梁繼華,顧建中,喬迺妮

不同土壤對(duì)仙鶴草愈傷組織增長(zhǎng)及總黃酮含量的影響

梁繼華1,顧建中2,喬迺妮1

1. 常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)與經(jīng)濟(jì)系, 湖南 常德 415000 2. 湖南文理學(xué)院木建筑工程學(xué)院, 湖南 常德 415000

為了獲取仙鶴草愈傷組織增殖以及總黃酮含量高的最優(yōu)土壤條件，為仙鶴草的培育提供有效依據(jù)，研究不同土壤條件對(duì)仙鶴草愈傷組織增長(zhǎng)及總黃酮含量的影響。選擇源于湖南漣源的仙鶴草作為植株樣本，實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理步驟：1、在土壤中添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑；2、在土壤中添加碳源；3、處理在土壤中添加蔗糖。35 d后對(duì)各仙鶴草植株愈傷組織增長(zhǎng)情況及總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。在土壤中添加1 mg·L-1和2 mg·L-1生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理后仙鶴草愈傷組織生長(zhǎng)情況相對(duì)較差，在土壤中加入較低質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑后，仙鶴草愈傷組織生長(zhǎng)情況相對(duì)較好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）；將30 mg·L-1的蔗糖添加至土壤中形成的仙鶴草愈傷組織增殖速度最快，和其余條件相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）；添加2 mg·L-1生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑吸光度更低，添加30 mg·L-1蔗糖土壤吸光度更高，總黃酮量更高?？傊?，在土壤中加入較低質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，或在土壤中加入濃度是30 mg·L-1的蔗糖，最有助于仙鶴草愈傷組織增長(zhǎng)，添加2 mg·L-1生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑總黃酮量比添加30 mg·L-1蔗糖土壤更高。

土壤; 仙鶴草; 愈傷組織; 黃酮

仙鶴草(Ledeb.)又被稱作龍牙草，最初被記載在1062年蘇頌的《圖經(jīng)本草》，源于薔薇科植物龍牙草的干燥地上部分[1,2]。仙鶴草能夠收斂止血、解毒、補(bǔ)虛、止痢，臨床主要被用作止血[3,4]。當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究表明，仙鶴草含黃酮類化合物，不僅可止疼抗炎，抵御心律異常，而且能夠降糖，是一種有效的天然抗氧化劑，能夠清除機(jī)體中的超氧離子自由基，提高免疫力[5,6]。

本研究將愈傷組織產(chǎn)量與總黃酮含量當(dāng)成評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)仙鶴草愈傷組織誘導(dǎo)、土壤進(jìn)行篩選，比較不同土壤條件對(duì)仙鶴草愈傷組織生長(zhǎng)的影響，獲取仙鶴草愈傷組織增殖以及總黃酮含量高的最優(yōu)土壤條件，為仙鶴草的培育提供有效依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料來(lái)源

仙鶴草植株樣本源于湖南漣源，采集4個(gè)批次。對(duì)照品源于阿拉丁試劑有限公司。其余試劑都是分析純。基本土壤為山地草甸土，土壤中有機(jī)質(zhì)含量為4.4%，pH值是6.0左右[7]。

1.2 材料的處理

實(shí)驗(yàn)在常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院栽培基地中進(jìn)行，設(shè)3個(gè)處理步驟：1、在土壤中添加不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑；2、在土壤中添加不同類型碳源；3、在土壤中添加不同濃度蔗糖，土壤與添加物質(zhì)的體積比為2:1。每個(gè)處理重復(fù)6次，每個(gè)重復(fù)選擇6株仙鶴草[8]。把添加硫磺粉的原有土壤與物料混合攪拌均勻后添加至10 cm×10 cm的營(yíng)養(yǎng)缽中，將仙鶴草植入營(yíng)養(yǎng)缽中，每隔2 d澆1次水。田間處理設(shè)置和上述相同，在寬70 cm深35 cm的定植溝中，攪拌均勻，把仙鶴草苗植入溝中。35 d后，對(duì)各仙鶴草植株愈傷組織增長(zhǎng)情況及總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3 培養(yǎng)與檢測(cè)

仙鶴草愈傷組織誘導(dǎo)莖段在土壤中誘導(dǎo)愈傷組織，同時(shí)在相同的土壤中繼代培養(yǎng)，把培養(yǎng)后的愈傷組織當(dāng)成供試材料，測(cè)定不同土壤條件對(duì)仙鶴草愈傷組織生長(zhǎng)及總黃酮含量的影響。

1.4 總黃酮量測(cè)定

1.4.1 對(duì)照品溶液配置稱量120 ℃條件下干燥恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品6 mg添加至容量瓶?jī)?nèi)，加入一定的50%乙醇，通過(guò)超聲令其溶解，在室內(nèi)冷卻，定容到30 mL，攪拌均勻，即可獲取0.25 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液[8,9]。

