焦 敏，郭 卉，秦天潔，孫 紅，陳玉樂，張林琳

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西西安 710061；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710061)

前列腺癌是一類極易發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤[1]。上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中具有重要的作用[1]。前列腺癌ARCaPE細(xì)胞和ARCaPM細(xì)胞是一對經(jīng)典EMT模型，但其發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚[2]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)能在腫瘤細(xì)胞廣泛表達(dá)并可促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的EMT過程[3]。然而，TNF-α是否在ARCaP細(xì)胞模型中發(fā)揮作用尚不明確。在本研究中，我們初步探討了TNF-α在ARCaPE和ARCaPM的表達(dá)以及對ARCaP細(xì)胞EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與抗體逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購自寶生物(大連)有限責(zé)任公司。Fast200總RNA極速抽提試劑盒購自上海飛捷生物技術(shù)有限公司。Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640培養(yǎng)基購自Sigma公司。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Biological Industries公司。Millicell小室購自Millipore公司。重組人TNF-α蛋白購自R&D公司，將其溶解于無菌磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)中，使用時(shí)以0 mg/mL(對照)和20 mg/mL終濃度在無FBS條件下培養(yǎng)細(xì)胞。E-cadherin及β-actin抗體購自Abcam公司。基質(zhì)膠(matrigel)購自BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人前列腺癌ARCaPE和ARCaPM細(xì)胞由美國Cedars-Sinai Medical Center的CHUNG LWK教授饋贈，于含100 mL/L FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)箱條件為37 ℃、5% CO2(體積分?jǐn)?shù))。

1.3 定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)采用Fast200總RNA極速抽提試劑盒提取細(xì)胞總RNA，定量后按400 ng上樣量進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。定量逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物調(diào)整后濃度為0.2 g/L，按1 μL上樣量(即200 ng)以SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，引物序列如下。TNF-α上游:5′-CATGATCCGGGACGTGGAG′,下游：5′-CGATCACTCCAAAGTGCAGC-3′；β-actin上游：5′-CACTGTGCCCATCTACGAGG-3′，下游：5′-CCGTGGTGGTGAAGCTGTAG -3′。

1.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(Transwell)無FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基以1∶5的比例稀釋matrigel，以50 μL/孔鋪于millicell小室的上室，置于37℃培養(yǎng)箱4 h使其凝固。胰酶消化細(xì)胞中加入含100 mL/L FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化。PBS洗細(xì)胞3次以去除FBS。再以不含F(xiàn)BS的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)。向millicell小室的上室加入1×105個(gè)無FBS培養(yǎng)基懸浮的細(xì)胞。下室加入含100 mL/L FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基。隨后將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。取出millicell小室，用棉簽擦去上室的細(xì)胞。PBS洗小室3次后將下室細(xì)胞置于多聚甲醛固定液中固定10 min。再用PBS洗小室3次，隨后將下室置于1 mL/L結(jié)晶紫溶液染色5 min。PBS洗去殘留結(jié)晶紫后置于顯微鏡下觀察。取5個(gè)隨機(jī)視野(×200)計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)并以其平均數(shù)代表體外侵襲能力。

1.5 免疫印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn)蛋白提取及Western blot實(shí)驗(yàn)按照課題組所在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)步驟進(jìn)行[4]。E-cadherin及β-actin一抗分別按1∶1 000及1∶10 000進(jìn)行稀釋。免疫印跡結(jié)果通過電化學(xué)發(fā)光顯影系統(tǒng)顯影。

2 結(jié) 果

2.1 ARCaP前列腺癌EMT細(xì)胞模型的鑒定首先，我們通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較EMT相關(guān)標(biāo)記、蛋白標(biāo)記及細(xì)胞體外侵襲能力測定對ARCaP前列腺癌EMT細(xì)胞模型進(jìn)行了鑒定。在形態(tài)學(xué)方面，ARCaPE細(xì)胞呈鋪路石樣的類圓形，細(xì)胞間連接緊密，呈島嶼狀生長。ARCaPM細(xì)胞排列松散，部分細(xì)胞拉長呈紡錘形(圖1A)。Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與ARCaPE細(xì)胞相比，ARCaPM細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白E-cadherin明顯下調(diào)(圖1B)。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，每高倍視野下ARCaPE細(xì)胞的平均穿膜細(xì)胞數(shù)為(7.67±3.61)個(gè)，而ARCaPM細(xì)胞(30.67±4.63)個(gè)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1C、D)。以上結(jié)果表明ARCaPE細(xì)胞具有上皮細(xì)胞特性，而ARCaPM細(xì)胞具有間質(zhì)細(xì)胞特性。

2.2 TNF-α在ARCaPE和ARCaPM細(xì)胞的表達(dá)以及對EMT的影響為明確TNF-α在ARCaP前列腺癌EMT細(xì)胞模型中的作用，我們首先通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)比較了ARCaPE和ARCaPM細(xì)胞中TNF-α表達(dá)水平，結(jié)果顯示ARCaPM細(xì)胞TNF-α的mRNA表達(dá)水平比ARCaPE細(xì)胞高3.8倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2A)。隨后我們通過人TNF-α重組蛋白處理ARCaPE細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)處理72 h后細(xì)胞排列變得松散，細(xì)胞伸長呈紡錘形，提示發(fā)生EMT(圖2B)。接下來我們進(jìn)一步通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測E-cadherin表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TNF-α處理后E-cadherin表達(dá)明顯下調(diào)(圖2C)。體外侵襲實(shí)驗(yàn)表明，對照組及TNF-α處理組每高倍視野下平均穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(10.67±2.25)個(gè)和(33.67±8.07)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2D、E)。以上結(jié)果提示TNF-α可促進(jìn)ARCaP細(xì)胞發(fā)生EMT。

