王大慧，巨曉敏，衛(wèi)功元*

（蘇州大學基礎醫(yī)學與生物科學學院，江蘇 蘇州 215123）

普魯蘭是一種由麥芽三糖經α-1,6-糖苷鍵聚合而成的微生物多糖，通常由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）合成并分泌到胞外[1]。作為一種化學結構獨特的水溶性高分子物質，普魯蘭具有良好的可塑性、成膜性和穩(wěn)定性，因而可以安全地應用于食品、醫(yī)藥、環(huán)保和輕工等諸多領域[2-4]。2002年，普魯蘭被美國食品藥品監(jiān)督管理局認證為GRAS（Generally Regarded As Safe）的微生物多糖[5]。2006年5月19日，國家衛(wèi)生部發(fā)布第8號公告，將普魯蘭列為新增的4種食品添加劑之一。此后，普魯蘭在市場上的需求量日益增長。

目前，普魯蘭的生物合成主要采用發(fā)酵法[1,6]。為提高普魯蘭的產量以及合成效率，科研人員分別從培養(yǎng)基設計、發(fā)酵條件控制、關鍵酶活性提升以及跨膜運輸等角度對普魯蘭的合成過程進行研究，確定了一些關鍵的影響因素[7-9]。其中，表面活性劑的添加對于促進普魯蘭的合成具有明顯的積極作用[10]。常天俊等[11]考察了吐溫40、吐溫60和吐溫80在普魯蘭發(fā)酵生產中的作用，結果發(fā)現(xiàn)3 種表面活性劑均能促進細胞分泌多糖，添加0.05%吐溫80時效果最好，不僅能提高約25%普魯蘭產量，而且還可以將發(fā)酵時間縮短近2 d。Sheng Long等[12-13]發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.5%（體積分數）吐溫80可以顯著提高普魯蘭的產量，認為吐溫80加速了細胞對營養(yǎng)物質的攝取，增加了葡萄糖基轉移酶活性，提高了細胞膜脂肪酸的含量，加速了普魯蘭向胞外分泌。Tu Guangwei等[14]在培養(yǎng)基中添加0.05%（體積分數）吐溫80，將聚蘋果酸和普魯蘭的產量分別提高了75.08%和27.21%，認為吐溫80提高了氧氣攝取速率和CO2釋放速率，上調了相關跨膜轉運因子的轉錄水平，最終提高了聯(lián)產發(fā)酵的產量。除此之外，鮮見其他表面活性劑影響普魯蘭生物合成的報道。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)普魯蘭還可以利用全細胞生物轉化的方法合成得到[15]。在生物轉化過程中，普魯蘭合成代謝途徑中的3 個關鍵酶α-磷酸葡萄糖異構酶（α-phosphoglucose mutase，PGM）、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphorylase，UGP）和葡萄糖基轉移酶（glucosyltransferase，F(xiàn)KS），能量物質ATP的供給與消耗速率，以及細胞膜的通透性都是決定普魯蘭能否高效合成的影響因素[16]。與調控細胞內物質和能量代謝過程的復雜性不同，增加微生物細胞膜通透性可以通過添加表面活性劑得以實現(xiàn)[17]。然而，表面活性劑對生物轉化合成普魯蘭是否具有促進作用以及其中蘊含的生理生化機制至今不得而知。為此，本研究分析食品工業(yè)的非離子型表面活性劑斯潘和吐溫對生物轉化合成普魯蘭的影響，并從細胞特性、關鍵酶活性、胞內物質和能量代謝等角度解析表面活性劑的作用機制，研究結果將為進一步提高普魯蘭生物合成效率提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

出芽短梗霉CCTCC M 2012259，由蘇州大學微生物生理與代謝調控研究室保藏。

種子培養(yǎng)基：采用PDA培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH值。

發(fā)酵培養(yǎng)基[15]：葡萄糖63.97 g/L，酵母粉3.57 g/L，(NH4)2SO40.6 g/L，NaCl 1.0 g/L，K2HPO45.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.18 g/L，pH 6.5。

轉化液：葡萄糖50 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 6.8。

磷酸葡萄糖變位酶聯(lián)免疫分析測試盒 上海皓塵生物科技有限公司；尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶聯(lián)免疫分析測試盒 上海將來實業(yè)股份有限公司。

