王德立，齊耀東

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 海南分所，海南 海口 570311；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

蛇足石杉Huperziaserrata(Thunb.ex Murray)Trevs，又名千層塔，隸屬石杉科石杉屬，為一種擬蕨類植物，多年生草本，高20～30 cm，生長于潮濕、富含腐殖質(zhì)的林下。在我國主要分布在長江以南各省，尤以江西、安徽、湖南、重慶等地較多。該植物為我國一種傳統(tǒng)中藥材，以莖葉入藥，常用于治療瘀血腫痛、挫傷等[1]。現(xiàn)代研究表明，蛇足石杉植物體含石杉堿甲，對治療早老性癡呆效果較好，且毒副作用最小[2]。該物種也因此引起全世界人們的關(guān)注，對其原料需求量劇增。但該植物生長較為緩慢，年生長高度2～3 cm[3]，大量無序采集造成資源儲量迅速減少，野生資源分布范圍迅速萎縮，加上環(huán)境不斷變化，尤其是干旱氣候影響，導(dǎo)致部分地區(qū)的蛇足石杉儲量銳減甚至絕跡。

當(dāng)前蛇足石杉資源儲量遠(yuǎn)不能滿足市場需求，要解決原料短缺問題最為有效的措施是開展規(guī)?；N植，而目前迅速擴(kuò)繁技術(shù)尚未成熟，致使規(guī)?；a(chǎn)難以實施。蛇足石杉的主要繁殖方式為孢子繁殖和芽胞繁殖[4]。盡管由芽胞萌發(fā)生長至成熟孢子體的周期較短，但芽胞數(shù)量較少，不足以實施產(chǎn)業(yè)化。孢子繁殖是實施產(chǎn)業(yè)化的潛在方式，成株可每年產(chǎn)生幾個至幾十個孢子囊，每個孢子囊內(nèi)含上萬個孢子。但在人工可控環(huán)境中如何促進(jìn)大量孢子快速萌發(fā)是當(dāng)前亟待解決的難題。在野外，成熟的孢子散落在富含腐殖質(zhì)、潮濕的土壤中，于適宜條件下萌發(fā)，經(jīng)過配子體世代形成孢子體。而在人工控制條件下孢子卻難以萌發(fā)，調(diào)查發(fā)現(xiàn)孢子休眠時間較長，幾年甚至十幾年，但休眠原因及打破休眠的方法尚不清楚。野生環(huán)境中可能存在促進(jìn)孢子萌發(fā)的微生物和多種酶類。土壤中的酶類主要有：過氧化氫酶、多酚氧化酶、腺酶、蛋白酶、磷酸酶、脫氫酶和蔗糖酶等[5-6]，這些酶是土壤生化過程中重要參與者，在物質(zhì)和能量交換過程中起重要作用[7]。

蛇足石杉適宜生長在多年生林地土壤中，土壤含有豐富的酶類，這些酶可能對蛇足石杉的孢子萌發(fā)和植株生長起到直接或間接的促進(jìn)作用。蛇足石杉內(nèi)生菌以及微生物促進(jìn)孢子萌發(fā)已有研究[8-9]，目前尚未找到能夠促進(jìn)孢子萌發(fā)的關(guān)鍵微生物，也未見關(guān)于土壤酶對蛇足石杉孢子萌發(fā)影響的報道。本研究擬通過分析以孢子繁殖為代表的重慶市黃水鎮(zhèn)蛇足石杉天然居群及以芽胞繁殖為代表的海南昌江霸王嶺自然保護(hù)區(qū)蛇足石杉天然居群的土壤酶活性差異，找出可能促進(jìn)孢子萌發(fā)和植物生長的土壤酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 采樣位置 土壤材料采集地點為重慶石柱縣黃水鎮(zhèn)，海拔1300 m左右，地理坐標(biāo)：N27°29′，E108°39′；海南省霸王嶺自然保護(hù)區(qū)石峰，海拔1300 m左右，地理坐標(biāo)：N18°50′，E109°05′。

1.1.2 樣地類型及采樣方法

1.1.2.1 重慶黃水鎮(zhèn)樣地(CQ) 該樣地蛇足石杉居群主要分布在生長10年以上的柳杉林下，居群大小視柳杉林地面積而定。分別采集生長5年、10年和15年的柳杉林內(nèi)地表20 cm的土壤，其中10年和15年柳杉林地有蛇足石杉分布，10年林地內(nèi)僅有幼苗和幼株，15年林地既有成株又有幼苗和幼株。每個居群采集6份土樣，每份土樣按X取樣法采集5份土樣混合而成。