1.4.2 最大吸收波長(zhǎng)確定通過(guò)移液管吸取1.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液放在10 mL比色管中，添加50%的乙醇令其達(dá)到6 mL，然后繼續(xù)添加亞硝酸鈉與硝酸鋁溶液，攪拌均勻，室溫靜置5 min，再添加2 ml·L-1的NaOH溶液，加入濃度為50%的乙醇到刻度，攪拌均勻，在常溫下靜置20 min，在上述過(guò)程的基礎(chǔ)上添加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液混合液，將其當(dāng)成空白參照，在200～900 nm波長(zhǎng)區(qū)間內(nèi)掃描，將吸收度最大情況下的波長(zhǎng)510 nm當(dāng)成蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品最高特征吸收波長(zhǎng)(圖1)。

圖1 蘆丁吸收光譜圖

對(duì)各增殖的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)2次，每次培養(yǎng)40 d，繼代培養(yǎng)基與增殖培養(yǎng)基保持一致。然后，將增長(zhǎng)量較大的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)號(hào)中的愈傷組織取出，用蒸餾水洗去培養(yǎng)基及壞死部分，烘干。

把仙鶴草樣品利用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)六號(hào)曬。把藥材粉末放在60 ℃干燥箱中處理，稱量1 g仙鶴草粉末置于三角瓶中，添加30 mL 50%乙醇溶液，攪拌均勻，放置24 h，通過(guò)超聲提取器采集35 min，冷卻到室溫過(guò)濾[10,11]。

1.4.3 樣本含量測(cè)量取上節(jié)得到的供試品溶液0.2 mL，放在比色管中，進(jìn)行顯色處理，攪拌均勻，靜置20 min，在510 nm處對(duì)不同樣本的吸收度進(jìn)行測(cè)量[12]，同時(shí)求出不同樣本的總黃酮含量。總黃酮含量可通過(guò)下式求出：

其中，用于描述依據(jù)吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求出的濃度值，1用于描述測(cè)定樣本過(guò)程中使用的比色管的溶劑，2用于描述制備供試品溶液過(guò)程中添加的50%乙醇溶液的體積數(shù)量，3用于描述測(cè)量樣本過(guò)程中采集的供試品體積，用于描述制備供試品溶液過(guò)程中稱量的樣本質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同土壤條件對(duì)仙鶴草愈傷組織增長(zhǎng)情況的影響

2.1.1 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)仙鶴草愈傷組織生長(zhǎng)的影響在土壤中加入質(zhì)量濃度不同的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，研究添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑后土壤對(duì)仙鶴草愈傷組織增殖的影響，結(jié)果用表1進(jìn)行描述。

表1 添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑后土壤對(duì)仙鶴草愈傷組織增殖的影響

注：相同列不同小寫字母代表數(shù)值間有顯著差異，<0.05，+代表生長(zhǎng)差，++代表生長(zhǎng)較好，+++代表生長(zhǎng)很好。下同。

Note: There were significant differences between little letters on the same row at 0.05 level. +: bad in growth, ++: better in growth, +++: the best in growth. The same as follows.

分析表1可以看出，在土壤中加入不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，處理后仙鶴草愈傷組織增殖速度很快，無(wú)顯著差異（>0.05）。在土壤中添加1 mg·L-1和2 mg·L-1生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，處理后仙鶴草愈傷組織生長(zhǎng)情況相對(duì)較差，在進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)容易老化，葉片逐漸呈褐色，無(wú)法進(jìn)行繼代培養(yǎng)。在土壤中加入較低質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑后，仙鶴草愈傷組織生長(zhǎng)情況相對(duì)較好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。

2.1.2 加入碳源土壤對(duì)仙鶴草愈傷組織生長(zhǎng)的影響在土壤中依次添加蔗糖與葡萄糖當(dāng)成碳源，培養(yǎng)仙鶴草愈傷組織，碳源對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響情況用表2進(jìn)行描述。

表2 碳源對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響情況

分析表2可以看出，將兩種碳源加入土壤中，仙鶴草愈傷組織生長(zhǎng)情況都很好，但將蔗糖當(dāng)成碳源加入土壤中，仙鶴草愈傷組織增殖率比加入葡萄糖的土壤更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。

2.1.3 加入不同質(zhì)量濃度蔗糖的土壤對(duì)仙鶴草愈傷組織生長(zhǎng)的影響加入不同質(zhì)量濃度蔗糖的土壤對(duì)仙鶴草愈傷組織生長(zhǎng)的影響情況用表3進(jìn)行描述。

表3 加入不同質(zhì)量濃度蔗糖的土壤對(duì)仙鶴草愈傷組織生長(zhǎng)的影響

分析表3可以看出，在土壤中添加不同質(zhì)量濃度蔗糖，形成的仙鶴草愈傷組織生長(zhǎng)情況都相對(duì)較好，其中，將30 mg·L-1的蔗糖添加至土壤中形成的仙鶴草愈傷組織增殖速度最快，將40 mg·L-1的蔗糖添加至土壤中形成的仙鶴草愈傷組織增殖速度最慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。