1.2 儀器與設備

1525型高效液相色譜儀 美國Waters公司；BIOTECH-5BGZ攪拌式發(fā)酵罐 上海保興生物設備工程有限公司；HZ-2010K恒溫搖瓶柜 太倉市華利達實驗儀器設備有限公司；J6-MI型冷凍離心機 美國Beckeman公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 靜息細胞制備

將在-70 ℃超低溫冰箱中保藏的菌種（1 mL）接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于30 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)24 h獲得種子。按10%（體積分數）的接種量將種子接入裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，在30 ℃、400 r/min和通氣量3 L/min條件下培養(yǎng)36 h。將發(fā)酵液12 000 r/min離心10 min，用無菌生理鹽水洗滌2 次后制得靜息細胞。

1.3.2 生物轉化

將靜息細胞均勻懸浮于裝有50 mL轉化液的500 mL三角瓶中，置于30 ℃、200 r/min搖床中轉化24 h或48 h，初始菌體控制在10 g/L左右（按干細胞質量計）。將無任何表面活性劑添加的生物轉化過程定義為空白對照。

1.3.3 細胞干質量與普魯蘭產量測定

取20 mL轉化液（或發(fā)酵液），80 ℃水浴滅活15 min，冷卻至室溫后12 000 r/min離心10 min。細胞沉淀用蒸餾水洗滌3 次，離心后于70 ℃烘干至質量恒定，計算得到細胞干質量；取10 mL上清液，加入2 倍體積無水乙醇混勻，4 ℃處理12 h，12 000 r/min離心10 min，將沉淀于70 ℃烘干至質量恒定，計算得到普魯蘭產量。

1.3.4 普魯蘭合成能力的計算

細胞轉化合成普魯蘭能力的計算方法參見文獻[15]。生物轉化反應24 h，取樣檢測普魯蘭質量濃度。將1 g靜息細胞（干質量）在1 h內轉化葡萄糖合成的普魯蘭質量定義為1 個普魯蘭合成能力，單位為mg/（g·h）。

1.3.5 細胞存活率的測定

分別取培養(yǎng)24 h和48 h的轉化液，用無菌水稀釋至10-5倍，取100 μL在含有PDA培養(yǎng)基的平板上進行涂布，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，計數并計算細胞存活率。

1.3.6 無細胞提取物的制備

取5 mL轉化液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，生理鹽水洗滌2 次后，將濕細胞重新懸浮在5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.0）中，超聲破碎10 min（破碎10 s，間隔10 s），4 ℃、12 000 r/min離心20 min，得到的上清液即為無細胞提取物，用于測定胞內物質含量和關鍵酶活性。

1.3.7 酶活性測定

FKS活性測定方法參見文獻[18]。將0.2 mL含有10 mmol 4-硝基-α-D-吡啶葡萄糖苷的乙酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 4.0）與0.2 mL待測酶液快速混合均勻，在40 ℃水浴中反應5 min，隨后加入3 mL甘氨酸-NaOH緩沖液（0.4 mol/L，pH 10.5）終止反應。測定405 nm波長處的吸光度，由標準曲線計算產生的4-硝基酚含量。一個FKS活性單位定義為每分鐘釋放1 μmol 4-硝基酚所需要的酶量。

PGM活性：采用磷酸葡萄糖變位酶聯(lián)免疫分析測試盒進行測定；UGP活性：采用尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶聯(lián)免疫分析測試盒進行測定，操作步驟參照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.3.8 細胞膜通透性測定

采用流式細胞儀進行檢測[19-20]。將離心收集的細胞重懸于0.1 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.0）中，細胞密度控制在約106個/mL。將100 μL細胞懸浮物與1 μL 2.5 mg/L碘化丙啶（propidium iodide，PI）混合，37 ℃避光孵育50 min，加入900 μL磷酸緩沖溶液混勻。利用流式細胞儀檢測含有熒光探針的細胞數，激發(fā)光波長488 nm，發(fā)射光波長625 nm。細胞流速為500 個/s，計數10 000 個細胞，計算PI攝取率。

