周海艷1，李靜云2，殷松樓3

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院風(fēng)濕科，江蘇 徐州 223000；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬沭陽(yáng)醫(yī)院風(fēng)濕科,江蘇 徐州223600；3.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，江蘇 徐州223000)

結(jié)締組織病相關(guān)肺間質(zhì)病變主要由自身免疫異常所致[1]，病理過(guò)程為：炎性細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)，間質(zhì)細(xì)胞及胞外基質(zhì)成分在肺間質(zhì)大量沉積，損傷肺泡及毛細(xì)血管，肺間質(zhì)組織反復(fù)的修復(fù)及損傷導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)重塑，引發(fā)肺纖維化[2]。雖然對(duì)結(jié)締組織病相關(guān)肺間質(zhì)病變發(fā)病機(jī)制的認(rèn)知不斷深入，但間質(zhì)性肺疾病仍是臨床中的難治病，尚無(wú)特效療法[3]。相關(guān)研究顯示，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及多種細(xì)胞因子參與了肺間纖維化的病理過(guò)程[4]；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)是MMPs的特異性抑制劑，在基質(zhì)降解調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要平衡作用[5]；其中TIMP-1廣泛分布于體液及多個(gè)組織中，多種細(xì)胞因子均可誘導(dǎo)分泌，但TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4具有很強(qiáng)的特異性[6]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1是目前研究最廣泛的致纖維化細(xì)胞因子，可通過(guò)經(jīng)典TGF-β1/Smad3信號(hào)通路發(fā)揮促纖維化效應(yīng)[7]；Smad33與P300結(jié)合在TGF-β1/Smad3信號(hào)通路活化的重要步驟之一[8]。本研究分析了結(jié)締組織病相關(guān)肺間質(zhì)病變肺組織中TIMP-1表達(dá)水平，并進(jìn)一步探討TIMP-1與TGF-β1之間的關(guān)系，以及TIMP-1在結(jié)締組織病相關(guān)肺間質(zhì)病變中作用的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年10月至2018年10月間本院收治的結(jié)締組織病相關(guān)肺間質(zhì)病變患者74例為觀察組，均行CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢，其中男性16例，女性58例；年齡35～63歲，平均年齡(48.40±3.94)歲。另取40例無(wú)感染和吸煙史的肺癌患者遠(yuǎn)離癌癥病灶的正常肺組織為對(duì)照組，其中男性11例，女性29例；年齡38～65歲，平均年齡(50.21±5.80)歲。兩組患者性別、年齡間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)批準(zhǔn)，參檢患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于上海素爾生物科技有限公司；人重組TGF-β1細(xì)胞因子購(gòu)于美國(guó)PeproTech公司；鼠抗人TIMP-1單克隆抗體、兔抗人P300單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG購(gòu)于邁威(上海)生物科技有限公司；PCDNA3.1(+)/Smad3真核過(guò)表達(dá)載體由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司構(gòu)建合成。

1.3 方法

1.3.1 肺組織中TIMP-1表達(dá)的免疫熒光檢測(cè) 取兩組患者的新鮮肺組織放入EP管中，加入液氮，-80 ℃保存待用。切片前將切片機(jī)提前預(yù)冷，取出肺組織后用OCT冰凍切片包埋劑包埋，0.3 μm連續(xù)切片，丙酮固定后，-80 ℃保存待用。檢測(cè)前取出切片，磷酸緩沖液洗滌后，使用0.5%細(xì)胞通透劑室溫下反應(yīng)30 min，加入5%BSA封閉液室溫下靜置30 min，滴加鼠抗人TIMP-1單克隆抗體(1∶500)，4 ℃過(guò)夜，次日滴加HRP標(biāo)記的山羊抗鼠的IgG(1∶2 000)，室溫下避光反應(yīng)2 h，封片后在共聚焦熒光顯微鏡下觀察拍照，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度。

