韓博林，關(guān)樺楠*，龔德?tīng)?，遇世友，劉曉飛，張 娜

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076）

天然活性酶由于其催化效率高和特異性強(qiáng)已被廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域。但因其在過(guò)酸、過(guò)堿條件下容易失活、不易保存、價(jià)格較昂貴等諸多限制因素，尋找既具有天然酶的催化活性又能克服天然酶不足的模擬酶成為研究熱點(diǎn)。隨著納米技術(shù)的高速發(fā)展，許多納米材料已被證實(shí)具有固有的過(guò)氧化物酶活性，同時(shí)一些復(fù)合納米材料展現(xiàn)出更優(yōu)良的模擬酶活性在諸多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1-6]。其中Fe3O4磁性納米粒子具有內(nèi)在的過(guò)氧化物酶活性，它結(jié)合了磁性分離、合成簡(jiǎn)單、成本低的優(yōu)點(diǎn)。但是，暴露的納米顆粒容易被氧化，在Fe3O4表面官能化具有過(guò)氧化物酶活性的其他納米顆粒可以解決這個(gè)問(wèn)題，并且提高復(fù)合納米顆粒的過(guò)氧化物酶樣活性。金磁微粒是一種表面包含金納米粒子，內(nèi)核為磁性材料的復(fù)合納米微粒[7-8]。在快速富集分離的基礎(chǔ)上，還具有良好的單分散性、穩(wěn)定性、生物適應(yīng)性和光學(xué)性能，因此被廣泛應(yīng)用于生物催化、生物醫(yī)學(xué)、食品安全檢驗(yàn)等諸多領(lǐng)域[9-13]。單金屬Fe3O4納米粒子和金納米粒子（AuNPs）均表現(xiàn)出優(yōu)異的過(guò)氧化物酶活性[14-15]。因此，將AuNPs負(fù)載到Fe3O4納米粒子表面合成復(fù)合微粒，不僅可以提升其過(guò)氧化物酶活性，而且增強(qiáng)了穩(wěn)定性和生物相容性，有利于納米粒子的分離和回收。與天然酶相比納米材料模擬酶具有穩(wěn)定、低成本、易保存的優(yōu)點(diǎn)使其在食品分析與檢測(cè)方面具有廣泛的應(yīng)用。葡萄糖是一種多羥基醛，其在生命科學(xué)及食品領(lǐng)域具有非常重要意義與地位。葡萄糖檢測(cè)方法主要有色譜法、光譜法和電化學(xué)法等[16-18]。但是，這些方法都有著各自對(duì)于儀器、操作人員、成本等的限制因素。因此構(gòu)建一種高靈敏、高選擇性、快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)新方法有著重要的應(yīng)用價(jià)值[19-21]。本實(shí)驗(yàn)采用水熱法制備Fe3O4納米粒子，并通過(guò)表面氨基化與金納米粒子自組裝方法構(gòu)建金磁微粒（Fe3O4@Au），利用其模擬過(guò)氧化物酶活性構(gòu)建葡萄糖檢測(cè)體系。體系中葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOx）作用于葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)生H2O2，F(xiàn)e3O4@Au模擬酶催化反應(yīng)產(chǎn)物H2O2與過(guò)氧化物酶底物二按鹽2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）產(chǎn)生顯色反應(yīng)。體系以此原理建立了高靈敏、高選擇性、可視化檢測(cè)葡萄糖含量的簡(jiǎn)便方法，相關(guān)結(jié)果將為拓寬納米材料模擬酶在食品檢測(cè)中的應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蘋(píng)果 哈爾濱市家樂(lè)福超市。

GOx（TypeX-SG7141-50KU, from Aspergillus niger）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；FeCl3·6H2O、NaAc·3H2O、PEG-4000、葡萄糖、ABTS 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷（(3-aminopropyl)triethoxysilane，APTES） 淮安和元化工有限公司；氯金酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

水熱反應(yīng)釜 西安洪辰儀器廠；恒溫振蕩搖床金壇市精工儀器設(shè)備有限公司；MAGNA-IR560E.S.P型傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Nicolet公司；phi-5000Versaprobe型X射線光電子能譜儀 美國(guó)ULVCAPHI公司；UV2250型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 北京桑翌科技發(fā)展有限公司；H-7500型透射電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社；BT-9300H型激光粒度分布儀 美國(guó)麥克儀器公司；9600型振動(dòng)磁強(qiáng)計(jì) 美國(guó)LDJ Electronics公司。