1.3.9 胞內尿苷二磷酸葡萄糖測定

胞內尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate g l u c o s e，U D P G）利用高效液相色譜法進行檢測[21]。Sigma-Aldrich Supelcosil LC-18-DB柱（4.6 mm×250 mm），流動相為40 mmol/L三乙胺-乙酸溶液（pH 6.0），流速1 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫22 ℃，進樣量10 μL。

1.3.10 胞內ATP和ADP測定

利用高效液相色譜法進行檢測[21]。Waters 1525反相SunFire C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為0.01 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 6.5），流速1 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫35 ℃，進樣量10 μL。

1.4 數據統(tǒng)計

所有實驗數據均為3 組平行樣品檢測結果的平均值。Excel 2010軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 斯潘對生物轉化合成普魯蘭的影響

向轉化液中分別添加不同質量濃度的斯潘20、斯潘40、斯潘60和斯潘80，研究斯潘在生物轉化合成普魯蘭中的作用。由圖1可以看出，在考察的質量濃度范圍內（0～20 g/L），斯潘20對細胞的普魯蘭合成能力幾乎沒有影響。斯潘40和斯潘60的添加降低了細胞合成普魯蘭的能力，且添加質量濃度越高，普魯蘭合成能力降低的幅度越大。斯潘80可以提高普魯蘭的合成能力，當添加質量濃度為20 g/L時，普魯蘭的合成能力提高了46.5%。因此，在底物充足供給的前提下，斯潘80可以顯著提高普魯蘭的生物合成效率。

圖1 斯潘對生物轉化合成普魯蘭的影響Fig. 1 Effect of Span on pullulan production

2.2 吐溫對生物轉化合成普魯蘭的影響

圖2 吐溫對生物轉化合成魯蘭的影響Fig. 2 Effect of Tween on pullulan production

向轉化液中添加不同質量濃度的吐溫20、吐溫40、吐溫60和吐溫80，研究吐溫在生物轉化合成普魯蘭中的作用，結果見圖2。與對照相比，吐溫20和吐溫40的添加降低了細胞的普魯蘭合成能力；吐溫60對生物轉化的影響不顯著；而吐溫80則顯著提高了細胞的普魯蘭合成能力。當吐溫80質量濃度為5 g/L時，細胞合成普魯蘭的能力比對照提高了32.9%。同樣地，當底物供給充足時，吐溫80也可以明顯提高普魯蘭生物合成的效率。

2.3 斯潘80和吐溫80復配在生物轉化合成普魯蘭中的作用

斯潘80和吐溫80的分子結構中都含有失水山梨醇單油酸酯，彼此的碳氫分子鏈之間能夠很好地相互吸引，二者復合使用時還可以增加體系的穩(wěn)定性[22]。為此，將20 g/L斯潘80和5 g/L吐溫80進行復配，考察其在生物轉化合成普魯蘭中的作用。為便于比較，將斯潘80和吐溫80單獨添加后的普魯蘭產量（24 h和48 h）一并列出，結果見圖3。與空白對照相比，無論是單獨添加還是復配使用，斯潘80和吐溫80均提高了普魯蘭產量。斯潘80和吐溫80復配使用的效果最好，但是并未顯示出累加效應。

圖3 斯潘80和吐溫80復配對生物轉化合成普魯蘭的影響Fig. 3 Separate and combined effect of Span 80 and Tween 80 on pullulan production

2.4 表面活性劑提高生物轉化合成普魯蘭效率的作用機制

2.4.1 細胞存活率

部分表面活性劑與微生物長期接觸會影響細胞生長，甚至會溶解細胞膜的部分成分而實現(xiàn)殺菌作用[23]。為考察20 g/L斯潘80、5 g/L吐溫80及其復配對細胞存活率的影響，采用涂布平板的方法，對參與轉化反應24 h和48 h后的細胞進行培養(yǎng)并計數統(tǒng)計，結果見表1。與生物轉化反應起始時的細胞總數（2.15×108個/mL）相比，單獨添加斯潘80時的活細胞數略有減少；單獨添加吐溫80以及復配對活細胞數影響不大?？傮w上，斯潘80和吐溫80對細胞存活率沒有顯著影響。