1.1.2.2 海南霸王嶺樣地(HN) 該樣地包括東五樣地和東二樣地，其中東五樣地海拔1300 m左右，有蛇足石杉分布，居群面積約1200，該居群繁殖方式以芽胞繁殖為主，80%的幼苗來自芽胞，95%以上的成株均產(chǎn)生芽胞；東二樣地?zé)o蛇足石杉部分，海拔800 m左右。兩樣地均采用S取樣法在該居群中采集距地表20 cm左右的土壤。每個樣地、每種林地類型分別采集土樣6份。

1.2 測定方法

采用酶聯(lián)免疫法測定蛋白酶(活性單位為U·L-1)、過氧化氫酶(活性單位為IU·L-1)、多酚氧化酶(活性單位IU·L-1)、脲酶(活性單位IU·L-1)、蔗糖酶(活性單位U·L-1)、磷酸酶(活性單位為U·L-1)、纖維素酶(活性單位U·L-1)。

經(jīng)測定標(biāo)準(zhǔn)溶液，得出7種酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：蛋白酶：Y=25.113 4X+0.178 3(r=0.998 4)；過氧化氫酶：Y=69.787X+3.454 9(r=0.998 3)；多酚氧化酶：Y=207.234 7X+8.858 2(r=0.998 3)；脲酶：Y=503.927 9X+8.234 5(r=0.998 3)；蔗糖酶：Y=425.528 8X+15.066 0(r=0.998 7)；磷酸酶：Y=413.770 9X+1.375 8(r=0.998 5)；纖維素酶：Y=82.528 5X+2.24(r=0.998 7)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPSS17.0進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩個蛇足石杉居群的土壤酶活性比較

土壤酶活性比較見表1。蛋白酶活性、過氧化氫酶活性和多酚氧化酶活性：重慶15年林地>海南東五樣地；脲酶活性和蔗糖酶活性：重慶15年林地<海南東五樣地；纖維素酶活性、磷酸酶活性：兩樣地?zé)o顯著性差異。

表1 兩個蛇足石杉居群土壤酶活性比較

注：不同字母表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；下同。

2.2 重慶不同株齡林地土壤酶活性比較

重慶黃水鎮(zhèn)不同株齡的柳杉林中土壤酶活性比較見表2。15年株齡的柳杉林地蛋白酶活性、過氧化氫酶活性及磷酸酶活性較高；5年和10年株齡柳杉林地多酚氧化酶、脲酶、蔗糖酶活性較高；5年株齡林地活性較低的土壤酶有蛋白酶、過氧化氫酶、磷酸酶。

2.3 海南霸王嶺兩樣地土壤酶活性比較

海南霸王嶺樣?xùn)|五樣地和東二樣地土壤酶活性結(jié)果見表3。東二樣地蛋白酶活性、蔗糖酶活性、纖維素酶活性及磷酸酶活性均高于東五樣地，而過氧化氫酶、多酚氧化酶、脲酶等酶活性無顯著差異。

3 討論

土壤酶包括胞內(nèi)酶和胞外酶，主要來源于土壤微生物、植物根系分泌物和動植物殘體，是生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動等生態(tài)過程中最為活躍的生物活性物質(zhì)[7，10-11]。土壤酶種類和活性反映了土壤肥力狀況，影響根系對養(yǎng)分、水分的吸收，從而影響植物生長發(fā)育[12]。目前尚未實現(xiàn)蛇足石杉規(guī)?；N植，僅有小面積栽培，且種苗全部來自于野生，因此原生境對孢子萌發(fā)極其重要，原生境中的土壤酶可能對孢子萌發(fā)有促進(jìn)作用，也會影響蛇足石杉生長發(fā)育。

