， 仙鶴草提取物對亞硝酸鹽的清除能力表現(xiàn)為提取物濃度增大后清除率迅速升高，當(dāng)濃度為10 mg/mL 時，再增大提取物濃度，清除率不再有顯著變化（P ＞0.05）。兩者之間符合良好對數(shù)曲線關(guān)系， 經(jīng)擬合得y=30.145ln （x)+24.251，R2=0.9929。仙鶴草提取物對亞硝酸鹽的半數(shù)清除率濃度IC50為2.349 mg/mL，表明提取物對亞硝酸鹽的清除能力較強(qiáng)。

2.3 不同反應(yīng)時間仙鶴草提取物對亞硝酸鹽的清除作用 取質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的仙鶴草提取物1 mL 分別與亞硝酸鹽反應(yīng)5、10、15、20、25、30 min，其清除效果見圖3。

圖3 不同反應(yīng)時間仙鶴草提取物對亞硝酸鹽的清除作用

由圖3 可見， 仙鶴草提取物對亞硝酸鹽的清除率隨反應(yīng)時間的延長而快速上升， 反應(yīng)30 min，清除率為95.37%。清除率與反應(yīng)時間也符合良好對數(shù)曲線關(guān)系， 經(jīng)擬合得y=16.434ln （x）+41.985，R2=0.9762。 達(dá)到半數(shù)清除率時，清除所需時間IT50為1.629 min，說明仙鶴草提取物對亞硝酸鹽的清除反應(yīng)速率較快， 能在較短的時間內(nèi)達(dá)到平衡。

2.4 仙鶴草提取物對不同種類飼料中亞硝酸鹽的清除效果 由表1 可知， 供試的4 種飼料中亞硝酸鹽含量均較低，最高值為1.25 mg/kg，遠(yuǎn)低于GB13078-2017 飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中的亞硝酸鹽允許量。 仙鶴草提取物對4 種飼料中的亞硝酸鹽均具有清除作用，并表現(xiàn)出一定的差異性，其中對小豬配合飼料的平均清除率為43.34%，而對雞濃縮飼料的平均清除率僅為27.43%。仙鶴草提取物直接與亞硝酸鹽作用時清除效果較好， 但與飼料中的亞硝酸鹽作用時， 清除能力則表現(xiàn)出一定程度的下降， 這可能是由于在模擬胃液消化過程中飼料中亞硝酸鹽未能全部溶出， 提取物無法與其完全反應(yīng)，造成清除率降低。 盡管如此，仙鶴草提取物對供試飼料中的亞硝酸鹽仍具有一定的清除作用，清除率均在27%以上。

表1 仙鶴草提取物對飼料中亞硝酸鹽的清除作用

3 討論

仙鶴草是一種常見的中草藥， 近年來在飼料工業(yè)和畜牧生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用。 青草期的仙鶴草營養(yǎng)價值豐富，富含蛋白質(zhì)、糖類及各種礦物元素，可用作動物飼料。 研究表明，仙鶴草具有消炎止血、補(bǔ)虛止痢、降血糖、抗氧化、抗腫瘤等功效（徐威等，2016；周曉蓉等，2011；He 等，2010）。 在雞飼料中添加仙鶴草， 可以起到預(yù)防和治療雞絳蟲的作用， 并能改善雞的生產(chǎn)性能 （彭曉英，2002）。 吳周水（1998）用仙鶴草組方預(yù)防耕牛中暑、治療豬外傷出血，療效顯著。 仙鶴草具有廣譜抗流感病毒活性， 可有效控制禽流感 （呂玲，2010）。 本研究結(jié)果表明，仙鶴草還具有清除飼料中亞硝酸鹽的能力，能提高飼料制品的安全性能。

仙鶴草中含有黃酮類、三萜類、鞣質(zhì)類、酚類、多糖類等多種抗氧化活性成分（路芳等，2012），亞硝酸鹽在動物體內(nèi)表現(xiàn)為一種氧化劑， 抗氧化成分可通過氧化還原反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對亞硝酸鹽的清除。由于本試驗所得的仙鶴草提取物為粗品， 在清除亞硝酸鹽時發(fā)揮主要作用的成分尚不能明確，有可能是多種成分的協(xié)同作用， 因此需進(jìn)一步對粗提取物中天然單體化合物進(jìn)行分離純化， 確定活性成分與清除亞硝酸鹽之間的構(gòu)效關(guān)系。

4 結(jié)論

在體外模擬胃液條件下， 仙鶴草提取物對亞硝酸鹽具有較強(qiáng)的清除能力， 清除效果與提取物濃度及反應(yīng)時間有關(guān)， 在試驗范圍內(nèi)符合良好對數(shù)曲線關(guān)系。清除試驗表明，仙鶴草提取物對4 種飼料中的亞硝酸鹽均具有一定程度的清除作用，說明仙鶴草提取物對于動物健康具有潛在保健功能。