表1 表面活性劑對細胞存活率的影響Table 1 Effect of surfactants on survival rate of cells

2.4.2 細胞膜通透性

在普魯蘭的生物合成過程中，麥芽三糖單體首先在胞內合成，然后跨過細胞膜分泌到胞外并聚合成普魯蘭[1,24]，所以，細胞膜通透性的大小將影響到普魯蘭合成速率的高低。采用流式細胞儀對細胞通透性進行測定，以PI攝取率定量表示細胞通透性的大小，結果見圖4。與對照相比，吐溫80對PI攝取率的影響很小，而斯潘80則大幅度地提高了PI攝取率（4～5 倍）；復配條件下的PI攝取率與單獨添加斯潘80的結果相近。由此可見，斯潘80極大地提高了細胞膜的通透性，但斯潘80和吐溫80的作用沒有累加性。

圖4 表面活性劑對細胞PI攝取率的影響Fig. 4 Effect of surfactants on PI uptake of cells

2.4.3 普魯蘭合成關鍵酶活性分析

研究表明，吐溫80在普魯蘭分批發(fā)酵過程中會提高FKS活性水平[12]。本研究考察斯潘80和吐溫80對普魯蘭生物合成途徑中3 種關鍵酶（PGM、UGP和FKS）活性的影響，結果見圖5?？梢园l(fā)現(xiàn)，在轉化反應第24小時，除吐溫80對FKS活性沒有顯著影響外，其他添加條件下的PGM、UGP和FKS活性均明顯高于對照。在第48小時，斯潘80單獨添加仍然能提高PGM、UGP和FKS的活性，吐溫80對3 種關鍵酶活性均無影響，復配物僅可以提高FKS活性。此外，由圖5還可以看出，在轉化反應的前期（24 h），PGM和UGP具有更高的活性；而在轉化后期（48 h），F(xiàn)KS活性更高。以上酶活結果表明，在生物轉化合成普魯蘭的過程中，斯潘80對關鍵酶活性的提高均具有積極作用，而吐溫80僅在轉化前期提高了PGM和UGP的活性。

圖5 表面活性劑對普魯蘭合成關鍵酶活性的影響Fig. 5 Effect of surfactants on activities of key enzymes involved in pullulan biosynthesis

2.4.4 胞內UDPG水平

作為普魯蘭生物合成的最重要的前體物質之一，胞內UDPG水平是事關普魯蘭能否高效合成的關鍵因素[1,21]。在生物轉化的24 h和48 h，不同表面活性劑添加方式下的胞內UDPG含量見圖6?？梢园l(fā)現(xiàn)，在底物充足的情況下，普魯蘭快速合成時（第24小時）的胞內UDPG水平比第48小時的高。與對照相比，斯潘80和吐溫80分別將第24小時胞內UDPG含量提高了40.7%和102.4%。至第48小時，由于底物葡萄糖基本耗盡（數據未給出），胞內UDPG含量均下降至較低的水平（約1.2 mg/g）。

圖6 表面活性劑對胞內UDPG水平的影響Fig. 6 Effect of surfactants on intracellular UDPG level

2.4.5 胞內能量代謝物質水平及比率

普魯蘭的生物合成離不開能量物質的充足供給[16]。測定不同表面活性劑添加條件下的胞內能量物質ATP和ADP含量，計算ATP/ADP比率，結果見圖7。在第24小時，斯潘80和吐溫80均可以提高胞內ATP含量和ATP/ADP比率，體現(xiàn)出比對照具有更強的ATP再生能力，最終胞內有充足的ATP供給用于普魯蘭的快速合成。特別地，吐溫80在提高胞內ATP含量和再生方面發(fā)揮著更為重要的作用。至第48小時，斯潘80和吐溫80雖然仍能將胞內ATP維持在較高的水平，但ATP的再生能力均低于對照。

圖7 表面活性劑對胞內ATP水平和ATP/ADP比率的影響Fig. 7 Effect of surfactants on intracellular ATP level and ATP/ADP ratio