1.3.2 人肺成纖維細(xì)胞分離與培養(yǎng) 取對(duì)照組正常肺組織，放入75%乙醇溶液中浸泡3～4 s，轉(zhuǎn)入含磷酸緩沖液的平皿中，使用無(wú)菌手術(shù)剪剪成直徑為1 mm的正方體小塊，將組織塊轉(zhuǎn)入6孔板中，每孔放入5～6塊，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基至浸沒(méi)組織塊，放入37 ℃ 10%CO2培養(yǎng)箱，當(dāng)細(xì)胞從組織塊周?chē)莱鲂纬杉?xì)胞島時(shí)棄去組織塊；4～5天更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞完全覆蓋6孔板后進(jìn)行消化傳代，取第10～15代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 TGF-β1刺激后人肺成纖維細(xì)胞中TIMP-1 mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測(cè) 取第10～15代的人肺成纖維細(xì)胞，按6×105/孔的密切加入6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h，觀察細(xì)胞鋪滿80%以上培養(yǎng)孔板底后，加入含不同濃度TGF-β1(0、1、3、5、10、15 μg/L)的無(wú)胎牛血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；或加入10 μg/L TGF-β1的無(wú)胎牛血清DMEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng)0、12、24、48 h。Trizol法提取人肺成纖維細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。TIMP-1、GAPDH引物序列由上海啟因生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。TIMP-1上游5′-GTCACT TCCACCACTTC G-3′，下游5′-GTAGTCGGCACAGATAAGG-3′；內(nèi)參GAPDH上游5′-TCTGCCGTCCAGTCCAGGTG-3′，下游5′-TGTCGCTGTG GGTGAGGA GG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，延伸72 ℃ 20 s。擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，計(jì)算TIMP-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 TGF-β1刺激后人肺成纖維細(xì)胞中TIMP-1蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè) 人肺成纖維細(xì)胞鋪板、計(jì)數(shù)、TGF-β1刺激同RT-PCR實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞中加入全蛋白提取液，離心收集上清，BCA蛋白定量，收集目標(biāo)蛋白，行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF，5%脫脂奶粉封閉2 h，滴加鼠抗人TIMP-1單克隆抗體(1∶500)、鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶1 000),4 ℃過(guò)夜，次日滴加HRP標(biāo)記的山羊抗鼠的IgG(1∶2 000)，室溫靜置2 h，ECL顯色，暗室中顯影、采集圖像并分析各條帶灰度值。

1.3.5 Smad3過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞TIMP-1、P300 mRNA和蛋白檢測(cè) 取第10～15代的人肺成纖維細(xì)胞，分別使用PCDNA3.1(+)/Smad3真核過(guò)表達(dá)載體、空質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞。RT-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞中TIMP-1、P300 mRNA和蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，使用SPSS23.0分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TIMP-1在兩組肺組織中熒光表達(dá)比較

共聚焦熒光顯微鏡下觀察顯示，TIMP-1為綠色熒光表達(dá)于肺組織間質(zhì)，觀察組熒光強(qiáng)度為(6.95±0.80)A.U，明顯高于對(duì)照組的(1.82±0.37)A.U(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 共聚焦熒光顯微鏡觀察肺組織中TIMP-1熒光表達(dá)(n=6，200×)A：對(duì)照組；B：觀察組

2.2 不同濃度TGF-β1對(duì)人肺成纖維細(xì)胞TIMP-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

TGF-β1濃度3、5、10、15 μg/L作用于人肺成纖維細(xì)胞24 h后，TIMP-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于0 μg/L(P<0.05)；TGF-β1濃度1μg/L作用于人肺成纖維細(xì)胞24 h后，TIMP-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量與0 μg/L相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1，圖2，圖3。

表1 不同濃度TGF-β1對(duì)人肺成纖維細(xì)胞TIMP-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與TGF-β1濃度0 μg/L比較，aP<0.05(n=6)

圖2 不同濃度TGF-β1對(duì)人肺成纖維細(xì)胞TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響(n=6)注：1～6分別為T(mén)GF-β1濃度0、1、3、5、10、15 μg/L

圖3 不同濃度TGF-β1對(duì)人肺成纖維細(xì)胞TIMP-1蛋白表達(dá)的影響(n=6)注：1～6分別為T(mén)GF-β1濃度0、1、3、5、10、15 μg/L

2.3 TGF-β1不同作用時(shí)間對(duì)人肺成纖維細(xì)胞TIMP-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

使用10 μg/L TGF-β1作用24、48 h時(shí)，TIMP-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于作用0 h時(shí)(P<0.05)；使用10 μg/L TGF-β1作用12 h時(shí)TIMP-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量與作用0 h時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2，圖4。

表2 TGF-β1不同作用時(shí)間對(duì)人肺成纖維細(xì)胞TIMP-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與TGF-β1作用0 h比較，aP<0.05(n=6)

