梁 峰，何天海，林 琳，姜紹通，陸劍鋒*

（合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，安徽省農產品精深加工重點實驗室，安徽 合肥 230009）

白鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）作為中國“四大家魚”之一，養(yǎng)殖歷史悠久，產量巨大，在我國淡水養(yǎng)殖魚類中，其產量位居第三，2017年達到385.28萬 t[1]。鰱魚肉質鮮嫩，味道鮮美、溫和，但土腥味略重[2]。為提高鰱魚的附加值和可接受度，常把白鰱魚肉制成魚糜制品，常見的魚糜制品有魚肉香腸、模擬蟹肉、模擬蝦肉、模擬貝柱、魚糕、竹輪等[3]。魚糜凝膠形成過程中，隨著溫度的升高，分別經歷凝膠化（35～40 ℃）、凝膠劣化（50～70 ℃）、魚糕化（＞70 ℃）3 個階段，最終所得魚糕即為傳統(tǒng)意義上的魚腸[4]。溫度處于50～70 ℃時，魚肉內的內源性蛋白酶被激活，使得肌原纖維蛋白被降解，凝膠化過程中形成的凝膠網狀結構被破壞，即凝膠劣化[5]。為使魚糜凝膠快速渡過劣化溫度區(qū)間，目前傳統(tǒng)處理所常采用的方法是“二段水浴加熱法”，即一段水浴采用溫度35～40 ℃，保溫1～2 h，二段水浴采用溫度90 ℃，處理30 min，其中一段水浴的溫度和時間對魚糜中肉類蛋白的變性和凝膠的形成具有重要影響[6]。

魚糜中的蛋白質易受低溫凍害，導致功能性降低，因此冷凍貯藏過程中需加入蔗糖、山梨醇及其混合物作為冷凍保護劑[7]。已有的研究表明，向白鰱魚糜中添加蔗糖，會降低其凝膠性能，而添加適量鹽類[8]、蛋白類[9]、淀粉類[10]、水溶膠類[11-12]、酶制劑[13]等可以改善或提高魚糜制品的凝膠特性。谷氨酰胺轉氨酶（transglutaminase，TG）常用于肉制品加工業(yè)，催化肉類蛋白中賴氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上的γ-羥酰胺基相結合，通過轉谷氨酰胺作用形成共價化合物[14-16]。由于其具有良好的促凝膠形成能力及高度的親水性，在水產加工方面常用來提高凝膠產品的凝膠強度和持水性[17-19]。

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）是我國每年消費量最大的淡水蟹類之一，2017年我國河蟹養(yǎng)殖產量為75.09萬 t，遠大于各種海水蟹類總養(yǎng)殖量28.60萬 t[1]。中華絨螯蟹正常的養(yǎng)殖周期為兩年，而性早熟蟹在第一年即達到性成熟（一齡早熟蟹）。性早熟是目前蟹類養(yǎng)殖過程中普遍存在的現(xiàn)象，其比例約占養(yǎng)殖總量的15%～30%[20-21]。由于性早熟蟹體型較小，商品價值極低，養(yǎng)殖戶蒙受損失的同時，這類資源也常遭到浪費。性早熟蟹的加工方式較單一，主要是將其加工成醉蟹或蟹肉罐頭，從而提高附加值，而性早熟蟹的深加工開發(fā)利用還有待進一步研究[22]。鑒于此，本實驗對添加性早熟蟹肉后白鰱魚糜凝膠制備工藝進行探究及優(yōu)化，為今后低值蟹肉在魚糜制品中的開發(fā)應用提供實踐依據(jù)或理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍白鰱魚糜 洪湖市井力水產食品股份有限公司；冷凍性早熟蟹肉 安徽福恩食品科技有限公司；食品級PVDC塑料腸衣（直徑30 mm）、TG 南寧龐博生物工程有限公司；食品級氯化鈉，磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、戊二醛、無水乙醇、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）（均為分析純） 美豐科技有限公司。

1.2 儀器與設備

S2-5型斬拌機 廣州旭眾食品機械有限公司；HZ-2型兩孔數(shù)顯水浴鍋 江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠；CT-15RT型臺式高速冷凍離心機 上海天美生化儀器與設備工程有限公司；TA-XT plus型物性儀 英國Stable Micro System公司；FA1104N型電子分析天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；SU-50型卡扣機 瑞安市特豐機械廠；FD-1B-50型冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；SU8020場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；DYY-11型電泳儀 北京市六一儀器廠；T18型高速分散器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 混合凝膠的制備