3 討 論

表面活性劑素有“工業(yè)味精”的美稱，是一類用途廣泛的精細化工產品，在食品、藥品以及化妝品制造等領域中均有廣泛應用[25]。在微生物發(fā)酵領域，表面活性劑可以通過增大細胞膜的通透性、改變酶活性調控細胞的生長和產物合成[26-29]。作為非離子型表面活性劑，斯潘和吐溫常以乳化劑的形式應用于食品加工中[30]。已有文獻報道表明，吐溫80在普魯蘭發(fā)酵生產中對于提高目標產物的產量起到了積極作用[11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，20 g/L斯潘80和5 g/L吐溫80在全細胞生物轉化合成普魯蘭過程中提高了細胞合成普魯蘭的能力，同時，普魯蘭的合成效率均高于前人研究的結果[11-13]。為探究斯潘80和吐溫80提高普魯蘭合成效率的生理機制，分別從細胞特性、關鍵酶活性、物質與能量代謝等多個角度進行了探索。

在全細胞轉化過程中，將細胞始終保持在較高活性是實現(xiàn)高效轉化的基本保障，而部分表面活性劑（如Triton X-100）卻對細胞活性表現(xiàn)出一定的抑制作用[31]。本研究細胞存活率的結果表明，斯潘80和吐溫80對細胞活性幾乎沒有影響，可以確保不同轉化條件下的出芽短梗霉細胞均能維持正常的生理代謝。在此基礎上，斯潘80和吐溫80的添加提高了細胞膜的通透性，不僅有利于底物進入胞內與酶作用，還加速了胞內合成的普魯蘭跨膜向胞外分泌，進而提高了普魯蘭的合成效率。

根據出芽短梗霉合成普魯蘭的代謝途徑，底物葡萄糖首先在PGM和UGP的催化下合成前體物質UDPG，然后UDPG在FKS的作用下合成麥芽三糖單體物質，最終麥芽三糖在FKS的作用下跨膜聚合形成普魯蘭[1,18,32]。因此，提高PGM和UGP的活性有利于增加胞內UDPG的供給，而提高FKS的活性將加速UDPG的消耗，最終促進普魯蘭的合成。本研究普魯蘭合成關鍵酶活性和胞內UDPG水平的結果表明，斯潘80和吐溫80在普魯蘭合成期（24 h）均提高了PGM和UGP的活性，提升了胞內UDPG水平。特別地，斯潘80提高了FKS活性，加速了UDPG向普魯蘭的轉化。由于吐溫80更有利于胞內UDPG的供給，而斯潘80更有利于UDPG的消耗，因此在相同轉化時間下，添加斯潘80獲得的普魯蘭產量比添加吐溫80的結果要高，體現(xiàn)出更高的普魯蘭合成效率。

與此同時，能量物質ATP的供給與消耗速率也是影響普魯蘭生物合成效率的重要因素。胞內ATP含量體現(xiàn)ATP合成和利用的綜合結果，而ATP/ADP比率則反映ATP的再生能力[33]。本研究結果表明，吐溫80在提高胞內ATP含量和促進ATP再生方面比斯潘80有更好的效果，能將胞內ATP維持在較高的水平，從而為普魯蘭的快速合成提供充足的能量供給。

斯潘80和吐溫80有類似的分子結構，使得它們可以復配使用而增加效果[34]。本研究在單獨添加的基礎上，也考察了斯潘80和吐溫80復配在生物轉化合成普魯蘭中的作用，復配條件下的普魯蘭產量和合成效率只比單獨添加略高，沒有體現(xiàn)出累加效應。該結果可能與斯潘80和吐溫80復配比例不當有關，有待今后進一步研究。

綜上，本研究考察了多種表面活性劑在全細胞生物轉化合成普魯蘭中的作用，發(fā)現(xiàn)在轉化液中添加20 g/L斯潘80或/和5 g/L吐溫80均有利于普魯蘭合成效率的提高。在此基礎上，檢測了細胞存活率、細胞膜通透性、普魯蘭合成關鍵酶活性、胞內UDPG含量以及能量代謝物質水平和比率，部分解析了斯潘80和吐溫80提高普魯蘭合成效率的生理機制。研究結果為實現(xiàn)普魯蘭高產提供了一種可行的方法，同時也為其他類似結構微生物多糖的高效合成提供新的思路。