圖4 TGF-β1不同作用時(shí)間對(duì)人肺成纖維細(xì)胞TIMP-1蛋白表達(dá)的影響(n=6)注：1～4分別為10 μg/L TGF-β1作用0、12、24、48 h

2.4 Smad3過(guò)表達(dá)對(duì)人肺成纖維細(xì)胞TIMP-1、P300 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

Smad3真核過(guò)表達(dá)載體組TIMP-1、P300 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組(P<0.05)；空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組TIMP-1、P300 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3，圖5。

表3 TIMP-1表達(dá)對(duì)人肺成纖維細(xì)胞Smad3、P300 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，aP<0.05；與空白對(duì)照組比較，bP<0.05(n=6)

圖5 各組人肺成纖維細(xì)胞TIMP-1、P300蛋白表達(dá)水平(n=6)注：1 Smad3真核過(guò)表達(dá)載體組；2空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；3空白對(duì)照組

3 討 論

研究者發(fā)現(xiàn)，MMPs與肺間質(zhì)纖維明顯相關(guān)[9]。基礎(chǔ)研究顯示，大鼠矽肺模型中早期MMP-9、MMP-13、TIMP-1等表達(dá)明顯提升，晚期僅存在TIMP-1表達(dá)升高[10]。TIMPs是MMPS的特異性抑制因子，可降低基質(zhì)溶解活性，引發(fā)膠原沉積，導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生[11]；但在結(jié)締組織病種的研究較少。本研究中，TIMP-1表達(dá)于肺組織間質(zhì)，結(jié)締組織病相關(guān)肺間質(zhì)病變肺組織中TIMP-1表達(dá)水平明顯高于正常肺組織。提示TIMP-1表達(dá)與結(jié)締組織病相關(guān)肺間質(zhì)病變相關(guān)，有可能成為治療的潛在靶點(diǎn)，下調(diào)TIMP-1表達(dá)可能抑制結(jié)締組織病相關(guān)肺間質(zhì)病變。

TGF-β是膠原合成最有效的促進(jìn)劑，可有效促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與沉積，在成纖維細(xì)胞增殖中也發(fā)揮重要調(diào)控作用[12]。相關(guān)研究顯示，以纖維化病變?yōu)橹鞯慕Y(jié)締組織病相關(guān)肺間質(zhì)病變患者外周血單核細(xì)胞中TGF-β mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯升高[13]；TGF-β1是TGF-β中活性最強(qiáng)、所占比例最高的亞型[14]；為探究TGF-β1與TIMP-1表達(dá)的關(guān)系，本研究在體外原代培養(yǎng)人肺成纖維細(xì)胞，使用不同濃度的TGF-β1進(jìn)行刺激，通過(guò)RT-PCR和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中TIMP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，隨著TGF-β1濃度增加，人肺成纖維細(xì)胞中TIMP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯升高；進(jìn)一步分析TGF-β1作用不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞中TIMP-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響顯示，隨著TGF-β1作用時(shí)間的延長(zhǎng)，人肺成纖維細(xì)胞中TIMP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯升高。上述結(jié)果表明，TGF-β1可上調(diào)TIMP-1表達(dá)，是TIMP-1的正向調(diào)節(jié)劑，能夠促進(jìn)結(jié)締組織病相關(guān)肺間質(zhì)病變的發(fā)生與發(fā)展。

相關(guān)研究顯示，TGF-β1/Smad3信號(hào)通路在肺纖維化進(jìn)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用[15]，其中Smad3復(fù)合物與SBE序列結(jié)合、Smad3活化與聚集均于雙重效應(yīng)的P300有關(guān)[16]。在肺成纖維細(xì)胞中加入TGF-β1刺激后Smad3、P300表達(dá)水平明顯提升，Smad3與P300的結(jié)合也明顯增加，TGF-β1/Smad3信號(hào)通路被激活，促進(jìn)肺纖維化的發(fā)展[17]。本研究中Smad3真核過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后人肺成纖維細(xì)胞高表達(dá)P300，提示TGF-β1/Smad3信號(hào)通路被激活；且TGF-β1/Smad3真核過(guò)表達(dá)載體組TIMP-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組，提示TIMP-1可能通過(guò)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路參與結(jié)締組織病相關(guān)肺間質(zhì)病變的發(fā)生與發(fā)展。