石玉蘭12，貴子豪1，郭冰冰1，徐高生1，莫中成

(1.南華大學衡陽醫(yī)學院應用解剖與生殖醫(yī)學研究所，南華大學 岳陽市婦幼保健院基礎與臨床協(xié)同研究生培養(yǎng)創(chuàng)新實踐基地，組織學與胚胎學教研室，湖南 衡陽 421001；2.邵陽學院附屬第二醫(yī)院兒科，湖南 邵陽 422000)

中樞性性早熟(central precocious puberty，CPP)是指女性在8歲前，男性在9歲前內(nèi)、外生殖器官提前快速發(fā)育，并出現(xiàn)第二性征的一種常見兒科內(nèi)分泌疾病。CPP發(fā)生的機制可能與下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis,HPGA)提前被激活有關。近年來，環(huán)指蛋白3(makorin ring finger protein 3,MKRN3)基因已被確定為CPP的易感基因，MKRN3基因缺失突變導致HPG軸過早激活。Bo Ram Yi研究了103名女孩和70名男孩MKRN3的多態(tài)性，確定其與男孩的性早熟有關，但與女孩無關[1]。Erina Suzuk等人對24名患者(22名日本患者和2名中國患者)的核苷酸取代進行分析，發(fā)現(xiàn)在19名日本患者中發(fā)現(xiàn)了DNA甲基化缺陷和拷貝數(shù)改變，但僅有一名女性發(fā)生MKRN3核苷酸取代[2]。同時，研究報告表明，MKRN3缺陷在亞洲人群中很少見，故推測這種罕見突變可能存在種族差異。本文將綜述MKRN3基因與中樞性性早熟之間關系。

1 MKRN3基因結構和功能

MKRN3 基因位于Prader-Willi綜合征關鍵區(qū)域的染色體15q11.2 上，僅有外顯子，不含內(nèi)含子，是一種母系印記基因。MKRN基因家族用特定的鋅指基序陣列編碼核糖核蛋白[3-4]。MKRN3 蛋白具有2個N末端C3H 鋅指模體，1個MKRN 特異性Cys-His 結構域，1個C3H4 RING 鋅指模體和1個C 末端C3H 鋅指模體[5](圖1)。該蛋白參與細胞信號轉導過程及蛋白質(zhì)的泛素化過程，但目前關于它的具體功能以及突變是如何導致中樞性性早熟的研究還不明確。

圖1 MKRN3蛋白三維結構模式圖[5]

2 MKRN3基因的突變

在MKRN3基因的研究中共發(fā)現(xiàn)了33個突變，其中14個是移碼突變，17個錯義突變和2個無義突變[6-7]。最近，劉璐等人在2個散發(fā)病例和5個家系病例中發(fā)現(xiàn)4種新的基因突變，分別為：c.1138G>A(p.Glu380Lys )、c.1420T>A (p.Leu474Met)、c.673C>G (p.Leu225Val)、c.1071C>G(p.Ile357Met)[5](詳見表二)Macedo D對健康和中樞性早熟女孩進行甲基質(zhì)譜分析，也發(fā)現(xiàn)在CPP患者啟動子區(qū)域的4個罕見突變4-nt deletion (c.-150_-147delTCAG;-38 to -41nt)，這些突變會使MKRN3啟動子活性顯著降低，并認為其是導致CPP[8]的重要原因。

表1 已證實的MKRN3基因突變

續(xù)表

突變位點氨基酸改變突變類型c.766-767delAp.Glu256Gly移碼突變c.637delCp.Arg213Gly移碼突變c. 1171-1172insAp.Tyr391 ?移碼突變c.441-44ldeJGp.Hisl48Thr移碼突變c.331G>Tp.Glull l ?移碼突變c.1095G>Tp.Arg365Ser錯義突變c.1018T>Gp.Cys340Gly錯義突變c.1249T>Ap.Phe4171Je錯義突變c.1260T>Gp.His420Gln錯義突變c.1188C>Ap.Ser396Arg錯義突變c.699G>Cp.Lys233Asn錯義突變c.677A>Cp.Gln226Pro錯義突變c.611T>Cp.Ile204Thr錯義突變c.298A>Tp.Ile100Phe錯義突變c.587G>Tp.Gly l 96V al錯義突變c.1034G>Ap.Arg345His錯義突變c.737A>Gp.Tyr246Cys錯義突變c.1118C>Tp.Pro373Leu錯義突變c.89C>Tp.Pro30Leu錯義突變c.982C>Tp.Arg328Cys錯義突變c.943A>Gp.Met 315Yal錯義突變c.935G>Ag.Gly312Asp錯義突變c.1071C>Gp.11e357Met錯義突變c.1138G>Ap.Glu380Lys錯義突變c. l420T>Ap.Leu474Met錯義突變c.673C>Gp.Leu225Val錯義突變E298?p.Glu298Ter無義突變c.841C>Tp.Gln281?無義突變