冷凍魚糜、蟹肉解凍（4 ℃）→斬拌（2% NaCl和0.3% TG）→手動灌腸→二段水浴加熱→冰水冷卻→4 ℃放置過夜→測定凝膠性質

蟹肉比例：蟹肉比例取5%、10%、15%、20%、25%，同魚糜混合斬拌后灌腸，一段水浴40 ℃處理1 h，二段水浴90 ℃處理30 min；凝膠化溫度：蟹肉比例取10%，同魚糜混合斬拌后灌腸，一段水浴分別30、35、40、45、50 ℃處理1 h，二段水浴90 ℃處理30 min；凝膠化時間：蟹肉比例取10%，同魚糜混合斬拌后灌腸，一段水浴40 ℃分別處理1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，二段水浴90 ℃處理30 min。

1.3.2 凝膠強度的測定

將過夜放置的魚腸剝去外衣，切割成20 mm高的圓柱體，通過TA-XT plus物性儀測量其凝膠特性，包括破斷力、破斷距離和凝膠強度。具體參數(shù)為：P/5S球形探頭（直徑5 mm），觸發(fā)類型Auto（Force），預壓速率1 mm/s，下壓速率1.5 mm/s，測試速率1.0 mm/s，回復速率3.0 mm/s，下壓距離15 mm，感應力5.0 g。每組樣品平行測6 次。

1.3.3 持水性的測定

將過夜放置的凝膠切成約2 mm的薄片，等分4 份后攤放在兩層濾紙上包裹好，放入離心管中，溫度18 ℃、6 640×g離心10 min，測定其持水性，每組平行測定3 次，結果取平均值。持水性計算公式為：

式中：w1為離心前質量/g；w2為離心后質量/g。

1.3.4 SDS-PAGE檢驗

參考Kudre等[23]并略作修改。取3 g凝膠樣品同27 mL的5% SDS溶液均質混合，之后于85 ℃水浴中加熱1 h，再將其于10 380×g離心10 min。取上清液與樣品緩沖液（4 mL 10% SDS，2 mL甘油，1 mL β-巰基乙醇，2.5 mL 0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）和0.03 g溴酚藍）按照1∶1（V/V）比例進行混合，沸水浴5 min，配制5%濃縮膠、10%分離膠，上樣10 μL，恒壓100 V電泳。SDS-聚丙烯酰胺疑膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）完后用0.1%考馬斯亮藍R-250染色，醋酸甲醇溶液脫色，最后在凝膠成像儀上成像。

1.3.5 掃描電鏡觀察

將樣品切成3 mm×3 mm×3 mm小塊，在4 ℃條件下用2.5%戊二醛固定液浸泡24 h，再用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.2）浸泡清洗15 min，重復3 次。然后依次用50%、60%、70%、90%、100%乙醇逐級脫水各10 min。脫水處理后的樣品用冷凍干燥機干燥，在真空下噴金后進行掃描電鏡觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)單因素試驗結果，以凝膠強度和持水性為響應值，采取Box-Behnken設計并結合響應面分析，獲得最佳工藝條件，并用Design-Expert 8.5軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)表示為，并通過軟件SPSS 20.0進行顯著性檢驗，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 蟹肉比例對混合凝膠強度和持水性的影響