1.3 方法

1.3.1 Fe3O4納米粒子的制備

將1.35 g的FeCl3·6H2O溶于40 mL乙二醇中，依次加入3.6 g的NaAc·3H2O與1.0 g的PEG-4000，形成均勻溶液后再攪拌30 min。然后將溶液倒入50 mL水熱反應(yīng)釜中，200 ℃保持8 h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，所得黑色的產(chǎn)物分別用乙醇和水各洗滌3 次[22]。

1.3.2 金納米粒子的綠色制備

取200 mL的蒸餾水加熱至80 ℃，加入100 g葡萄皮浸泡30 min。將浸泡液于4 000 r/min離心3 min，取上清液，以此上清液作為母液。使用去離子水稀釋母液獲得母液體積分?jǐn)?shù)為20%的葡萄皮工作液200 mL，于冰箱4 ℃保存。取4 ℃預(yù)冷的氯金酸溶液20 mL置于燒杯中，伴隨磁力攪拌器溫和攪動(dòng)2 min后，迅速加入20%的葡萄皮工作液5 mL，隨即觀察顏色的變化，即由黃色變?yōu)樽仙僮優(yōu)榫萍t色，當(dāng)體系顏色出現(xiàn)酒紅色時(shí)，攪拌速率提升，20 min后結(jié)束反應(yīng)，將反應(yīng)液置于冰箱4 ℃條件下保存[23-24]。

1.3.3 Fe3O4@Au的制備

參考文獻(xiàn)[25-26]方法并進(jìn)行改良。取2 g制備的Fe3O4納米粒子加入50 mL乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)為20%），超聲1 min，逐滴加入1 mL APTES，在恒溫振蕩搖床中以120 r/min反應(yīng)8 h后得到淺棕色的懸濁液，產(chǎn)物即為氨基化修飾后的Fe3O4納米微粒。產(chǎn)物用20%乙醇溶液磁分離清洗3 次，60 ℃烘干備用。取上述制備的氨基修飾的Fe3O4納米微粒2 g邊攪拌邊加入20 mL所制備的金納米粒子溶液，混合溶液由棕色逐漸變淡，低速攪拌反應(yīng)12 h后，獲得Fe3O4@Au。

1.3.4 表征

將制備的磁性材料粉末用適量的蒸餾水稀釋，置于超聲波清洗器上超聲振蕩使其均勻分散。Fe3O4@Au的磁學(xué)性能通過(guò)振動(dòng)磁強(qiáng)計(jì)室溫下測(cè)量。利用X射線光電子能譜對(duì)合成的復(fù)合微粒進(jìn)行分析。利用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行分析，將合成的干燥納米粒子粉末與KBr混合，充分研磨后壓片，在紅外光譜儀下進(jìn)行表征，根據(jù)得到的紅外光譜圖對(duì)此納米粒子產(chǎn)品進(jìn)行分析。

1.3.5 單因素試驗(yàn)優(yōu)化Fe3O4@Au檢測(cè)葡萄糖的體系

1.3.5.1 Fe3O4@Au懸浮液質(zhì)量濃度對(duì)葡萄糖檢測(cè)體系的影響

將100 μL葡萄糖氧化酶（1 mg/mL）和300 μL（10 mmol/L）的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液加入到600 μL磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（10 mmol/L、pH 7.0）中，37 ℃水浴孵育30 min[18]。反應(yīng)結(jié)束后向上述反應(yīng)液中加入100 μL不同質(zhì)量濃度的Fe3O4@Au懸浮液（0.01、0.05、0.1、0.15 g/mL和0.2 g/mL），200 μL ABTS（25 mmol/L）溶液和3 mL HAc-NaAc緩沖溶液（0.1 mol/L、pH 4.4），將混合溶液在50 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min后（水浴過(guò)程中每過(guò)1 min溫和倒轉(zhuǎn)1 次，下同）取出，采用磁鐵將納米Fe3O4@Au固定在離心管底部，靜置1 min，吸取上清液3 mL，以蒸餾水為空白，測(cè)定420 nm波長(zhǎng)處吸光度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.3.5.2 反應(yīng)溫度對(duì)檢測(cè)體系的影響