表2 重慶黃水鎮(zhèn)不同株齡柳杉林地土壤酶活性

注：不同字母表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 海南霸王嶺東五樣地和東二樣地土壤酶活性

重慶黃水鎮(zhèn)15年柳杉林樣地和海南霸王嶺樣地均有蛇足石杉成株和大量幼苗，前者以孢子幼苗為主，后者以芽胞幼苗[4](芽胞為蛇足石杉無性繁殖體，從母株脫落后直接萌發(fā)成幼苗)為主。這表明重慶15年林地環(huán)境更適宜孢子繁育與植株生長。從兩個樣地的土壤酶活性來看(表1)，蛋白酶活性、過氧化氫酶活性和多酚氧化酶活性：重慶15年林地樣地>海南東五樣地，這表明這3種酶可能更有利于孢子萌發(fā)和植株生長。其中蛋白酶可促進(jìn)孢子壁的溶解和相關(guān)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化，以打破孢子休眠，促進(jìn)孢子萌發(fā)；過氧化氫酶可有效保護(hù)孢子內(nèi)原生質(zhì)體中的多種物質(zhì)，避免被氧化而失去活性；多酚氧化酶活性可有效避免在孢子萌發(fā)過程中受到病菌或其他有害物質(zhì)的侵害，因此較高的多酚氧化酶活性更有利于孢子萌發(fā)。而海南東五樣地由于土壤蛋白酶、過氧化氫酶和多酚氧化酶活性偏低，可能缺少孢子萌發(fā)的必要條件，因此孢子幼苗極少，而芽胞幼苗較多。脲酶、蔗糖酶、磷酸酶均分解土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)，其活力大小均反應(yīng)了土壤肥力水平，這些酶活力高低直接影響植物長勢。這3種酶活性：海南東五顯著高于重慶15年林地樣地，這也進(jìn)一步驗證了海南蛇足石杉生長速率高于重慶樣地的現(xiàn)象[3]。兩樣地的纖維素酶活性差異不顯著，這可能與兩樣地均為多年生次生林，地表均積累了豐富的枯枝、落葉有關(guān)。

由表2知重慶樣地不同生長年限的柳杉林土壤酶活性差異明顯。蛋白酶活性：15年>10年>5年，這說明隨著喬木生長年限增加，蛋白酶活性不斷增強(qiáng)，而5年林地沒有蛇足石杉分布，10年林地偶爾有分布，15年林地有大量分布，由此推測蛋白酶可能影響蛇足石杉孢子萌發(fā)。過氧化氫酶活性：15年=10年>5年，即10年之后林地土壤過氧化氫酶活性變化不大，該酶也可能對孢子萌發(fā)起促進(jìn)作用。多酚氧化酶在不同年限林地間無規(guī)律的變化趨勢，而脲酶、蔗糖酶的纖維素酶的活性5年株齡林地最高，15年株齡林地較低，這說明林地早期階段為待分解的營養(yǎng)較多，也是物質(zhì)快速轉(zhuǎn)化階段。磷酸酶活性隨著林地年限的增加呈增強(qiáng)趨勢，這表明土壤中可被直接吸收的磷元素減少，磷酸酶活性增加可將土壤中難溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷，為植物提供可直接吸收的磷元素。

海南蛇足石杉居群的主要繁殖方式為芽胞繁殖，該繁殖方式與孢子繁殖不同，不需要經(jīng)過孢子萌發(fā)形成配子體即沒有配子體世代。該樣地有蛇足石杉分布的居群土壤蛋白酶、蔗糖酶、纖維素酶和磷酸酶均低于無蛇足石杉分布的居群，過氧化氫酶、多酚氧化酶及脲酶差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。這種差異可能源自環(huán)境溫度不同，有蛇足石杉的樣地海拔1300 m左右，而無蛇足石杉的樣地海拔800 m左右。由此可以看出溫度對蛇足石杉的芽胞萌發(fā)和植株生長影響較大，雖然養(yǎng)分條件較好，但較高的溫度也不適宜蛇足石杉生長，這與蛇足石杉喜溫涼、耐嚴(yán)寒、怕高溫的生物學(xué)特性有關(guān)。

由此推測，蛇足石杉孢子萌發(fā)及植株生長可能與多種土壤酶活性息息相關(guān)。蛋白酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶可能對孢子萌發(fā)有重要影響，脲酶、蔗糖酶、纖維素酶和磷酸酶可能和植株生長有關(guān)。因此在孢子培養(yǎng)過程中可適當(dāng)加入相應(yīng)的酶以促進(jìn)孢子萌發(fā)和幼苗生長。