魚糜凝膠強度是指凝膠崩裂或斷裂時單位面積所受的力，反應凝膠內部結構的堅實程度[24]；破斷力可以反映出凝膠的硬度，破斷力越大，凝膠硬度越高；破斷距離可以反映出凝膠的彈性，破斷距離越大，彈性越大。由圖1可知，隨著蟹肉比例的提高，破斷力、破斷距離以及凝膠強度均呈下降趨勢，其中，對照組（不添加蟹肉）與蟹肉比例5%兩組間的3 個指標差異均不顯著（P＞0.05），蟹肉比例5%、10%、15%之間凝膠強度與破斷距離差異不顯著（P＞0.05）。由于蟹肉中含有較多的肌漿蛋白、脂質等雜質，會影響肌原纖維蛋白的交聯(lián)，因此添加蟹肉對白鰱魚糜凝膠強度的提升呈負效應[25]。而對于持水性而言，添加蟹肉可以略微提高白鰱魚糜的持水性。如圖2所示，隨著蟹肉比例從0%提高到25%，魚糜持水性從72.30%提升到78.74%，但是除對照組與蟹肉比例25%兩組之間差異顯著外（P＜0.05），其他各組之間并無顯著性差異；且當蟹肉比例繼續(xù)提高時，持水性同樣呈下降趨勢（蟹肉比例增加到30%、40%、50%時，持水性分別下降到77.31%、73.65%、69.60%）。Li Qingzheng等[26]的研究表明，添加TG后，豬肉與白鰱魚肉按照7∶3添加時凝膠特性最好，說明不同肉類蛋白在混合體系中可能會出現(xiàn)交互作用，從而提升混合肉類的品質。這種不同肉類蛋白間的交互作用，可能是導致添加少量蟹肉后持水性上升的原因。綜上，添加蟹肉會降低魚糜凝膠強度，但在添加量較少時，對于其持水性有一定的提升作用。

圖1 蟹肉比例對魚糜與蟹肉混合凝膠強度的影響Fig. 1 Effect of crab meat proportion on gel strength of surimi/crab meat mixed gel

圖2 蟹肉比例對魚糜與蟹肉混合凝膠持水性的影響Fig. 2 Effect of crabmeat proportion on WHC of surimi/crab meat mixed gel

2.1.2 凝膠化溫度對混合凝膠強度、持水性的影響

圖3 凝膠化溫度對魚糜與蟹肉混合凝膠強度的影響Fig. 3 Effect of gelation temperature on gel strength of surimi/crab meat mixed gel

圖4 凝膠化溫度對魚糜與蟹肉混合凝膠持水性的影響Fig. 4 Effect of gelation temperature on WHC of surimi/crab meat mixed gel

由圖3可知，隨著凝膠化溫度的升高，凝膠強度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當凝膠化溫度為40 ℃時，無論是破斷距離、破斷力，還是凝膠強度，均達到最大值，且與35 ℃和45 ℃相比差異顯著（P＜0.05）。嚴菁[27]的研究表明，鰱魚魚糜的最適凝膠化溫度為37 ℃，本研究進一步表明，當鰱魚魚糜與少量蟹肉混合時，其最適凝膠化溫度仍在37 ℃附近，并無明顯變化。白鰱魚糜較適宜的凝膠化溫度為35～40 ℃，但當溫度升高至50～70 ℃時，內源性蛋白酶被激活，魚糜凝膠開始劣化，已經形成穩(wěn)定有序的三維網狀結構崩解，導致凝膠強度減弱，持水性降低[5]。由圖4可知，凝膠化溫度為35、40、45 ℃三組的凝膠持水性均較高，且差異不顯著（P＞0.05），但隨著溫度繼續(xù)升高時，魚糜凝膠進入凝膠劣化溫度區(qū)間，導致持水性呈急劇下降趨勢（P＜0.05）。

2.1.3 凝膠化時間對混合凝膠強度、持水性的影響

圖5 凝膠化時間對魚糜與蟹肉混合凝膠強度的影響Fig. 5 Effect of gelation time on gel strength of surimi/crab meat mixed gel

由圖5可知，隨著凝膠化時間的長，凝膠強度、破斷力及破斷距離均呈先增加后降低的趨勢，且在2.5 h時達到最大值，此時凝膠強度為547.62 g·cm、破斷力為599.54 g、破斷距離為0.91 cm，但是1.5、2.0、2.5 h三組之間并無顯著性差異（P＞0.05）。嚴菁等[28]的研究表明，添加10 U/g TGase的鰱魚魚糜，凝膠化時間為2.0 h時凝膠強度最高，為544.15 g·cm。本研究結果表明，蟹肉與魚肉肌原纖維蛋白之間可能需要更長的時間完成交聯(lián)。由圖6可知，添加10%蟹肉后，凝膠化時間為2.0 h時持水性最大，但是不同組之間并無顯著性差異（P＞0.05），這說明凝膠化時間對持水性并無顯著性影響。

圖6 凝膠化時間對魚糜與蟹肉混合凝膠持水性的影響Fig. 6 Effect of gelation time on WHC of surimi/crab meat mixed gel