將100 μL（1 mg/mL）GOx和300 μL（10 mmol/L）的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液加入到600 μL PBS（10 mmol/L、pH 7.0）中，37 ℃水浴孵育30 min。反應(yīng)結(jié)束后向上述反應(yīng)液中加入100 μL的Fe3O4@Au懸浮液（0.05 g/mL），200 μL ABTS（25 mmol/L）溶液和3 mL HAc-NaAc緩沖溶液（0.1 mol/L、pH 4.4），將反應(yīng)體系放置于30、40、50、60 ℃和70 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min后取出，采用磁鐵將納米Fe3O4@Au固定在離心管底部，靜置1 min，吸取上清液3 mL，以蒸餾水為空白，測(cè)定420 nm波長(zhǎng)處吸光度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.3.5.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)體系的影響

將100 μL（1 mg/mL）GOx和300 μL（10 mmol/L）的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液加入到600 μL PBS（10 mmol/L、pH 7.0）中，37 ℃水浴孵育30 min。反應(yīng)結(jié)束后向上述反應(yīng)液中加入100 μL的Fe3O4@Au懸浮液（0.05 g/mL），200 μL的ABTS（25 mmol/L）溶液和3 mL HAc-NaAc緩沖溶液（0.1 mol/L、pH 4.4），將反應(yīng)體系放置于50 ℃水浴鍋中反應(yīng)（10、20、30、40 min和50 min）后取出，采用磁鐵將納米Fe3O4@Au固定在離心管底部，靜置1 min，吸取上清液3 mL，以蒸餾水為空白，測(cè)定420 nm波長(zhǎng)處吸光度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.3.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化檢測(cè)體系

將100 μL（1 mg/mL）GOx和300 μL（10 mmol/L）的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液加入到600 μL PBS（10 mmol/L、pH 7.0）中，37 ℃水浴孵育30 min。反應(yīng)結(jié)束后向上述反應(yīng)液中加入100 μL不同質(zhì)量濃度的Fe3O4@Au懸浮液，200 μL ABTS（25 mmol/L）溶液和3 mL HAc-NaAc緩沖溶液（0.1 mol/L、pH 4.4），將混合溶液在不同溫度水浴鍋中反應(yīng)不同時(shí)間后（水浴過(guò)程中每過(guò)1 min溫和倒轉(zhuǎn)一次）取出，采用磁鐵將納米Fe3O4@Au固定在離心管底部，靜置1 min，吸取上清液3 mL，以蒸餾水為空白，測(cè)定420 nm波長(zhǎng)處吸光度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。確定因素影響的主次順序及優(yōu)選方案。

1.3.7 葡萄糖檢測(cè)體系工作曲線、檢出限、回收率和選擇性的測(cè)定

在最適質(zhì)量濃度、最適時(shí)間、溫度體系下將100 μL（1 mg/mL）GOx和300 μL（1、2.5、5、7.5、10、15、20 mmol/L）的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液加入到600 μL PBS（10 mmol/L、pH 7.0）中，37 ℃水浴孵育30 min。反應(yīng)結(jié)束后向上述反應(yīng)液中加入100 μL的Fe3O4@Au懸浮液，200 μL ABTS（25 mmol/L）溶液和3 mL HAc-NaAc緩沖溶液（0.1 mol/L、pH 4.4），水浴一段時(shí)間后采用磁鐵將納米Fe3O4@Au固定在離心管底部，靜置1 min，吸取上清液3 mL，以蒸餾水為空白，測(cè)定420 nm處吸光度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。根據(jù)不同質(zhì)量濃度葡萄糖與吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算最低檢出限。選擇10、20 mmol/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液加入到上述檢測(cè)體系，測(cè)定其吸光度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)6 次，測(cè)定其回收率及精密度。在正交試驗(yàn)優(yōu)化的條件下向檢測(cè)體系中分別加入1 mol/L乳糖、蔗糖和麥芽糖，水浴一段時(shí)間后，觀察體系中顏色變化，確定檢測(cè)體系的選擇性。