3 MKRN3基因突變與性別的關系

有研究發(fā)現(xiàn)，女孩的CPP發(fā)病率高于男孩[9-11]，但最近Lee HS等人報道韓國女孩中樞性性早熟的MKRN3突變率較低[12]。與先前報道的女性數(shù)據(jù)相比，男性中MKRN3突變的頻率較高[13]。然而，當僅考慮CPP患者時，男性患者(17.6%)中MKRN3突變的患病率高于女性患者(5.0%)(P=0.05)[14]。女孩的青春期年齡比男孩小，但男孩的發(fā)病率較高[14]，有可能表明兒童期GnRH的抑制作用弱于女孩，使女孩對青春期發(fā)病的紊亂更敏感。MKRN3基因在小鼠下丘腦弓狀核中的表達沒有性別差異，這表明在青春期前，MKRN3在兩性中都有抑制作用[15-16]，但不排除有性別特異性作用的可能。

4 MKRN3基因?qū)η啻浩跁r間的影響

4.1 MKRN3基因和LIN28B可能協(xié)同調(diào)節(jié)青春期的時間而影響性早熟

目前發(fā)現(xiàn)MKRN3與青春期定時相關基因編碼的20種蛋白質(zhì)相互作用，其中LIN28B是研究最成熟的青春期相關基因之一[17-18]。LIN28B與月經(jīng)初潮年齡、成年身高和兒童期生長有關[19-20]，并且現(xiàn)已知該基因是let-7 microRNA的負調(diào)節(jié)因子[21]，其調(diào)節(jié)青春期時間的機制尚不清楚[22-24]。在大鼠和非人類靈長類動物中，在青春期時LIN28B的表達在下丘腦中下降[25]，并且在小鼠中，LIN28B和MKRN3的表達在青春期前降低[26-27]。

然而，Yi等分析了LIN28B中的兩個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)(rs314276和rs314280)，發(fā)現(xiàn)它們與男孩和女孩的性早熟均沒有明顯的相關性[1]。但對患者進行基因檢測發(fā)現(xiàn)rs314280和rs314276與性早熟顯著相關[28-29]，不過這種相關性并不能在SNPs中顯示出來[30-31]，推測造成這一結果的原因可能是樣本數(shù)較少或存在種族差異。

以小鼠為研究對象，通過過表達LIN28B對LIN28-Let-7途徑進行遺傳修飾可增加小鼠體重并延緩青春期的開始[32]，但LIN28B對于人類青春期時間的調(diào)控方式仍待進一步研究。Venkatram Yellapragada通過質(zhì)譜分析(Mass spectrometry ，MS)發(fā)現(xiàn)人類LIN28B和MKRN3存在相互作用，并且推測它們很有可能協(xié)同調(diào)節(jié)青春期的時間[33]。

4.2 MKRN3基因不能通過抑制促性腺激素釋放激素而調(diào)節(jié)青春期時間

促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)是由下丘腦弓狀核分泌的一種十肽激素，由十種氨基酸組成。GnRH可與垂體促性腺激素細胞膜表面的GnRH受體(GnRHR)結合，形成配體-受體復合物進入細胞。垂體收到復合物刺激會周期性分泌促性腺激素如黃體生成素(luteinizing hormone，LH)，卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)。黃體生成素和卵泡刺激素會促進性腺分泌性激素，進而對骨骼，腎上腺皮質(zhì)，乳腺和甲狀腺的生長有重要作用。在嬰兒期，GnRH的分泌較活躍，但在兒童期停止，進入青春期后，脈沖式GnRH的分泌被重新激活導致促性腺激素的分泌增加，從而刺激性腺。而MKRN3可以抑制GnRH的分泌，而MKRN3的功能缺失性突變會導致其失去對于GnRH分泌的抑制作用，使兒童提前進入青春期。