2.2 不同土壤條件對(duì)仙鶴草愈傷組織增長(zhǎng)情況及總黃酮含量的影響

依次對(duì)添加2 mg·L-1生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、30 mg·L-1的蔗糖土壤對(duì)仙鶴草愈傷組織增長(zhǎng)情況及總黃酮含量的影響進(jìn)行分析，在510 nm波長(zhǎng)下，對(duì)其中一組的相對(duì)吸收情況作為參考，對(duì)另一組的相對(duì)吸收度進(jìn)行測(cè)量，見(jiàn)表4。

表4 不同土壤條件對(duì)仙鶴草愈傷組織增長(zhǎng)情況及總黃酮含量的影響

添加2 mg·L-1生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑吸光度更低，添加30 mg·L-1蔗糖土壤吸光度更高，總黃酮量更高。

3 討論

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑通常利用調(diào)節(jié)部分酶的合成與活性對(duì)仙鶴草愈傷組織生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，對(duì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度進(jìn)行調(diào)整，一般會(huì)導(dǎo)致仙鶴草愈傷組織產(chǎn)生很大的改變，在本研究中，向土壤中添加較低質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能夠幫助仙鶴草愈傷組織增長(zhǎng)。

碳源為土壤中主要的能源物質(zhì)，亦為主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對(duì)愈傷增長(zhǎng)有很大影響，然而不同植物對(duì)碳源的影響是存在差異的。本研究將蔗糖當(dāng)成碳源能夠幫助仙鶴草愈傷組織增長(zhǎng)，這主要是由于蔗糖與葡萄糖相比能夠有效保持土壤中低滲環(huán)境，不容易幫助仙鶴草細(xì)胞脫水造成愈傷組織增長(zhǎng)，并且蔗糖和葡萄糖相比更有助于仙鶴草愈傷組織生物量積累。

4 結(jié)論

課題研究發(fā)現(xiàn)將蔗糖當(dāng)成碳源添加至土壤中，在濃度是30 mg·L-1的情況下最合理，在濃度是45 mg·L-1與15 mg·L-1情況下愈合組織增長(zhǎng)最好，可以看出蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)仙鶴草生長(zhǎng)非常重要。

添加2 mg·L-1生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑總黃酮量比添加30 mg·L-1蔗糖土壤更高和上述土壤條件對(duì)仙鶴草愈傷組織增長(zhǎng)的結(jié)論一致。

綜上可得出：（1）向土壤中添加較低質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能夠幫助仙鶴草愈傷組織增長(zhǎng)；

（2）將蔗糖碳源添加至土壤比將葡萄糖碳源添加至土壤更能幫助仙鶴草愈傷組織增長(zhǎng)；

（3）在蔗糖濃度是30 mg·L-1的情況將其添加至土壤，最有助于仙鶴草愈傷組織增長(zhǎng)；

（4）添加2 mg·L-1生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑總黃酮量比添加30 mg·L-1蔗糖土壤更高。

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Effects of Different Soils on Callus and Total Flavonoids Content inLedeb.

LIANG Ji-hua1, GU Jian-zhong2, QIAO Nai-ni1

1.415000,2.415000,

In order to obtain the optimal soil conditions for callus proliferation and high total flavonoids content fromLedeb. to provide effective basis for the cultivation of the calla and study the effect of different soil conditions on the callus growth and total flavonoid content of the calla. The celestial grass from Fuzhou, Jiangxi was selected as a plant sample. The experiment consists of three processing steps. Step one is to add a plant growth regulator to the soil. Step two is to add a carbon source to the soil. Step three is to add sucrose to the soil. After 35 days, the callus growth and total flavonoid content of each plant were measured. It was found that 1 mg·L-1and 2 mg·L-1growth regulators were added to the soil, and the callus growth of the crane was relatively poor after treatment. After adding a lower mass concentration of the growth regulator to the soil, the crane Callus growth was relatively good, and the difference was statistically significant (<0.05). The callus proliferation ofcallus formed by adding 30 mg·L-1of sucrose to the soil was the fastest, which was similar to the other conditions. The specific difference was statistically significant (<0.05); the absorbance of 2 mg·L-1growth regulator was lower, the soil absorbance of 30 mg·L-1sucrose was higher, and the total flavonoids were higher. The following conclusions are drawn: adding a low-mass growth regulator to the soil, or adding sucrose at a concentration of 30 mg·L-1to the soil, is most conducive to the growth ofcallus, adding 2 mg·L The total flavonoids of-1growth regulator were higher than those of soil supplemented with 30 mg·L-1sucrose.

Soil;Ledeb.; callus; flavonoid

S567.239

A

1000-2324(2021)03-0443-05

2019-01-05

2019-03-06

湖南省科技廳課題(2015NK2113)

梁繼華(1979-),女,碩士,副教授,研究方向:植物與環(huán)境. E-mail:jihualiang521@126.com