1.3.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

樣品的預(yù)處理蘋(píng)果：果蔬切碎，研磨成均勻糊狀，用干凈的燒杯稱取約1 g，加入約20 mL去離子水溶解，并超聲30 min，然后用布氏漏斗過(guò)濾兩次，再轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶定容，混勻后用0.45 μm的濾膜過(guò)濾一次，最后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中待用。加入不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，重復(fù)測(cè)定5 次，考察檢測(cè)體系的加標(biāo)回收率，并評(píng)價(jià)檢測(cè)體系的精確度和重復(fù)性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)均重復(fù)5 次，利用Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)作圖。采用DPS 7.05軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Fe3O4@Au的表征

圖1 Fe3O4@Au合成示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the preparation of Fe3O4@Au

本實(shí)驗(yàn)采用水熱法制備Fe3O4納米粒子，并通過(guò)對(duì)其表面氨基化與金納米粒子自組裝方法構(gòu)建Fe3O4@Au，合成示意圖如圖1所示。采用硅烷偶聯(lián)劑APTES對(duì)Fe3O4納米粒子進(jìn)行表面氨基化改性，APTES改性的目的是在磁性粒子的表面形成一層分子結(jié)合劑，并通過(guò)在介孔孔道中引入帶正電荷的氨基，利用中和反應(yīng)的機(jī)制并通過(guò)靜電力、氫鍵等相互作用可以提高對(duì)表面帶有負(fù)電荷的金納米粒子的吸附結(jié)合效率，以此原理構(gòu)建組裝型Fe3O4@Au。

圖2 氨基化Fe3O4納米粒子傅里葉紅外光譜圖Fig. 2 Infrared spectrum of aminated Fe3O4 nanoparticles

對(duì)合成的氨基化Fe3O4納米粒子進(jìn)行傅里葉紅外光譜分析，從圖2可知，在1 610、1 659 cm-1和2 938 cm-1波數(shù)處分別為C＝C、C＝O和C—H的特征峰。與此同時(shí)，在1 835 cm-1和1 483 cm-1處有吸收波長(zhǎng)，這是氨基的特征吸收波長(zhǎng)，因而證明了氨基的存在，同時(shí)在3 508 cm-1左右的地方有亞甲基的吸收峰，這是APTES基團(tuán)特征峰，該結(jié)果表明，APTES已成功地被接枝到Fe3O4納米粒子的表面上，使得其表面發(fā)生氨基化改性，并帶有適量的正電荷。

根據(jù)Fe3O4納米粒子和氨基化Fe3O4納米粒子磁學(xué)性質(zhì)結(jié)果可知，在300 K的磁滯回線（Oe=79.578 A/m），納米Fe3O4和氨基化Fe3O4納米粒子的磁飽和強(qiáng)度值（M）分別為78 emu/g和59 emu/g，F(xiàn)e3O4納米粒子和功能化Fe3O4納米粒子均表現(xiàn)出了很好的超順磁性和磁場(chǎng)感應(yīng)性，說(shuō)明氨基化作用不會(huì)顯著影響磁球的超順磁性特點(diǎn)。與納米Fe3O4比較，氨基化Fe3O4納米粒子的磁飽和，可有效防止納米磁球聚合，使得納米磁球能夠穩(wěn)定地分散在水溶液中。

圖3 金納米粒子的粒徑分布Fig. 3 Particle size distribution of gold nanoparticles

由圖3可知，金納米粒子粒徑呈正態(tài)分布，主要分布在7～9 nm范圍內(nèi)，占整個(gè)分布體系的79%，平均粒徑達(dá)到（7.8±0.4）nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明利用綠色還原法制備的金納米粒子平均尺寸較小，其催化活性更高，在負(fù)載到氨基化Fe3O4納米粒子表面合成復(fù)合微粒后，可以產(chǎn)生協(xié)同作用進(jìn)一步提升納米微粒的過(guò)氧化物酶活性。