Jeong發(fā)現(xiàn)一些CPP患者表現(xiàn)出較高的MKRN3水平，高水平的MKRN3抑制GnRH脈沖分泌通路，但并不直接抑制GnRH分泌[34]。相反，GnRH脈沖分泌增加也不能負反饋調(diào)節(jié)MKRN3的水平，這些結果表明，MKRN3不是調(diào)節(jié)GnRH分泌的唯一因子。Venkatram使用CRISPR /Cas9技術生成的兩個雙等位基因MKRN3 KO克隆細胞系(Del 1和Del 2)檢查了MKRN3對GNRH1表達的作用，并將這些細胞系分化成表達GNRH1的神經(jīng)元。結果顯示，Del 1和Del 2細胞系都可以成功地分化為表達GNRH1的神經(jīng)元，這表明MKRN3對于分化并不是必要的。有趣的是，Del 1和Del 2細胞系的GNRH1表達與對照組沒有差異，這表明MKRN3不直接改變GNRH1表達。雖然MKRN3在他們的模型中不影響GnRH神經(jīng)元分化或它們表達GNRH1的能力，但MKRN3可能通過其他機制調(diào)節(jié)GnRH神經(jīng)元功能。例如，GnRH神經(jīng)元活性的調(diào)節(jié)主要是通過下丘腦中的Kisspeptin和KNDy神經(jīng)元進行的，而MKRN3對這些神經(jīng)元的作用尚不清楚。不能排除其他MKRN補償Del 1和Del 2細胞系中MKRN3缺失的可能性。基于人類多能干細胞(human pluripotent stem cells ，hPSC)的疾病模型是模擬人類神經(jīng)元疾病的最接近的方法[35]，但并沒有關于MKRN3的小鼠模型的相關報道。總之，結果表明MKRN3并不是GnRH神經(jīng)元分化過程和人多能干細胞分化期間的GNRH1表達的必要因素。此外，GnRHa治療并不會改變女性CPP患者MKRN3水平[34]。

5 MKRN3基因可抑制Nptx1神經(jīng)元的活性影響性早熟

Nptx1是神經(jīng)元發(fā)育的重要分泌蛋白，雖然目前并沒有直接證據(jù)表明Nptx1在GnRH神經(jīng)元活動中發(fā)揮作用，但在研究中發(fā)現(xiàn)在GnRH神經(jīng)元的誘導下Nptx1是最早激活的細胞外信號之一[36]。MKRN3 基因編碼E3泛素-蛋白連接酶 makorin 3 (E3 ubiquitin-protein ligase makorin-3)，有研究發(fā)現(xiàn)Nptx1需要該酶進行泛素化修飾。

有研究結果表明，在青春期之前和青春期時，小鼠下丘腦MKRN3和Nptx1呈負相關，MKRN3可抑制Nptx1的活性。MKRN3通過Ring finger結構域與Nptx1相互作用，Ring finger結構域是E3泛素連接酶域，可抑制Nptx1表達。由于到目前為止從未報道過Nptx1的泛素化，有研究推測Nptx1作為一種分泌蛋白，不僅可以通過MKRN3進行泛素化，而且可以在青春期開始時和其他E3泛素連接酶進行泛素化修飾[36]。MKRN3在幼年期通過泛素化對Nptx1發(fā)揮抑制作用。當青春期開始時，MKRN3沉默，導致GnRH神經(jīng)元開始激活Nptx1等信號分子。

6 總結與展望

MKRN3因突變而功能喪失導致幼年期的對GnRH的抑制作用缺乏，進而導致CPP，但具體機制及其與其他青春期發(fā)病相關鋅指基因的相互作用尚不清楚[37]。高水平的MKRN3會抑制GnRH脈沖分泌通路，但并不直接抑制GnRH分泌，表明MKRN3不直接改變GNRH1表達，可能存在調(diào)節(jié)MKRN3和GnRH分泌的上游因子。此外，MKRN3還可以作用于神經(jīng)系統(tǒng)，通過抑制Nptx1 的活性而抑制神經(jīng)元發(fā)育，但其確切的機制仍有待進一步研究。鑒于MKRN3在兒童青春期中的作用，補償MKRN3可能是治療CPP的潛在方法，但具體療效及可能機制尚需要更深入的研究和考證。