2.2 響應面優(yōu)化分析

2.2.1 回歸模型的建立

在單因素試驗的基礎上，選擇凝膠化溫度、凝膠化時間和蟹肉比例作為考察因素，采用3因素3水平的試驗方法，根據(jù)Box-Behnken設計原理，選擇持水性和凝膠強度作為響應值，進行響應面分析，結果見表1。

表1 響應面試驗設計及結果Table 1 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 凝膠強度顯著性檢驗和方差分析

通過Design-Expert數(shù)據(jù)分析軟件對表1數(shù)據(jù)進行處理，得到凝膠強度（R1）對凝膠化溫度（A）、凝膠化時間（B）、蟹肉比例（C）的多元回歸方程：

凝膠強度R1=-3 685.75＋213.29A＋356.62B＋13.73C-6.80AB-0.11AC＋7.72BC-2.82A2-32.45B2-1.67C2

由表2可知，該模型P=0.000 3＜0.01，表明模型極顯著；失擬項P=0.216 9＞0.05，表明失擬不顯著；回歸模型決定系數(shù)R2=0.987 1，表明上述方程的擬合性較好；變異系數(shù)5.94%＜10%，表明該回歸模型具備重復實驗的穩(wěn)定性。表2表明，A、C、A2、C2回歸系數(shù)顯著（P＜0.05），說明凝膠化溫度與蟹肉比例對凝膠強度影響顯著，尤其是凝膠化溫度影響極顯著（P＜0.01），而A、B、C之間的交互作用并不顯著（P＞0.05）。3 個因素對凝膠強度影響的次序為凝膠化溫度＞蟹肉比例＞凝膠化時間。

表2 凝膠強度的顯著性檢驗和方差分析Table 2 Significance test and analysis of variance of the effect of various factors on gel strength

2.2.3 凝膠持水性顯著性檢驗和方差分析

表3 持水性的顯著性檢驗和方差分析Table 3 Significance test and analysis of variance of the effect of various factors on WHC

通過Design-Expert數(shù)據(jù)分析軟件對表1數(shù)據(jù)進行處理，得到持水性（R2）關于凝膠化溫度（A）、凝膠化時間（B）、蟹肉比例（C）3 個因素的多元回歸方程：持水性R2=-98.40＋9.41A＋7.32B-0.84C-0.59AB＋0.02AC＋0.04BC-0.11A2＋2.89B2-0.005C2

由表3可知，該模型P=0.001，表明模型顯著；失擬項P=0.822 9＞0.05，表明失擬不顯著（P＞0.05）；回歸模型決定系數(shù)R2=0.979 8，表明上述方程的擬合性較好；變異系數(shù)CV=1.29%＜10%，表明該回歸模型具備重復實驗的穩(wěn)定性。表3表明，A、AB、A2對凝膠強度有顯著性影響（P＜0.05），尤其是凝膠化溫度對持水性影響極顯著P＜0.01，A、B之間的交互回歸系數(shù)顯著，說明凝膠化溫度與凝膠化時間之間存在一定的交互作用。3 個因素對持水性影響的次序為：凝膠化溫度＞凝膠化時間＞蟹肉比例。

2.2.4 響應面優(yōu)化方案

響應面分析最佳工藝條件為：蟹肉比例9.87%，凝膠化時間3.0 h，凝膠化溫度34.03 ℃。此工藝條件下，混合凝膠強度預測值為555.68 g·cm，持水性為78.45%。

2.3 驗證實驗

2.3.1 不同工藝處理后的混合凝膠特性

傳統(tǒng)魚腸的凝膠形成工藝參數(shù)通常設定為：一段水浴（40 ℃）1.0 h，二段水?。?0 ℃）30 min，不添加TG和蟹肉；而本研究得到的優(yōu)化混合腸工藝（在響應面優(yōu)化方案結果的基礎上進行了適當調整）參數(shù)為：一段水浴（35 ℃）3.0 h，二段水?。?0 ℃）30 min，添加0.3% TG和10%蟹肉；同時，設置一組優(yōu)化對照試驗，其參數(shù)設定為：一段水?。?5℃）3.0 h，二段水?。?0 ℃）30 min，添加10%蟹肉，不添加TG。

表4 混合凝膠特性驗證試驗結果Table 4 Comparison of gel properties of surimi/crab meat mixed gels with and without TG and traditional fish sausage