基于靜電自組裝法，采用氨基化的Fe3O4納米粒子構(gòu)建Fe3O4@Au。見(jiàn)圖4，X射線光電子能譜分析結(jié)果表明，所構(gòu)建的Fe3O4@Au分別在4f位點(diǎn)和2p位點(diǎn)呈現(xiàn)出了Au和Fe的能譜特征峰，其中，F(xiàn)e（2p3/2）和Fe（2p1/2）結(jié)合能分別為711.08 eV和724.48 eV，表明Fe的來(lái)源是Fe3O4；Au（4f7/2）和Au（4f5/2）結(jié)合能分別為83.78 eV和87.48 eV，表明Au的來(lái)源為零價(jià)態(tài)的單質(zhì)Au。結(jié)果表明，基于自組裝法，金納米粒子已成功結(jié)合在氨基化的Fe3O4納米粒子表面。

圖4 Fe3O4@Au的XPS譜圖Fe（2p）（A）和Au（4f）（B）Fig. 4 XPS spectra in the regions of Fe (2p) (A) and Au (4f) (B) for Fe3O4@Au

如圖5所示，F(xiàn)e3O4納米粒子的表面吸附有密集的金納米粒子，結(jié)果表明氨基化的磁性材料可以固載金納米粒子。綜上所述，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基于自組裝法，已成功構(gòu)建出Fe3O4@Au。利用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)測(cè)量Fe3O4@Au的磁滯回線，磁學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果表明，其依然具有超順磁性，磁飽和強(qiáng)度值為43 emu/g。說(shuō)明包覆Au的含量升高會(huì)導(dǎo)致復(fù)合微粒磁化強(qiáng)度的輕微降低，這一結(jié)論和其他同類磁性納米復(fù)合微粒的磁學(xué)性質(zhì)一致[26]。

圖5 Fe3O4@Au透射電子顯微鏡圖片（×40 000）Fig. 5 TEM image of Fe3O4@Au (× 40 000)

2.2 模擬酶體系檢測(cè)葡萄糖單因素試驗(yàn)

2.2.1 Fe3O4@Au懸浮液質(zhì)量濃度對(duì)檢測(cè)體系的影響

體系中Fe3O4@Au表現(xiàn)出過(guò)氧化物模擬酶催化活性，能夠有效催化H2O2氧化ABTS發(fā)生顯色反應(yīng)，基于此，結(jié)合GOx與葡萄糖反應(yīng)生成H2O2的原理，考察紫外-可見(jiàn)光吸收光譜于420 nm波長(zhǎng)處（ABTS的特征峰）的吸光度，間接檢測(cè)體系中的葡萄糖?；诩{米材料模擬酶檢測(cè)葡萄糖原理如圖6所示。孵育反應(yīng)中葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下生成H2O2，在Fe3O4@Au模擬過(guò)氧化物酶活性的催化下，過(guò)氧化物酶顯色底物ABTS顏色由無(wú)色變成綠色，以此原理檢測(cè)體系中的葡萄糖。

圖6 檢測(cè)葡萄糖原理圖Fig. 6 Schematic diagram of glucose detection

首先，考察Fe3O4@Au混懸液質(zhì)量濃度對(duì)檢測(cè)體系的影響。由圖7A可知，質(zhì)量濃度在0.01～0.1 g/mL范圍內(nèi)時(shí)，隨質(zhì)量濃度的增加吸光度呈平穩(wěn)上升趨勢(shì)。添加量在0.1～0.15 g/mL時(shí)，反應(yīng)速率變大。添加量在0.15～0.2 g/mL范圍內(nèi)時(shí)，吸光度緩慢平穩(wěn)下降。由此可知，F(xiàn)e3O4@Au混懸液質(zhì)量濃度為0.15 g/mL時(shí)反應(yīng)體系檢測(cè)效果最好。結(jié)果表明，在以下正交試驗(yàn)優(yōu)化中，F(xiàn)e3O4@Au混懸液的質(zhì)量濃度取0.1、0.15 g/mL和0.2 g/mL較為適合。

圖7 單因素試驗(yàn)條件對(duì)檢測(cè)體系的影響Fig. 7 Effect of various factors on the detection system investigated by one-factor-at-a-time method