圖1 ARCaP前列腺癌EMT細(xì)胞模型的鑒定

A：ARCaPE與ARCaPM細(xì)胞的形態(tài)學(xué)比較；B：Western blot 實(shí)驗(yàn)比較ARCaPE與ARCaPM細(xì)胞E-cadherin表達(dá)水平，β-actin作為內(nèi)參照；C、D：Transwell實(shí)驗(yàn)比較ARCaPE與ARCaPM細(xì)胞體外侵襲能力，C為代表圖，D為柱狀圖，與ARCaPE組比較，*P<0.05。

圖2 TNF-α在ARCaPE和ARCaPM細(xì)胞的表達(dá)以及對EMT的影響

A：RT-PCR實(shí)驗(yàn)比較ARCaPE和ARCaPM細(xì)胞中TNF-α表達(dá)水平,與ARCaPE組比較，*P<0.05；B：TNF-α處理組與對照組ARCaPE細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較；C：Western blot實(shí)驗(yàn)檢測TNF-α處理組與對照組ARCaPE細(xì)胞E-cadherin表達(dá)水平；D、E：Transwell實(shí)驗(yàn)比較TNF-α處理組與對照組ARCaPE細(xì)胞體外侵襲能力，D為代表圖，E為統(tǒng)計(jì)圖，與ARCaPE組比較*P<0.05。

3 討 論

上世紀(jì)八十年代，HAY等[2]在觀察雞胚胎發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞可失去其上皮特性并獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，這是EMT概念的雛形。隨后的大量研究表明，EMT可發(fā)生于胚胎發(fā)育、傷口愈合、纖維化及腫瘤進(jìn)展等多種病理生理過程。EMT過程中，上皮性腫瘤細(xì)胞喪失極性及細(xì)胞間連接，并獲得間質(zhì)細(xì)胞的某些特性及較強(qiáng)的運(yùn)動能力，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)局部浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[5]。E-cadherin是介導(dǎo)上皮細(xì)胞間連接的重要蛋白之一，其丟失被認(rèn)為是EMT的重要標(biāo)志，并參與了多種腫瘤的進(jìn)展[6]。大量證據(jù)表明，EMT不僅可促進(jìn)前列腺癌的轉(zhuǎn)移，也參與了腫瘤干細(xì)胞表型與化療耐藥等過程[1]。E-cadherin與前列腺癌細(xì)胞的丟失及患者不良預(yù)后密切相關(guān)[7]。

人前列腺癌ARCaP細(xì)胞系由CHUNG LWK教授從1例轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的腹水中分離獲得，隨后他從ARCaP細(xì)胞得到兩個(gè)亞克隆ARCaPE和ARCaPM，并發(fā)現(xiàn)ARCaPE和ARCaPM分別具有上皮和間質(zhì)細(xì)胞特性，此后ARCaPE和ARCaPM成為前列腺癌EMT的經(jīng)典細(xì)胞模型[8]。本研究中，我們從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、標(biāo)志蛋白表達(dá)及體外侵襲能力三方面對ARCaP EMT細(xì)胞模型進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)與ARCaPE細(xì)胞相比，ARCaPM細(xì)胞排列松散，部分細(xì)胞拉長呈紡錘形，且E-cadherin表達(dá)丟失，但具有更高的體外侵襲能力，這與前人的研究一致，表明ARCaPE和ARCaPM細(xì)胞是一對成功的EMT細(xì)胞模型[8]。

EMT的發(fā)生受多種信號通路、轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子的調(diào)控[5]。轉(zhuǎn)錄因子snail、slug、twist、zeb1等被認(rèn)為是促進(jìn)EMT的經(jīng)典轉(zhuǎn)錄因子。而腫瘤微環(huán)境中的多種細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGFβ)、TNF-α也被認(rèn)為是引起EMT的重要原因。TNF-α是腫瘤壞死因子/腫瘤壞死因子受體細(xì)胞因子超家族成員，在炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要作用，也是EMT的經(jīng)典調(diào)控因子之一。研究表明，TNF-α可通過激活NF-κB信號通路上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子twist表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)EMT[3]。也有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可與TGFβ協(xié)同作用，通過激活TAK1誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT[9]。在接受雄激素阻斷治療的前列腺癌，高TNF-α水平表達(dá)往往預(yù)示著更快進(jìn)展到去勢抵抗性前列腺癌，以及更短的總生存期[10]。體外研究表明，TNF-α可通過AKT/GSK3β穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子snail，進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌PC-3細(xì)胞系EMT[11]。然而，關(guān)于TNF-α是否能調(diào)控ARCaP細(xì)胞EMT目前尚未見報(bào)道。在本研究中，我們通過RT-PCR比較了ARCaPE和ARCaPM細(xì)胞TNF-α表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ARCaPM細(xì)胞TNF-α表達(dá)水平明顯高于ARCaPE細(xì)胞。隨后我們通過重組人TNF-α蛋白處理ARCaPE細(xì)胞72 h，觀察到細(xì)胞排列松散、細(xì)胞形態(tài)拉長、E-cadherin表達(dá)下調(diào)，功能學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TNF-α處理72 h后ARCaPE細(xì)胞體外侵襲能力增強(qiáng)，表明ARCaPE細(xì)胞發(fā)生了EMT。

綜上所述，我們的研究初步證實(shí)TNF-α可誘導(dǎo)人前列腺癌ARCaP細(xì)胞EMT。后續(xù)研究尚需進(jìn)一步探討TNF-α引起ARCaP細(xì)胞EMT的詳細(xì)分子機(jī)制。