表4表明，與傳統(tǒng)魚腸相比，優(yōu)化后的魚糜與蟹肉混合腸（加TG），其凝膠強度有顯著的提升（P＜0.05），持水性略有降低，但并不顯著（P＞0.05）；與優(yōu)化對照（無TG）相比，添加TG后，不僅魚糜與蟹肉混合腸的凝膠強度得到顯著提升（P＜0.05），而且持水性也略有增加（P＞0.05），這充分表明添加TG可以改善魚糜與蟹肉混合腸的凝膠特性。

2.3.2 不同工藝處理后混合凝膠的SDS-PAGE分析

圖7 魚糜蟹肉混合凝膠SDS-PAGE圖Fig. 7 SDS-PAGE analysis of protein patterns of surimi/crab meat mixed gels and traditional fish sausage

由圖7可知，在3 種工藝條件下，肌動蛋白電泳條帶幾乎相同，表明凝膠化時間的改變、蟹肉以及TG的添加并不改變肌動蛋白的含量。魚糜凝膠形成過程中，肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）通過非二硫共價鍵（主要為ε-(γ-Glu)-Lys）相互交聯(lián)形成MHC聚集體，由于其分子質量過大，在電泳時難以通過濃縮膠進入分離膠，導致MHC帶的減少。因此，電泳帶中MHC的含量可以反映出凝膠形成過程中非二硫共價鍵的含量，MHC殘留越少，非二硫共價鍵形成的越多。3 個電泳帶中，MHC依次增加，優(yōu)化混合腸與優(yōu)化對照組相比，前者的MHC含量較少，而肌動蛋白含量幾乎無差異，表明蟹肉與魚糜中的MHC才是TG作用的主要底物而非肌動蛋白，該作用過程中TG通過促進非二硫共價鍵的形成，產生了更多的MHC聚集體，構成凝膠骨架，從而形成更為致密、緊固的凝膠結構，這與Chanarat等[29-30]的研究結果相一致。

2.3.3 不同工藝處理下混合凝膠掃描電鏡結果

圖8 魚糜蟹肉混合凝膠掃描電鏡圖Fig. 8 Scanning electron microscopic images of surimi/crab meat mixed gels with and without TG and traditional fish sausage

由圖8可知，與未添加TG的優(yōu)化對照組相比，優(yōu)化混合腸的凝膠微觀結構相對致密、平滑，其表面間隙減小，這是因為在TG作用下，蟹肉與魚糜形成更多的MHC聚集體，蛋白排列更為緊密，Chanarat等[30]在研究微生物谷氨酰胺轉氨酶對印度鯖魚（Rastrelliger kanagurta）分離蛋白凝膠特性的影響時也觀察到類似現(xiàn)象。但是與傳統(tǒng)魚腸相比，優(yōu)化混合腸微觀結構略顯松散，其原因可能與蟹肉中殘留的水解酶、脂類等有關，這些殘留物會對魚糜和蟹肉混合腸的凝膠性能造成一定影響[25]。此外，這也可能與對魚糜和蟹肉混合腸的凝膠化時間較傳統(tǒng)魚腸更長有關（圖5），即兩種不同肉類蛋白之間難以在短時間內完成充分交聯(lián)。目前，這兩種不同肉類蛋白之間的相互作用情況及機制尚未完全研究清楚。

3 結 論

在單因素試驗結果的基礎上，采取Box-Behnken設計并結合響應面分析確定最佳方案為蟹肉比例10%、凝膠化時間3.0 h、凝膠化溫度35 ℃。驗證實驗表明，優(yōu)化后的魚糜與蟹肉混合腸比傳統(tǒng)魚腸具有更高的凝膠強度；SDS-PAGE結果表明，添加TG的優(yōu)化方案組，其MHC帶明顯減少，而肌動蛋白帶幾乎無差別，這表明TG的主要作用底物為MHC，使之形成MHC聚合體從而增強凝膠骨架的穩(wěn)定性。掃描電鏡結果表明，添加TG使得蟹肉與白鰱魚糜混合凝膠表面更均勻、致密。但是有關魚糜與蟹肉蛋白之間的相互作用、蟹肉對混合凝膠化學作用力的影響、以及對凝膠蛋白分子結構的影響還有待今后進一步研究。