2.2.2 催化溫度對(duì)檢測(cè)體系的影響

由圖7B可知，當(dāng)溫度在30～40 ℃范圍內(nèi)時(shí)，吸光度穩(wěn)定上升，40～50 ℃范圍內(nèi)，反應(yīng)速率變大，當(dāng)溫度在50～70 ℃范圍內(nèi)時(shí)反應(yīng)速率明顯下降。結(jié)果表明，吸光度隨溫度的提高呈上升趨勢(shì)，溫度越高檢測(cè)體系效果越好?？紤]到傳感系統(tǒng)其實(shí)用性，反應(yīng)溫度過(guò)高不利于其即時(shí)檢測(cè)，同時(shí)在50～70 ℃范圍內(nèi)，體系反應(yīng)速率變緩，基本已經(jīng)達(dá)到最優(yōu)的反應(yīng)效果。為此選擇實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中吸光度最好的3 個(gè)水平參與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化。同時(shí)隨著反應(yīng)溫度的升高，模擬酶的相對(duì)活性逐漸增加，表明在較寬的溫度范圍內(nèi)，F(xiàn)e3O4@Au模擬過(guò)氧化物酶具有較好的催化效果。

2.2.3 催化時(shí)間對(duì)檢測(cè)體系的影響

如圖7C所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，吸光度呈不斷上升的趨勢(shì)。時(shí)間在10～20 min時(shí)，吸光度緩慢上升，在20～30 min時(shí)，反應(yīng)速率輕微下降，在30～40 min時(shí)，吸光度開(kāi)始平穩(wěn)上升。在40～50 min時(shí)，反應(yīng)速率明顯下降，反應(yīng)進(jìn)程變慢。結(jié)果表明，在一定的時(shí)間內(nèi)，質(zhì)量濃度和溫度相同時(shí)，檢測(cè)葡萄糖的效果隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在40～50 min范圍內(nèi)反應(yīng)速率變慢，檢測(cè)體系反應(yīng)效果基本達(dá)到最優(yōu)，過(guò)長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間不利于其快速即時(shí)檢測(cè)，因此選擇50 min為其最優(yōu)的反應(yīng)時(shí)間，其檢測(cè)響應(yīng)效果良好，并在正交試驗(yàn)優(yōu)化時(shí)選擇反應(yīng)時(shí)間為30、40 min和50 min。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Orthogonal array design with experimental results for optimization of detection conditions

由表1可知，各因素對(duì)檢測(cè)葡萄糖體系影響主次順序?yàn)椋篋＞B＞A，即催化時(shí)間＞催化溫度＞Fe3O4@Au混懸液質(zhì)量濃度。通過(guò)極差分析確定的最優(yōu)方案組合為：A2B3D3，即Fe3O4@Au混懸液質(zhì)量濃度0.15 g/mL、催化溫度70 ℃、催化時(shí)間50 min。綜合上述分析，可以說(shuō)明反應(yīng)時(shí)間是影響檢測(cè)體系的主要因素，反應(yīng)溫度和Fe3O4@Au混懸液濃度對(duì)反應(yīng)體系也有相應(yīng)的影響。以正交試驗(yàn)結(jié)果最優(yōu)方案進(jìn)行葡萄糖檢測(cè)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)5 次，吸光度平均值為0.352，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.16%。

2.4 葡萄糖檢測(cè)體系的響應(yīng)效果

2.4.1 最低檢出限

在正交優(yōu)化檢測(cè)條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，配制不同濃度的葡萄糖溶液，在Fe3O4@Au模擬過(guò)氧化物酶活性的基礎(chǔ)上結(jié)合葡萄糖在GOx作用下產(chǎn)生H2O2，并與ABTS產(chǎn)生顯色反應(yīng)的原理，掃描體系的紫外-可見(jiàn)光吸收光譜，通過(guò)光譜的變化評(píng)價(jià)體系反應(yīng)的進(jìn)程。如圖8A所示，在420 nm波長(zhǎng)出現(xiàn)ABTS的最大吸收峰，葡萄糖濃度為1 mmol/L時(shí)，吸光度最小，吸光度與體系中葡萄糖濃度呈正比。結(jié)果顯示，檢測(cè)體系對(duì)葡萄糖響應(yīng)效果良好。對(duì)不同濃度的葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖8B所示，葡萄糖在1～20 mmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝28.423x＋0.098 2，相關(guān)系數(shù)R2值為0.992 5，根據(jù)方程計(jì)算（3s/b）檢出限為2.45 μmol/L。根據(jù)本研究中所獲得的檢出限，與其他基于納米材料的檢測(cè)葡萄糖方法進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，本研究的最低檢出限為2.45 μmol/L，與其他研究中檢測(cè)葡萄糖相比具有相對(duì)較低的檢出限，說(shuō)明此基于Fe3O4@Au模擬酶性質(zhì)檢測(cè)葡萄糖的檢測(cè)方法具有良好的靈敏度。

圖8 葡萄糖檢測(cè)體系響應(yīng)效果Fig. 8 Response curves of glucose detection system

表2 基于納米材料的葡萄糖測(cè)定方法的比較Table 2 Comparison of nanomaterial-based methods for determination of glucose content

2.4.2 檢測(cè)體系選擇性

圖9 葡萄糖檢測(cè)體系的選擇性Fig. 9 Selectivity of glucose detection system

比色檢測(cè)體系的一個(gè)重要指標(biāo)就是檢測(cè)其選擇性，本研究選擇含有0.01 mol/L葡萄糖的體系作為參照，與3 種食品中常見(jiàn)的糖類（乳糖、蔗糖和麥芽糖）做對(duì)比研究，評(píng)估模擬酶檢測(cè)葡萄糖體系的特異性。每種糖類的濃度為葡萄糖濃度的100 倍，即1 mol/L。如圖9所示，葡萄糖測(cè)定具有的特異性和選擇性，相對(duì)于0.01 mol/L葡萄糖、1 mol/L蔗糖、1 mol/L的乳糖和1 mol/L麥芽糖不干擾測(cè)定。因此，本比色檢測(cè)方法對(duì)于葡萄糖檢測(cè)具有高的選擇性。葡萄糖吸光度和之前對(duì)應(yīng)濃度的實(shí)驗(yàn)基本一致，也說(shuō)明了此體系具有一定的重復(fù)性，響應(yīng)效果較好，可望實(shí)現(xiàn)實(shí)際食品樣品中葡萄糖的測(cè)定。

2.4.3 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

在相同反應(yīng)體系下測(cè)定0.01 mol/L和0.02 mol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，對(duì)檢測(cè)體系進(jìn)行回收率評(píng)價(jià)，回收率分別為105%和94.5%。重復(fù)測(cè)定5 次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.29%和2.15%，說(shuō)明該模擬酶檢測(cè)體系具有良好的精密度。在蘋(píng)果樣品的浸提液中加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，以確定此檢測(cè)體系對(duì)樣品中不同濃度葡萄糖的加標(biāo)回收率和精密度，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定5 次，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，加標(biāo)回收率在96%～104%之間，且組內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差皆在5%以下，說(shuō)明該模擬酶檢測(cè)體系具有良好的加標(biāo)回收率和精密度，并且具有良好的重復(fù)性，可望實(shí)現(xiàn)更多實(shí)際樣品中葡萄糖的檢測(cè)。

表3 檢測(cè)實(shí)際樣品中不同濃度葡萄糖的回收率和精密度Table 3 Recoveries and precision for real samples spiked at different concentrations of glucose

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用納米模擬酶活性建立高選擇、靈敏、快速檢測(cè)食品中葡萄糖含量的比色檢測(cè)體系。采用水熱法制備Fe3O4納米粒子，并綠色還原法制備金納米粒子，再利用氨基化法制備出了Fe3O4@Au微粒。利用其模擬過(guò)氧化物酶特性建立了葡萄糖檢測(cè)體系，優(yōu)化體系并對(duì)其葡萄糖的檢測(cè)性能進(jìn)行評(píng)估。研究結(jié)果表明，所制備的Fe3O4@Au微粒具有良好的過(guò)氧化物模擬酶活性，檢測(cè)方法具有較高的靈敏度、精確度、選擇性并且操作簡(jiǎn)便。相關(guān)結(jié)果將為食品中葡萄糖檢測(cè)方法的改良積累基礎(chǔ)資料。本研究將為拓寬納米材料模擬酶在食品檢測(cè)中的應(yīng)用提供參考。